Summary
Denne protokollen beskriver en detaljert prosedyre for blanding og dyrking menneskelige stilk cellen avledet neurons som tidligere var differensiert fra neural forfedre in vitro for flere uker. Prosedyren forenkler Imaging-baserte analyser av neurites, synapser, og sen-uttrykker neuronal markører i et format som er kompatibelt med lys mikroskopi og høyt innhold screening.
Abstract
Neurons differensiert i to-dimensjonal kultur fra menneskelige pluripotent stilk-cellen-avledet nevrale stamceller (NPCer) representerer en kraftig modell system for å utforske sykdoms mekanismer og utføre høyt innhold screening (HCS) å forhøre sammensatte biblioteker eller identifisere genmutasjon fenotyper. Men med menneskelige celler overgangen fra NPC til funksjonell, krever eldre Nevron flere uker. Synapser vanligvis begynner å danne etter 3 uker med differensiering i monolag kultur, og flere Nevron-spesifikke proteiner, for eksempel senere uttrykker Pan-neuronal markør NeuN, eller laget 5/6 cerebral kortikale Nevron markør CTIP2, begynner å uttrykke rundt 4-5 uker etter differensiering. Denne lange differensiering tid kan være uforenlig med optimal kultur forhold som brukes for små volum, multi-brønn HCS plattformer. Blant de mange utfordringene er behovet for godt overholdt, jevnt fordelt celler med minimal celle Clustering, og kultur prosedyrer som fremmer langsiktig levedyktighet og funksjonell synapse modning. En tilnærming er å skille neurons i et stort volum format, så replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønner. Noen viktige utfordringer når du bruker denne replating tilnærmingen bekymring reproduserbarhet og celle levedyktighet, på grunn av stressende avbrudd i dendrittiske og axonal nettverk. Her viser vi en detaljert og pålitelig prosedyre for enzymatisk blanding humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons etter deres differensiering for 4-8 uker i et stort volum format, overføre dem til 384-vel mikrotiterbrønnene plater, og dyrking dem for ytterligere 1-3 uker med utmerket celle overlevelse. Denne replating av menneskelige neurons ikke bare tillater studiet av synapse montering og modning innen to uker fra replating, men også muliggjør studier av neurite regenerering og vekst membran egenskaper. Vi gir eksempler på skalerbare analyser for neuritogenesis og synaptogenesis ved bruk av en 384-brønn plattform.
Introduction
Human pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons blir stadig mer relevant i de områdene av grunnleggende forskning, narkotika utvikling, og regenererende medisin. Arbeidsflyter og prosedyrer for å optimalisere deres kultur og vedlikehold, og forbedre effektiviteten av differensiering i bestemte neuronal under typer, utvikler seg raskt1,2. For å forbedre nytte og kostnadseffektivitet av menneskelig stilk cellen-avledet neurons som modellsystemer mottagelig for høyt innhold analyser i legemiddel funnet og mål validering, er det nyttig å redusere dyrking tiden som kreves for å generere modne, funksjonelle og samtidig beholde maksimal robusthet, reproduserbarhet og fenotype relevans. Selv om 3-dimensjonale organoid kulturer kjører gjennombrudd i neurodevelopment forskning3, 2-dimensjonale monolag kulturer er spesielt kompatible med automatiserte Imaging-baserte applikasjoner på grunn av deres minimale vev tykkelse.
Men tilpasningen av Imaging-baserte screening metoder til modeller av menneskelig nevrologisk og neurodevelopmental sykdom står overfor en stor utfordring. Den langvarige tidsrammen over hvor det menneskelige nervesystemet modnes i vivo nødvendiggjør utvidet tid i kulturen for å imøtekomme naturlige programmer av genuttrykk og oppnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens av den langvarige neuronal differensiering programmet er at vedlikehold av hiPSC-avledet monolag kulturer må opprettholdes i mange uker for å oppnå tilstrekkelig synapse modenhet. I løpet av denne tiden, nevrale forfedre som forblir udifferensierte fortsette å dele. Disse kan raskt overgrow kulturen og tilrive næringsinnholdet som kreves for å opprettholde levedyktige postmitotic neurons. Kraftig dele nevrale stamceller (NPCer) kan også konkurrere med neurons for vekst underlaget. Dette kan gjøre slike kulturer utsatt for problemer med dårlig vedheft, en tilstand uegnet for Imaging-baserte analyser. Videre mange etterforskere finner at jo mindre kulturen volum, jo større vanskeligheter med å opprettholde sunne populasjoner av differensiert neurons lenge nok til å observere den sene stadier av neuronal differensiering. Med andre ord kan analyser av synapse modning ved hjelp av høyt innhold screening (HCS) tilnærminger være svært utfordrende for menneskeskapte neurons.
For å omgå noen av disse problemene, en prosedyre for blanding og replating tidligere differensiert hiPSC-avledet neurons har blitt brukt. For det første tillater det studiet av neurite utvekst (eller, mer presist, neurite regenerering) i en populasjon av fullt engasjerte neurons. For det andre, replating av tidligere differensiert neurons fra et stort volum format (som 10 cm plater eller større), ned til små volum formater (som HCS-kompatible 96-eller 384-vel mikrotiterbrønnene plater) gir en betydelig reduksjon i total dyrking tid i den lille volum tilstanden. Dette forenkler studiet av synapse forsamling og modning over påfølgende uker in vitro.
Men replating av modne neurons som allerede har etablert lange neurites og en kompleks tilkobling nettverk presenterer flere utfordringer, hvorav den ene er noen ganger høy og variabel hastighet på celle død. Her beskriver vi en replating prosedyre som resulterer i utmerket celle overlevelse og reproduserbarhet. Vanligvis er neurons eksponert for proteolytiske enzymer for korte inkubasjons perioder (vanligvis ~ 3-10 min) for å løsne celler fra underlaget før trituration. Denne korte proteinolyse tiden brukes vanligvis for blanding og passaging mange typer dele celler, inkludert ikke-neuronal celler og udifferensierte forfedre4,5,6. Men for differensiert neurons bærende lange, sammenkoblede neurites, er det viktig ikke bare å løsne celler fra underlaget, men også for å forstyrre dendrittiske og axonal nettverk for å isolere enkelte celler samtidig minimere skade. Faktisk, en tykk meshwork av neurons vanligvis en tendens til å løsne fra underlaget som et enkelt ark, snarere enn som individuelle celler. Hvis omsorg ikke er tatt for å løsne den tykke nettverk av neurites, neurons ikke bare bli irreversibelt skadet under trituration, men mange av dem ikke klarer å passere gjennom filteret som brukes til å fjerne klumper, noe som resulterer i dårlig celle yield. Nedenfor beskriver vi en enkel modifikasjon til en mye brukt protease inkubasjons prosedyre for å motvirke disse vanskelighetene.
I protokollen beskrevet nedenfor, neurons er inkubert for 40-45 min med en mild protease, slik som proteolytiske enzym (f. eks, Accutase). I løpet av de første 5-10 min etter å ha lagt enzymet, neuronal nettverket heiser ut fra underlaget som et ark. Inkubasjons med protease provenyet for ytterligere 30-40 min før du fortsetter med skånsom trituration og filtrering. Denne ekstra inkubasjonstiden bidrar til å sikre at fordøyelsen av materialet slapper av intercellulære nettverket, og dermed sikre at påfølgende trituration produserer en suspensjon av individuelle celler. Denne prosedyren maksimerer ensartethet av celle distribusjon ved replating mens minimere celle død. Vi har med hell brukt denne replating metoden til hiPSC-avledet neuronal kulturer generert av ulike differensiering protokoller7,8 og fra ulike linjer av hiPSCs. Prosedyren er nominelt egnet for bruk med de fleste eller alle linjer med stilk cellen-avledet neurons. Vi har observert at en utvidet protease inkubasjonstid ikke er helt nødvendig for replating kulturer fra små format plater (f. eks, 35 mm diameter); men som vi viser her, gir det en betydelig fordel når replating fra stor diameter plater (f. eks, 10 cm diameter eller større), sannsynligvis fordi neurites i slike plater kan forlenge svært lange prosesser og danner et tett sammenvevd array.
Her demonstrerer vi denne metoden og illustrerer kort dens anvendelse i analyser for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som innebærer gruppering av pre-og postsynaptic proteiner langs dendrites og axons, etterfulgt av deres senere colocalization på Synaptic nettsteder. Eksemplene fremhever fordelene denne protokollen tilbyr for å bevare celle levedyktighet og reproduserbarhet. For det første tillater etterforskerne å studere tidlige skritt i menneskets neuritogenesis. Det eksperimentelle innfatning er analog med det vanligvis anvendt primære kulturen av gnager kortikale eller hippocampus neurons, der hvor celler er utdraget fra sen Foster eller tidlig postnatal hjerne, dissosiert av trituration etter mild protease handling, og innrømmet å initiere neurites eller regenerere neurites som var kuttet i prosedyren9,10. I likhet med slike gnager primære neurons, hiPSC-avledet neurons begynner å danne eller regenerere sine neurites innen timer etter replating, slik at bildebehandling av vekst kjegler og neurite morfologi i et miljø optimal for høy spatiotemporal Imaging med færre omkringliggende udifferensierte celler. Vi har observert at neurite utvekst er mer synkronisert i forhold til variable forsinkelser og ulike utvekst rater sett når neurons første begynner å skille fra en stamfar befolkning. I tillegg replating muliggjør analyser av neurons uttrykke neuronal under type markører som vanligvis vises senere i neural utvikling, for eksempel kortikale lag 5/6 transkripsjon faktor CTIP2 (Chicken ovalbumin oppstrøms promoter transkripsjon faktor-samspill protein 2), eller Pan-neuronal markør NeuN11. En særlig nyttig ansiktstrekk av det replating adgang er det alt synaptogenesis utbytte innen en tid rammen forenlig med HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differensiering periode før Replating
- Differensiere neurons på 10 cm retter, ved hjelp av en protokoll av valget7,8 til neurons har dannet et tykt nettverk med sine prosesser og uttrykker ikke bare tidlig neuronal markører som MAP2 eller TuJ1, men også sene markører som NeuN.
-
Endre halvparten av valget hver 4 dager i løpet av neuronal differensiering prosessen.
Merk: mer omfattende eller hyppige medium endringer fortynne essensielle trofiske faktorer, og kan unåde modning.- For de iPSC-avledede WT126 neurons, bruk følgende dyrking medier: 5 mL 100 a/s-tillegg, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL laminin, 200 μM askorbinsyre, 1 μM dibutyryl-cAMP og 10 mL SM1 for 500 mL Dulbecco modifiserte Eagle ' s medium/ næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12). Gradvis, ved hjelp av halv-Media endringer, erstatte med neural basal medium (tabell av materialer) og samme kosttilskudd.
- For iPSC-avledet CVB WT neurons, bruk følgende dyrking medium for etter differensiering: 500 mL nevrale basal medium (tabell over materialer) og 500 ml DMEM/F12 medium med 2 μg/ml laminin, 10 ml glutamin supplement (tabell av materialer), 0,75 mg/mL natrium bikarbonat, 5 mL minimum essensiell medium (MEM) som er unødvendige, 0,2 mM askorbinsyre, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 og 10 mL 100 mm tillegg.
2. coating Multiwells
- Dagen før replating, frakk med Poly-L-Ornithine (PLO). Løs opp PLO i sterilt vann for å lage en lagerløsning (10 mg/mL). Store dette lager ved-20 ° c. Fortynne PLO 1:100 i vann for å gi en konsentrasjon på 50 μg/mL ved belegg glass og 1:1000 ratio (10 μg/mL) ved plast belegg.
- Påfør belegget direkte på mål platene. Bruk volum belegget som passer til plate størrelsen (dvs. for en 24-brønn plate gjelder 500 μL av PLO-løsning per brønn).
- Tillat plater å sitte i mørket over natten ved romtemperatur.
- Hent belagte plater på replating dagen og Overfør til et sterilt biosafety skap.
- Aspirer PLO-løsningen og skyll to ganger med sterilt vann.
- Fortynne laminin (1,15 mg/mL) i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 1:400 fortynning.
Merk: Tin laminin ved 4 ° c og Legg raskt til PBS for å unngå aggregering av laminin og ujevnt belegg. - Aspirer sterilt vann og påfør 500 μL av laminin belegg på brønner som tidligere var belagt med PLO.
- Plasser platene i et 37 ° c inkubator for minimum 4-6 h. Bruk lengre incubations, opptil 16 timer, for glassoverflater. Bruk konsekvente inkubasjons tider.
3. Replating differensiert neurons
- Skyll plate av differensiert neurons med PBS gang forsiktig. Spre PBS forsiktig ned veggen av platen, og ikke direkte på cellene, for å unngå å forstyrre dem.
- Forsiktig aspirer PBS, være forsiktig med å unngå å berøre cellene direkte, men å aspirer fra kanten av fatet mens tipper det mot forskeren.
- Påfør minimum 1 mL av proteolytiske enzym (tabell av materialer) per 10 cm plate og returner celler til inkubator. Legg litt høyere volumer Hvis vevet kulturen rommet viser en høy fordampning hastighet på grunn av lav luftfuktighet.
- Ruge celler med proteolytiske enzym for 40-45 min for å løsne dem fra platen og å løsne dem fra andre neurons innenfor neuronal nettverket.
Merk: Timing på dette trinnet er kritisk. Å slukke protease for tidlig kan føre til økt celle død etter replating. Proteolytiske enzym produsent anbefaler at temperaturene mye lavere enn 37 ° c brukes med lengre inkubasjons perioder for passaging cellelinjer (f.eks. over natten ved 4 ° c). Imidlertid bør håndtering neurons ved 4 ° c unngås, som de ofte viser dårlig overlevelse etter kald eksponering. Produsenten sier også at en 60 min inkubasjons med enzymet ved 37 ° c fører til enzymatisk inaktive. I forfatterens erfaring er imidlertid en 40-45 min inkubasjons av hiPSC-avledede neuronal kulturer på 37 ° c tilstrekkelig for effektiv dissosiasjon og utmerket neuronal overlevelse ved replating. - Sjekk neurons på en fase-kontrast mikroskop under inkubasjonstid og la protease behandling for å fortsette inntil nevrale nettverk helt løsner fra platen og begynner å bryte fra hverandre i mindre ark på kort rister platen under Mikroskop.
- Slukke det protease aktivitet benytter 5 mL av frisk DMEM Media per 1 mL av protease inne det 10 cm plate å opphøre fordøyelsen. Forsiktig triturate celler mot plate 5-8 ganger for å forstyrre nettverket, ved hjelp av serologisk pipetter. Vær forsiktig så du ikke bruke for mye press når triturating, som differensiert neurons er skjøre. Ikke bruk en P1000 spissen, som slutten er for skarp og smal, og dermed kan ren eller skade neurons.
- Påfør løsning med celler gjennom en celle sil med 100 μm diameter mesh inn i en frisk 50 mL konisk rør dråpe for dråpe.
- Skyll sil med ytterligere 5 mL ferske DMEM-medier, etter at cellene har filtrert gjennom.
- Spin celler i stasjonære sentrifuge ved 1 000 x g i 5 min.
- Returner konisk rør til biosafety skap og aspirer det meste av Media, og etterlater rundt 250 μL for å sikre at cellene beholder fuktigheten.
- Resuspend cellene forsiktig i 2 mL friskt DMEM-medium. Ikke Pipetter pellet mot siden av røret. I stedet, forsiktig invertere koniske 2-3 ganger og passerer celler gjennom slutten av en 5 mL serologisk Pipet å løsne dem.
- Påfør 10 μL av resuspendert neurons på kanten av en hemocytometer.
- Tilsett 8-10 μL av trypan blå til dråpe celler for å vurdere celle levedyktighet i løpet av dette blanding trinnet. Påfør 10 μL av denne blandingen til hemocytometer eller andre automatiske celle tellere. Vurdere som levedyktig de cellene som er fase lyse og utelukke trypan blå farge.
- Bestem mengden av levedyktige celler/mL, og forberede seg til å fortynne innholdet i konisk rør i henhold til ønsket celle tetthet.
- Plate ~ 10 000 celler per brønn for en 384-brønn plate; plate ~ 150000-200000 celler per brønn for en 24-brønn plate.
- Legg til frisk DMEM til konisk rør av resuspendert celler for å oppnå riktig fortynning og legge til ekstra passende kosttilskudd som B27 og/eller BDNF, avhengig av kravene i den spesifikke cellelinjen.
- Vipp konisk rør forsiktig for å blande 2-3 ganger.
- Aspirer laminin belegg fra 24-brønn plate, eller fra 384-brønn multiwell plate ved hjelp av en 16-kanals Pipet og skyll en gang med PBS.
- Aspirer PBS bruker en P1000 for 24-brønn plate, eller 16-kanals pipette for 384-brønn plater.
- Påfør celle løsning til hver brønn i en figur åtte bevegelse for å unngå klumper. Enhetlig ensartethet kan også optimaliseres ved hjelp av automatiserte væske håndteringsenheter.
Merk: Tillegg av laminin til mediene starter 2-4 dager post-replating også bidrar til å opprettholde en homogen fordeling av cellene. - Gjenta trinn 3,19 og 3,20 for hver brønn.
- Returner platen til inkubator satt til 37 ° c og 5% CO2.
- Etter 2 dager, begynner å endre halvparten av medium hver 4 dager ved hjelp av post-differensiering dyrking medier beskrevet i § 1,2. Etter ønsket modningstid, fikse kulturer med 3,7% formaldehyd ved 37 ° c og beis celler i henhold til de eksperimentelle kravene.
4. Cell levedyktighet analyser post-replating
- Tilsett tidlig celle døds reporter (VivaFix: 0,5 μL av 50 μL lagerløsning per 500 μL kultur Media per brønn) etter en kort virvlingen av lager løsningen.
- Image levende og døde celler kultivert på glass-Bottom multiwells, etter 20 min, uten vask trinn, siden fargestoff fluoresces bare en gang inne i cellene, eller fikse og co-flekken med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og/eller andre antistoffer før Imaging ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop.
5. Immunostaining
- Fix kulturer med 3,7% formaldehyd i PBS pluss 120 mM sukrose for 20 min ved 37 ° c.
- Skyll og permeabilize med 0,2% Triton X-100 i 5 min ved romtemperatur, og deretter blokkere for 30 min med 2% storfe serum albumin (BSA).
- Aspirer BSA uten skylling og ruge for 1 time ved romtemperatur med kanin anti-MAP2 antistoff 1:1000, mus anti-β3 tubulin (TuJ1) antistoff 1:2000, kylling anti-NeuN antistoff (1:100) og rotte anti-CTIP2 antistoff (1:500), eller med mus anti-PSD95 ( 1:200), kanin anti-synapsin 1 (1:200) og kylling anti-MAP2 antistoff for Synaptic farging.
- Skyll med PBS, og ruge med Alexa fluor-bøyd sekundære antistoffer pluss DAPI for 45 min ved 37 ° c.
- Til slutt, vask to ganger med PBS før bildebehandling.
6. kalsium bildebehandling
- Infisere kulturperler celler med AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (det Salk Institutt for biologiske studier, GT3 Core Facility) på 10 dager etter replating og bilde for å vurdere spontan kalsium transienter på 3-4 uker post-replating.
7. image oppkjøp og analyse
Merk: For detaljer om oppkjøpet systemet henvises til Calabrese et al.12.
- Bruk en bilde modul for manuell eller automatisert bildeinnhenting, og en bildeanalyse programvare modul, for eksempel CellProfiler13, for morphometric-målinger.
- Beregn gjennomsnittlig lengde på TuJ1 positive neurites og MAP2 positive dendrites ved å måle total lengde per synsfelt delt på antall neurons (DAPI + MAP2 eller TuJ1 positive celler) i samme felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replating av hiPSCs-avledede neurons som har vært differensiert i flere uker tilbyr flere fordeler. Men frakobling og replating differensiert neurons som har lange, sammenhengende dendrites og axons (figur 1A) kan resultere i en høy brøkdel av irreversibelt skadet neurons.
Som beskrevet i protokollen delen, brukte vi inkubasjons med et proteolytiske enzym for å løsne neurons fra underlaget. Vanligvis, på grunn av deres tykke meshwork av neurites (figur 1A), cellene har en tendens til å løsne alt på en gang som et enkelt syncytial lag, som ofte begynner å flyte i brønnen (figur 1C). Dette skjer ganske raskt, og er kanskje grunnen til de fleste laboratorier har en tendens til å samle cellene etter bare 5 min av inkubasjons med sine proteolytiske enzym av valget, og å umiddelbart bryte fra hverandre arket av celler ved trituration (pipettering den opp og ned). Imidlertid synes denne mekaniske manipulasjon å resultere i høy belastning for neurons. Vi tror graden av stress kan være proporsjonal med området som dekkes av neuronal nettverket, fordi vi finner at den åpenbare skaden fra utilstrekkelig protease inkubasjons er større for 10 cm eller større plater enn for 35 mm eller mindre plater. Dermed counterintuitively, fant vi at forlenge enzymatisk inkubasjons til 40-45 min reduserer celle død på tidspunktet for celle dissosiasjon (figur 1C) og tillater mer effektiv gjenvinning av levende, sunne celler som avgir prosesser over timer til dager etter replating (figur 1B). Antagelig, den utvidede inkubasjonstid med et mildt proteolytiske enzym tillater delvis fordøyelse av proteiner som sterkt overholder celler og deres prosesser til hverandre og til ekstracellulære matrise. Dette gjør at blanding prosessen å arbeide effektivt for å skille enkeltceller uten behov for altfor energisk trituration.
For å kvantifisere effektiviteten av den utvidede enzym inkubasjons prosedyren, evaluerte vi levedyktigheten til suspenderte celler umiddelbart etter trituration ved hjelp av trypan blå (figur 1C), og senere på 1, 3 og 7 dager etter replating ved hjelp av en tidlig celle død markør (figur 2). Umiddelbart etter trituration, trypan blå farging indikerte at det var betydelig større celle død etter en 5 min inkubasjons sammenlignet med en 45 min inkubasjons med proteolytiske enzym (figur 1C). De to iPSC linjene vi brukte for å illustrere denne observasjonen var differensiert i neurons fra neural stamfar scenen ved hjelp av ulike protokoller, og viste bredt forskjellig følsomhet for replating prosedyren. Kulturer fra WT126 linje differensiert i NPCer bruker "rosett utvalgs metoden"7 var mer følsomme for skade enn kulturer DIFFERENSIERT fra CVB WT24 line ved hjelp av en rask differensiering metode8. Likevel, for begge linjer graden av umiddelbar celle død var omtrent halvert ved hjelp av utvidet enzym inkubasjons prosedyre.
Etter replating, kulturer utstilt en omtrentlig dobling av celle levedyktighet over påfølgende dager ved hjelp av utvidet enzym inkubasjons prosedyre, som bestemmes av tettheten av DAPI-positive celler (figur 2B, graf til venstre). I tillegg utvidet enzymet inkubasjons resulterte i en lavere tetthet av døde eller døende celler oppdages ved hjelp av en Dye-utelukkelse levedyktighet Kit (figur 2B, graf til høyre). Brøkdelen av døde celler oppdages ved hjelp av levedyktighet analysen etter 24 h post-replating var høyere enn sett ved hjelp trypan blå umiddelbart etter trituration. Dette gjenspeiler trolig akkumulering av døde og døende celler over disse første 24 h, men det er også mulig at levedyktigheten analysen mer følsomt oppdager celle død enn trypan blå analysen. Døde celler ble oppdaget over 1-7 dager etter replating (figur 2B). Den første plating tettheten for både eksperimentelle grupper (5 min og 45 min) var identiske og basert på hemocytometer Live celle tellinger av post-trituration celle suspensjonen. Viktigere, på alle tidspunkt poeng post-replating, antall levende, sunne celler var omtrent doblet etter 45 min enzymet inkubasjons sammenlignet med de 5 min inkubasjons. Disse observasjonene ble bekreftet kvalitativt ved hjelp av fase kontrast mikroskopi for å overvåke celle morfologi på hvert trinn: før replating, under replating, og etter replating (figur 1 og figur 2).
En av fordelene med replating hiPSC-avledet neurons etter at de har vært differensiering i flere uker er at de fleste av cellene vil ha gått ut stamfar scenen og bli forpliktet til en neuronal fenotype på tidspunktet for replating. Overgangen fase av neuronal differensiering fra neural forfedre foregår over flere dager, med større antall celler gradvis uttrykker tidlig stadium neuronal markører, slik som beta-III tubulin (oppdaget av antistoff TuJ1) eller MAP2. Gene uttrykk utvikler seg over flere uker, til slutt resulterer i uttrykk for sen-Stage Pan-neuronal markører, for eksempel NeuN, eller celle-type spesifikke markører for kortikale neurons som CTIP2. Derfor replating av tidligere differensiert hiPSC-avledet neurons gjør det mulig å studere tidlig og forbigående neuronal hendelser, for eksempel neurite innvielse, i identifiserte undergrupper av neurons. Figur 3 illustrerer den umiddelbare tilstedeværelsen av tidlige neuronal markører i kulturer som ble replated etter 4 uker med pre-differensiering i en større kultur parabolen. Merk at NeuN-og CTIP2-uttrykker neurons er lett identifiseres i løpet av få dager etter replating (Figur 3). Karakteristika og timing av neuronal differensiering kan variere mellom hiPSC linjer. For den WT 126 linjen og CVB WT24 linjene vi beskriver her, 85 ± 12% (n = 2) og 52 ± 11% (n = 5) av cellene, henholdsvis uttrykt immunoreactivity for βIII-tubulin markør TuJ1 på 4 dager etter replating med den utvidede protease inkubasjons prosedyren. For begge linjer, 30-40% av cellene, og 80-90% av neurons også uttrykke laget 5/6 neocortical markør CTIP2. I tillegg til økt levedyktighet, utvidet protease protokollen også moderat forbedret neurite utvekst (gjennomsnittlig neurite lengde per Nevron), som vist i Figur 4. Både total neurite lengde (kvantifisert ved hjelp av antistoff Tuj1, som flekker både axons og dendrites; Figur 4 B, venstre graf) og dendrit vekst (KVANTIFISERT bruker MAP2, som flekker bare dendrites; Figur 4 B, Center Graph) ble foretrukket ved bruk av den utvidede protease inkubasjons prosedyren. Legg merke til at grafen for DAPI-positive (DAPI (+)) celle telling i figur 2 er basert på samme bilde eksempler som celle tellings grafen i Figur 4, men i figur 2 ble de kvantifisert ved hjelp av en ikke-automatisert metode assistert av Fiji-programvare, stund inne skikkelsen 4 de var kvantifisert benytter det automatisert image analyseprogramvare plattform CellProfiler. Disse to bildeanalyse tilnærminger gitt lignende resultater.
Replating er nyttig ikke bare å studere neurite utvekst, men også for å studere synapser eller andre senere vises biologiske funksjoner i neurons. Faktisk, etter bare en uke etter replating vi observere markører for mange presynaptiske nerve og postsynaptic proteiner dekorere neuronal dendrites i et punktat mønster (figur 5a). Etter 4 uker begynner vi også å oppdage deres colocalization, som er en indikator på dannelsen av funksjonell synapser (figur 5A). Videre kan elektrisk aktivitet fra spontane depolarization og synaptically drevne strømninger oppdages ved bruk av kalsium avbildning (fig. 5B) eller multielectrode arrays (tiltak).
Figur 1 : Overlegen bevaring av neuronal levedyktighet etter lengre inkubasjons med proteolytiske enzym for celle dissosiasjon. (A) fase kontrast bilde av NPC-avledet neurons differensiert i 3 uker. Boks området i det venstre bildet forstørres til høyre. På dette stadiet neurons har lange prosesser, som danner en tykk meshwork. Vektstenger = 80 μm (venstre); 35 μm (høyre). (B) utvalgte bilder av hiPSC-avledet neurons på 1 og 5 dager etter replating. Scale bar = 100 μm. (C) venstre: celler løsne som et enkelt ark i løpet av få minutter etter initiering protease behandling. Scale bar = 200 μm. Høyre: etter trituration celler telles på hemocytometer før replating. Grafer viser kvantifisering av ikke-levedyktige, trypan positive celler etter 5 min eller 45 min inkubasjons med proteolytiske enzym for to forskjellige linjer CVB WT24 (* * * p < 0,0003, ikke sammenkoblet t-test) og WT 126 (* * * p < 0,0001, ikke sammenkoblet t-test). Verdiene representerer gjennomsnittet ± S. E. M av 4 individuelle replikerer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Neuronal levedyktighet etter flere dager etter replating. (A) bilder av WT126 NPC-avledet neurons på 1 og 3 dager etter replating med 5 min og 45 min protease inkubasjons. Dying celler er merket med sensitive tidlig celle død reporter. Tilsvarende brightfield bilder vises til venstre. Noe Cellular rusk (blåfarge pilen) er karakteristisk oppdaget etter replating, særlig inne det 5 min gruppe. Skala bars = 150 μm. (B) bilder av CVB WT24 NPC-avledede kulturer på 1, 3 og 7 dager etter replating med 5 min og 45 min protease inkubasjons. Dying celler er merket med følsom tidlig celle død reporter (rød). Alle kjerner av levende og døende celler er merket med DAPI (cyan). Det sammenslåtte hvite signalet representerer DAPI-og VivaFix-positive (+)-celler. Noen få celler viser VivaFix farging, men mangler DAPI farging (røde celler i den kombinerte bildet til høyre); disse er sannsynligvis celler som var døde i mange timer. Vektstenger: 25 μm. Høyre graf viser kvantifisering av brøkdel av døde celler (VivaFix/DAPI) etter ulike inkubasjonstid med proteolytiske enzymet (5 min vs 45 min: * p < 0,05 1 d og * * * p < 0,001, 3 d; toveis ANOVA, etterfulgt av multicomparison Bonferroni post hoc test). Venstre graf viser endringer i total celle tetthet (# DAPI (+) celler i 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 for alle tid poeng; toveis ANOVA, etterfulgt av multicomparison Bonferroni post hoc test). Alle verdier er vist som gjennomsnittet ± S. E. M av 3 replikerer, med et minimum av 1 500 celler scoret per betingelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Synlig uttrykk for sen-Stage neuronal markører umiddelbart etter replating. Kulturer av CVB WT24 hiPSC-avledede celler avbildet 4 dager etter replating, med 45 min protease inkubasjons, fra en 10 cm rett som hadde vært differensiert fra NPC scenen i 4 uker. Eksempler vist var flekkete for det gryte-neuronal markører TuJ1, MAP2, eller NeuN; eller dyp-lags kortikale pyramideformet Nevron markør CTIP2. Merk tilstedeværelsen av omfattende neurites, og det robuste uttrykket for TuJ1 og MAP2. Merk spesielt at en betydelig brøkdel av neurons også uttrykker sen-scenen markører NeuN og CTIP2. Scale bar = 16 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Neurite og dendrit vekst over tid etter kortere og lengre enzym inkubasjons under replating. (A) REPLATED CVB WT24 hiPSC-avledet neurons raskt forlenge neurites, som oppdages ved hjelp av antistoff Tuj1. Merk at den utvidede protease inkubasjonstiden fremmer neuritogenesis. Scale bar = 25 μm. (B) kvantifisering av neurite og dendrit lengde, over 1, 3 og 7 dager etter replating ved hjelp av enten 5 min eller 45 min protease. Total neurite lengde var kvantifisert fra TuJ1 (βIII-tubulin) farging; dendrit-spesifikk farging var kvantifisert fra MAP2 farging SNF korrigerte for det total cellen tettheten (rett graf). Alle verdier vises som gjennomsnittet ± S. E. M av 3 replikerer. Neurite lengde 5 min vs 45 min: * p < 0,05 til 1 dag og 7 dager, * * p < 0,01 til 3 dag; dendrit lengde 5 min vs 45 min: * * p < 0,01 til 1 dag og 3 dager, ikke signifikant (ns) ved 7 dag; # DAPI (+) 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 for all tid poeng; toveis ANOVA, etterfulgt av multicomparison Bonferroni post hoc-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Synaptogenesis og spontan kalsium transienter i differensiert hiPSC-avledet neurons etter replating. (A) venstre: ved 4 uker etter replating ved hjelp av den utvidede protease inkubasjons protokollen, er presynaptiske nerve markør synapsin 1 synlig i punktat KLYNGER langs MAP2 positive dendrites. Vektstenger = 5 μm. Høyre: valgt dendrittiske område som viser colocalization mellom presynaptiske nerve og postsynaptic klynger (gul pil), en indikasjon på potensielt aktive synapser. Skala stolper = 1,5 μm. (B) venstre: hiPSC neurons infisert med AAV8-syn-JGCAMP7F-WPRE ble brukt til å overvåke spontane kalsium transienter drevet av nettverksaktivitet. Det brightfield bildet vises ved siden av den pseudofarger gjengivelsen av GCaMP7-fluorescens på et enkelt tidspunkt i tidsforløp serien. Skala bar = 25 μm. fargede tall indikerer de 4 valgte cellene der GCaMP7-fluorescens ble målt over tid, som vist i sporene til høyre. Hver fargede spor tilsvarer én celle. Stjernen peker på tiden under Live-opptaket som bildet til venstre tilsvarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Arbeidsflyt av replating prosedyrer til kultur hiPSCs for høyt innhold screening og/eller detaljerte studier av differensiering og neurite utvekst eller Mea innspillinger. Fra en differensiert kultur neurons vokst for 4 eller flere uker i et større format (f. eks, en 10 cm kultur parabol), neurons er inkubert med en protease for 40-45 min, triturated forsiktig å distansere og resuspend. Celler blir deretter distribuert til multi-brønner som er kompatible med HCS, replated på underlag som er kompatible med bilde vekst kjegler (gul pil) eller andre strukturer, eller på multi-brønner egnet for multielectrode array innspillinger. Skala stolper = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (fra venstre til høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist en rett frem prosedyre for blanding og replating av menneskelig neuronal kulturer som optimaliserer levedyktighet, differensiering suksess, og subcellulære Imaging på en måte som er kompatibel med høyt innhold screening plattformer, og andre analyser som er relevante for legemiddel funn. Figur 6 illustrerer den generelle arbeidsflyten og eksempler på slike programmer.
Selv om her har vi fokusert på hiPSC-avledet neurons som er rettet mot en kortikale Nevron skjebne, forventer vi at denne metoden skal være like gjeldende for menneskelige embryonale stilk cellen-avledet neurons, og å stamme-celle avledet neurons rettet mot andre neuronal fenotyper14,15,16,17,18. Videre postulatet vi at denne utvidede protease prosedyren kan være fordelaktig for andre situasjoner som krever blanding av celler som har en etablert neurite meshwork, for eksempel for FACS sortering eller enkelt celleanalyser av primære neurons19 , og 20.
Replating hiPSC-avledet neurons gir en levedyktig modell system der for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer av mange viktige biologiske hendelser. For eksempel, denne prosedyren kan forenkle detaljerte studier av menneskelig neurite utvekst og vekst membran egenskaper, og sammenligning av funnene til den omfattende kunnskapsbase bygget fra ti år med å studere andre arter, både virveldyr og virvelløse. Vi finner at replating prosedyren har gjort det er lettere å optimalisere forholdene for å generere større vekst kjegler som er velegnet for optisk evaluering av subcellulære struktur og funksjon (figur 6). Til sammenligning, veksten kjegler mer vanligvis observert under den innledende differensiering av neurons fra hiPSCs tendens til å være liten og kompakt, og den tette utvalg av ikke-neuronal celler i slike kulturer gjør det vanskelig både å justere underlaget forhold til fremme vekst kjegle sprer seg og til bildet individuelle vekst kjegler innenfor komplekse vev miljøet. Således, replating neurons onto en frisk fat skaffer en "renset skifer" på hvilke å utsikt oppblomstringen kjegler under fint tenkelig vilkårene.
Replating er spesielt fordelaktig når du bruker cellekultur plattformer egnet for HCS fordi det i stor grad reduserer den totale tiden der kulturer dyrkes i små volumer. De små arbeids volumene av de enkelte brønnene i 96, 384 eller 1536-brønn multi-brønner (ca. 100, 50 og 5 mikroliter arbeidsvolum, henholdsvis) krever vanligvis hyppige (dvs. daglig) medie endringer for å motvirke fordamping og næringsmangel. Hyppige medie endringer er kostbare, ikke bare i form av reagenser og arbeid, men de kan kompromittere levedyktigheten til kulturer ved å fortynne conditioned Media og ved å øke sjansene for at cellene løsner fra underlaget på grunn av mekanisk turbulens. Replating av hiPSCs kan også forenkle innspillingen av fysiologisk aktivitet ved hjelp av multielectrode arrays21,22, eller Live Imaging av kulturer i analyser av dynamisk neuronal fenotyper23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er en del av National Cooperative omprogrammeres Cell Research groups (NCRCRG) for å studere psykiske lidelser og ble støttet av NIH stipend U19MH1 2015-0644. Innledende arbeid ble også støttet av NIH Grant NS070297. Vi takker DRS. Carol Marchetto og fred Gage, The Salk Institute, for å gi den WT 126 linje av nevrale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for å gi CVB WT24 linje med nevrale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet av Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
