Summary
इन विट्रो निषेचन प्रयोगशाला आबादी को बनाए रखने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सिंक्रनाइज़ भ्रूण का उत्पादन करने के लिए मॉडल जीवों की एक किस्म के साथ एक आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीक है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि मैक्सिकन टेट्रा मछली, Astyanax मैक्सिकनसके विभिन्न आबादी के लिए इस तकनीक को लागू प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Astyanax mexicanus जैविक विज्ञान में अनुसंधान क्षेत्रों की एक किस्म के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है. इस teleost मछली प्रजातियों की हाल ही में सफलता का एक हिस्सा यह है कि यह interfertile गुफा और नदी में रहने वाली आबादी के पास है. यह heritable लक्षण है कि इन आबादी के विभिन्न वातावरण के लिए अनुकूलन के दौरान तय किया गया की आनुवंशिक मानचित्रण सक्षम बनाता है. हालांकि इस प्रजाति को बनाए रखा जा सकता है और प्रयोगशाला में पैदा किया जा सकता है, यह दोनों दिन के दौरान भ्रूण प्राप्त करने और उपभेदों के बीच संकर भ्रूण बनाने के लिए चुनौतीपूर्ण है. इन विट्रो निषेचन (IVF) को विभिन्न मॉडल जीवों की एक किस्म के साथ सफलतापूर्वक और बार-बार प्रयोगशाला में जानवरों की नस्ल के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि कैसे, पानी के तापमान में परिवर्तन के साथ मिलकर विभिन्न प्रकाश चक्र के लिए ए mexicanus acclimateizing द्वारा, हम दिन का एक चुना समय के लिए प्रजनन चक्र बदलाव कर सकते हैं. बाद में, हम दिखाने के लिए कैसे उपयुक्त माता पिता की मछली की पहचान करने के लिए, पुरुषों और महिलाओं से स्वस्थ युग्मकों इकट्ठा, और आईवीएफ का उपयोग कर व्यवहार्य वंश का उत्पादन. यह सामान्य कार्य घंटों के दौरान होने के लिए आनुवंशिक constructs या विकासात्मक विश्लेषण के इंजेक्शन के रूप में संबंधित प्रक्रियाओं को सक्षम करता है। इसके अलावा, इस तकनीक गुफा और सतह में रहने वाली आबादी के बीच संकर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह विभिन्न वातावरण के लिए phenotypic रूपांतरों के आनुवंशिक आधार के अध्ययन को सक्षम.
Introduction
हाल के वर्षों में, Astyanax mexicanus इस तरह के विकास जीव विज्ञान, विकासवादी जीव विज्ञान, व्यवहार जीव विज्ञान, और शरीर क्रिया विज्ञान1,2,3,4 के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में एक मॉडल जीव बन गयाहै . इस प्रणाली की विशिष्टता बहुत अलग वातावरण के लिए अनुकूलित किया है कि कई morphotypes होने इस प्रजाति से आता है. सतह ीही फार्मोटाइप उन नदियों में रहता है जहां जैव विविधता अधिक है और मछली के लिए बहुत सारे खाद्य स्रोत हैं। इसके विपरीत, ए मैक्सिकनसकी गुफा रूपरूप, गुफा मछली, गुफाओं में रहते हैं जहां जैव विविधता, खाद्य स्रोत और ऑक्सीजन काफी कमहोजाते हैं 1। गुफाफ़िश विभिन्न प्रकार की फीनोटाइप में सतह की मछली से भिन्न होती है जैसे आँखों और रंजकता, इंसुलिन प्रतिरोध की अनुपस्थिति, और वसा को स्टोर करने की क्षमता2,3,4. हालांकि, सतह मछली और cavefish अभी भी एक ही प्रजाति के हैं और इसलिए, interfertil हैं.
दोनों morphotypes के लिए, शर्तों का एक सेट प्रयोगशाला शर्तों5,6 के तहत नियमित रखरखाव और प्रजनन की अनुमति देने के लिए परिभाषित किया गयाहै. हालांकि, आनुवंशिक संशोधनों, उचित भ्रूण विकास अध्ययन, और संकर के निर्माण अभी भी कई कारणों के लिए चुनौती दे रहे हैं. ए मैक्सिकनस मुख्य रूप से रात के घंटों के दौरान अंडे देता है जो आनुवंशिक निर्माणों के इंजेक्शन या प्रारंभिक भ्रूण विकास प्रक्रियाओं की निगरानी जैसे प्रारंभिक भ्रूण चरणों पर बाद के प्रयोगों के लिए असुविधाजनक होता है। इसके अलावा, सतह और गुफा संकर की पीढ़ी प्राकृतिक अंडे का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण है, के बाद से गुफा morphotypes एक बदल circadian ताल7 है कि अंततः व्यवहार्य ova के उत्पादन को प्रभावित करता है. सफल, अभी तक आक्रामक, आईवीएफ प्रक्रियाओं अन्य Astyanax प्रजातियों के लिए वर्णित किया गया है, जहां gamete उत्पादन और अंडे व्यवहार हार्मोनल इंजेक्शन8,9का उपयोग कर primed था. कम इनवेसिव आईवीएफ प्रक्रियाओं (यानी, हार्मोनल तैयारी के इंजेक्शन के बिना मैनुअल अंडे से युग्मक प्राप्त करने) वर्णित किया गया है, लेकिन ए मैक्सिकनस की गुफा और सतह morphotypes के बीच अंडे चक्र में मतभेद पर विचार नहीं है 6.
अन्य मछली मॉडल जीवों, जैसे ज़ेब्राफ़िश, आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और एक भ्रूण के स्तर पर अध्ययन किया जा सकता है क्योंकि ऊपर उल्लिखित बाधाओं को सफलतापूर्वक हल किया गया है। मानकीकृत प्रजनन तकनीकों के कार्यान्वयन, इन विट्रो निषेचन, और शुक्राणु cryopservation सभी आगे ज़ेब्राफ़िश धक्का दिया है और जैविक विज्ञान में मॉडल के उपयोग को मजबूत10. इसलिए, इन तकनीकों को ए मैक्सिकनस तक विस्तारित करने से इसे एक मॉडल प्रणाली के रूप में और अधिक सुदृढ़ किया जाएगा।
यहाँ, हम आईवीएफ के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि ए मैक्सिकनस और अधिक सुलभ बनाने में मदद मिलेगी मौजूद हैं. हम एक प्रजनन सेटअप पेश करेंगे जो दिन से रात तक मछली के प्रकाश चक्र को स्थानांतरित करने में सक्षम बनाता है ताकि हार्मोनल तैयारियों के इंजेक्शन के बिना दिन के घंटों के दौरान व्यवहार्य ओवा प्राप्त किया जा सके। हम तो कैसे ova और आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया milt प्राप्त करने के लिए की एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं. इस विधि सामान्य काम के घंटे के दौरान भ्रूण के उत्पादन में सक्षम हो जाएगा और आगे बहाव अनुप्रयोगों और अधिक प्राकृतिक अंडे से भ्रूण का उपयोग करने की तुलना में संभव बनाने के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यहां वर्णित सभी विधियों को चिकित्सा अनुसंधान संस्थान के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईयूसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. प्रकाश चक्र हेरफेर
- एक अपारदर्शी, पूरी तरह से संलग्न (प्रकाश संरक्षण), प्रवाह के माध्यम से जलकृषि प्रणाली के भीतर मछली टैंक स्थापित करें जिसमें टैंकों की कई पंक्तियाँ होती हैं (चित्र1)।
नोट: प्रवाह के माध्यम से प्रणाली के रूप में चित्र1 में दिखाया गया है प्रणाली पानी का उपयोग करता है प्रत्येक टैंक के पीछे खड़े पाइप के माध्यम से कचरे फ्लश और एक संप है कि एक सैनिटरी नाली में खाली में बहती है. इस प्रयोग में, एक ड्रिप उत्सर्जक के माध्यम से प्रति घंटे एक गैलन (अमेरिका) की एक पानी की विनिमय दर का इस्तेमाल किया गया था. - एक स्वतंत्र हीटिंग तत्व है कि मैन्युअल रूप से प्राइमिंग प्रक्रिया के दौरान तापमान को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ प्रत्येक टैंक के तापमान को बनाए रखें।
- प्रत्येक में अलग-अलग photoperiods सक्षम करने के लिए एक तरीके से अलग-अलग पंक्तियाँ सेट करें। प्रत्येक पंक्ति है कि प्रवेश करने या भागने से प्रकाश को रोकने के लिए बंद किया जा सकता है पर दरवाजे स्थापित करें.
नोट: स्वचालित नियंत्रक मछली के लिए कम से कम अशांति के साथ सभी photoperiods के हेरफेर सक्षम कर सकते हैं. - अंधेरे घंटे के दौरान उपयोग के लिए एक लाल काम प्रकाश और अंधकार पर्दे के साथ रैक से लैस।
2. युग्मक संग्रह के लिए फोटोअवधि और प्राइमिंग मछली का समायोजन
- सामान्य प्रणाली रैक और प्रजनन रैक में जगह से वांछित मछली निकालें (चित्र 2a) प्राइमिंग से 14 दिन पहले photoperiod के समायोजन के लिए अनुमति देने के लिए.
नोट: यह मछली एक नए वातावरण के लिए acclimateize करने के लिए अनुमति देता है. - इस अवधि के दौरान स्थापित जलीय तापन प्रणाली का उपयोग करके मछली को 22ण्8 डिग्री सेल्सियस (73 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। सामान्य फोटो सुबह 6 बजे से रात 8 बजे तक और रात 8 बजे से सुबह 6 बजे तक अंधेरा है। प्रकाश चक्र रैक के लिए, फोटो अवधि को 10 बजे से 12 बजे तक और 12 बजे से 10 बजे तक अंधेरे में टाइमर को समायोजित करके शिफ्ट करें जो रैक के भीतर प्रकाश को शक्ति प्रदान करता है।
नोट: पुरुषों और महिलाओं को एक ही टैंक में रखे प्राकृतिक प्राइमिंग व्यवहार के लिए जगह लेने के लिए अनुमति देने के लिए कर रहे हैं. जबकि अंडे टैंक में जगह ले सकता है, मछली अभी भी इन विट्रोनिषेचन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से युग्मक 11 चरणों में जारी कर रहे हैं. - एक बार जब मछली acclimateized कर रहे हैं,5 अंडे के लिए जानवरों प्राइमिंग शुरू के रूप में कदम 2.3.1 से 2.3.5 में वर्णित.
नोट: यह प्रक्रिया कुल में छह दिन लगते हैं। इस समय के साथ, एक स्थापित जलीय हीटिंग प्रणाली का उपयोग कर के लिए प्रधानमंत्री ओवा उत्पादन करने के लिए तापमान बदल जाते हैं। 50W एक्वाटिक हीटर का उपयोग करना (सामग्री की तालिकादेखें), हीटर सीधे तापमान के लिए सेट (हीटर पर पैमाने पर फेरनहाइट में है) प्रत्येक कदम पर प्रोटोकॉल में दिया. टैंक के आकार और पानी के प्रवाह के माध्यम से दर पर निर्भर करता है, तापमान समायोजन के समय अलग हो सकता है। इस प्रयोग में, तापमान दोपहर में समायोजित किया गया था और तापमान तुल्यता अगले 18 ज पर ले लिया.- पहले दिन तापमान को 22.8 डिग्री सेल्सियस (73 डिग्री सेल्सियस) से बढ़ाकर 24ण्4 डिग्री सेल्सियस (76 डिग्री सेल्सियस) कर दें।
- दूसरे दिन तापमान को 24.4 डिग्री सेल्सियस (76 डिग्री सेल्सियस) से बढ़ाकर 26.1 डिग्री सेल्सियस (79 डिग्री सेल्सियस) कर दें।
- 3 और 4 दिन तापमान 26.1 डिग्री सेल्सियस (79 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। मछली दिन के दौरान अंडे के लिए तैयार हो जाएगा और आईवीएफ प्रदर्शन किया जा सकता है.
नोट: व्यक्तिगत मछली पर निर्भर करता है, महिलाओं के दिन पर अंडे कर सकते हैं 3 और / हम दिन पर ova प्राप्त करने की कोशिश की सिफारिश 3 और / - 5 दिन, तापमान को 26.1 डिग्री सेल्सियस (79 डिग्री सेल्सियस) से 24.4 डिग्री सेल्सियस (76 डिग्री सेल्सियस) तक कम करें।
- 6 दिन, तापमान को 24.4 डिग्री सेल्सियस (76 डिग्री सेल्सियस) से 22.8 डिग्री सेल्सियस (73 डिग्री सेल्सियस) तक कम करें।
नोट: इस तापमान चक्र दोहराने से पहले एक 7 दिन के अंतर प्रदान करें. यह इस photoperiod में मछली रखने के बाद से इस स्थानांतरित प्रकाश चक्र को समायोजित करने के लिए मछली द्वारा आवश्यक समग्र समय कम हो जाएगा जारी रखने के लिए सिफारिश की है.
3. महिला युग्मक संग्रह
- एक चिठ्ठी डिश ढक्कन में एक गीला ऊतक पोंछ डालने और एक humidified कक्ष बनाने के लिए और संग्रह की प्रक्रिया के दौरान बाहर सुखाने से ओवा को रोकने के लिए पकवान बंद करके शुरू करें।
- अगले संग्रह के लिए एक महिला का चयन करें. बड़े, फैला पेट के साथ Gravid मछली की संभावना इस प्रक्रिया के लिए सबसे अच्छा विकल्प होगा (चित्र 2a).
नोट: वयस्क ए. मैक्सिकनसके पुरुषों और महिलाओं के बीच अंतर करने के लिए , कपास की गेंद विधि का उपयोगकियागया 12 . - ठंडा पानी का उपयोग कर एक महिला को स्थिर और एक गीला स्पंज पशु धारक में सुपाच्य स्थिति में उसे जगह है. कम से कम 30 s के लिए या जब तक मछली स्थिर है (यानी, गिल आंदोलन की हानि, विवरण के लिए रॉस और रॉस13 देखें) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस प्रणाली पानी में मछली रखकर ऐसा करें।
नोट: जल्दी से काम करते हैं और प्रक्रिया पूरा हो गया है जब तक मछली वार्मिंग से बचने के लिए प्रयास करें। यह समय-समय पर ठंडे पानी में उंगलियों के दस्ताने युक्तियाँ सूई या पूरक संज्ञाहरण की पेशकश शामिल हो सकते हैं. अन्य संज्ञाहरण तरीकों (जैसे, एमएस-22213) के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान के IACUC दिशा निर्देशों के तहत, ova के मैनुअल संग्रह एक गैर इनवेसिव प्रक्रिया है, जो पूर्ण संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है माना जाता है (उदाहरण के लिए, एमएस-222 के माध्यम से). - एक बार तैनात, पानी के साथ संपर्क के रूप में एक नाजुक ऊतक पोंछ के साथ मछली के अधर पक्ष धब्बा ova को सक्रिय करने के लिए कारण होगा.
- अंगूठे और तर्जनी के बीच महिला पकड़ो. उंगलियों को थोड़ा रोलिंग करते समय यूरोजेनिक उद्घाटन की दिशा में सीओलोमिक गुहा के पार्श्व पक्षों के खिलाफ धीरे से निचोड़ें। एक डिस्पोजेबल spatula का उपयोग कर व्यक्त ओवा लीजिए.
- इन ओवा को आर्द्र पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
नोट: विशिष्ट पितृत्व डेटा की जरूरत नहीं है, तो एक ही पकवान में अंडाणु के कई क्लच जोड़ा जा सकता है। ओवा 24 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है और सबसे अच्छा कर रहे हैं जब संग्रह के बाद 30-60 मिनट के भीतर आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया। - संग्रह के बाद, धीरे सिस्टम पानी से भरा एक वसूली टैंक के लिए मछली वापस.
नोट: जब आवश्यक भविष्य ओवा संग्रह के लिए अंधेरे कैबिनेट टैंक में वापस मछली प्लेस।
4. पुरुष युग्मक संग्रह
- संग्रह के लिए एक पुरुष चुनें.
नोट: पुरुष gamete गुणवत्ता का कोई बाहरी रूप से दिखाई संकेत कर रहे हैं. हालांकि, मछली इस प्रक्रिया में उपयोग करने से पहले उपस्थिति में स्वस्थ दिखाई देना चाहिए. वयस्क ए . मैक्सिकनसके नरऔर मादाएं के बीच अंतर करने के लिए कपास की गेंद विधि का प्रयोग12. - ठंडा पानी का उपयोग कर एक पुरुष immobilize और उसे एक गीला स्पंज पशु धारक में सुपाच्य स्थिति में जगह है. कम से कम 30 सेकंड के लिए या जब तक मछली स्थिर है (यानी, गिल आंदोलन की हानि, विवरण के लिए रॉस और रॉस13 देखने) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस प्रणाली पानी में मछली रखकर immobilize.
नोट: जल्दी से काम करते हैं और प्रक्रिया पूरा हो गया है जब तक मछली वार्मिंग से बचने के लिए प्रयास करें। यह समय-समय पर ठंडे पानी में उंगलियों के दस्ताने युक्तियाँ सूई या पूरक संज्ञाहरण की पेशकश शामिल हो सकते हैं. अन्य संज्ञाहरण तरीकों (जैसे, एमएस-22213) यहाँ के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान के IACUC दिशा निर्देशों के तहत, शुक्राणु के मैनुअल संग्रह एक गैर इनवेसिव प्रक्रिया है, जो पूर्ण संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है माना जाता है (उदाहरण के लिए, एमएस-222 के माध्यम से). - पानी के साथ संपर्क के रूप में एक नाजुक ऊतक पोंछ के साथ मछली के अधर पक्ष ब्लॉट मिल्ट को सक्रिय करेगा।
- यूरोजेनिक उद्घाटन पर केशिका ट्यूब के अंत को धीरे से रखें।
- अंगूठे और तर्जनी के साथ मछली के पक्षों पर कोमल दबाव लागू करके milt निष्कासित. gills के लिए दूर शुरू, मूत्रजननांगी खोलने की ओर बढ़ रहा है.
- एक केशिका ट्यूब के अंत में मिल्ट लीजिए. एक ऐस्पिरेटर ट्यूब के उपयोग से कोमल चूषण आवश्यक हो सकता है। किसी भी मल है कि milt के साथ निष्कासित किया जा सकता है से बचें.
- एक खाली 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिल्ट का वितरण करें और शुक्राणु एक्स्टेंडर E400 की मात्रा से दोगुनी मात्रा को पतला करें (सामग्री की तालिकादेखें ) । बर्फ पर रखें.
नोट: विशिष्ट पितृत्व डेटा की आवश्यकता नहीं है, तो एक से अधिक पुरुषों से मिल्ट एक साथ जमा किया जा सकता है। यह कदम कई घंटे के लिए मिल्ट के काम के समय का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह तत्काल निषेचन के लिए आवश्यक नहीं है. - संग्रह के बाद, धीरे सिस्टम पानी से भरा एक वसूली टैंक के लिए मछली वापस.
नोट: जब आवश्यक भविष्य शुक्राणु संग्रह के लिए अंधेरे कैबिनेट टैंक में वापस मछली रखें।
5. इन विट्रो निषेचन
- प्रत्येक स्टॉक के लिए एक नया पिपेट का उपयोग करना, पाइपिंग द्वारा शुक्राणु को मिलाएं और/या ट्यूब के पक्ष को उत्तेजित करके, मिल्ट में शुक्राणु के रूप में निषेचित करने से पहले समय के साथ E400 समाधान में व्यवस्थित हो सकता है।
- हाल ही में एकत्र अंडा में मिल्ट या विस्तारित मिल्ट समाधान का वितरण करें।
- निषेचन के लिए शुक्राणु और अंडे को सक्रिय करने के लिए क्लच में 1 एमएल सिस्टम पानी को तुरंत जोड़ें। मिश्रण या पकवान सामग्री आंदोलन से बचें और निषेचन होने के लिए 2 मिनट की अनुमति देते हैं।
नोट: मिश्रण और आंदोलनकारी बहुत निषेचन दरों को कम कर देता है और इसलिए,14से बचा जाना चाहिए. - पकवान 2/3rd पूर्ण भरने के लिए E2 भ्रूण मीडिया जोड़ें.
नोट: बाद की प्रक्रिया के आधार पर, भ्रूण या तो तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, आनुवंशिक constructs के इंजेक्शन के लिए के रूप में15से पहले वर्णित ) या भ्रूण E2 भ्रूण मीडिया में 23 डिग्री सेल्सियस पर incubated किया जा सकता है जब तक वे 5 dpf तक पहुँचने. इस बिंदु पर मुख्य recirculating आवास प्रणाली प्रणाली पानी का उपयोग करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मुख्य रूप से पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल6पर आधारित है। हालांकि, के बाद से ए mexicanus रात के घंटे के दौरान अंडे, हम मछली प्रजनन के लिए एक आवास रैक है कि काम के घंटे से स्वतंत्र photoperiod बदल सकते हैं डिजाइन (चित्र1). मत्स्य प्रकाश चक्र को पूर्ण संलग्न, प्रवाह-थ्रू जलकृषि प्रणाली में परिवर्तित किया जाता है जिसमें टैंकों की तीन पंक्तियाँ होती हैं (चित्र1)। प्रत्येक टैंक मैन्युअल रूप से प्राइमिंग प्रक्रिया के दौरान तापमान को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक स्वतंत्र हीटिंग तत्व शामिल हैं। व्यक्तिगत अलमारियों अलग photoperiods पर रखा जा सकता है और प्रवेश करने या भागने से प्रकाश को रोकने के लिए बंद किया जा सकता है. सभी photoperiods प्रकाश चक्र रैक के पक्ष पर तैनात एक स्वचालित नियंत्रक के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है. अंधेरे घंटे के दौरान उपयोग के लिए, रैक एक लाल काम प्रकाश और अंधकार पर्दे के साथ सुसज्जित है. ए मैक्सिकनस तापमान में 23 - 26 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि के बाद पैदा होता है जिसमें 1.5 डिग्री सेल्सियस प्रति दिन16की वृद्धि होती है . हमारे अंधेरे अलमारियाँ में इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम प्रत्येक टैंक में पनडुब्बी मछलीघर हीटर का इस्तेमाल किया (चित्र 1).
ए मैक्सिकनस में एक सफल आईवीएफ प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कारक एकत्र ova की गुणवत्ता है. Gravid, बड़े, फैला पेट के साथ महिला मछली सबसे व्यवहार्य ओवा जारी करने की संभावना है, जो स्पष्ट दिखाई देते हैं और यहां तक कि उपस्थिति में (चित्र 2a-d). इस प्रकार के अंडाणुमें एकत्रित मिल्ट को जोड़ने से निषेचित भ्रूणों का विकास आमतौर पर 20-30 मिनट के भीतर होता है (चित्र 2म )। विकास चक्र के एक कोशिका चरण में प्रवेश करने से पहले व्यवहार्य निषेचित भ्रूण थोड़ा अधिक पारदर्शी हो जाएंगे जबकि अनिषेचित अंडाणु अधिक असमान और अपारदर्शी दिखाई देंगे (चित्र 2े)। परिणामी भ्रूण जिरक ई 2 भ्रूण मीडिया में पेट्री डिश में आयोजित किए जाते हैं और 14/10 प्रकाश/अंधेरे चक्र में 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए जाते हैं। भ्रूण तो पालन के लिए निषेचन के बाद 5 दिनों में मुख्य recirculating आवास प्रणाली को स्थानांतरित कर रहे हैं.
तकनीक के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए, हम दिखाते हैं कि कैसे इस तरह के नेत्र आकार और शरीर pigmentation के रूप में विशिष्ट लक्षण के लिए संकर के phenotyping उनके आनुवंशिक आधार को समझने में मदद कर सकते हैं. Cavefish स्पष्ट रूप से उनकी आंख का आकार और शरीर pigmentation में सतह मछली से अलग हैं. इन लक्षणों के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए, हमने सतह और कैवफ़िश (F0) को पार किया और आईवीएफ का उपयोग करके संकर F1 और F2 की जनसंख्या उत्पन्न की ताकि प्राप्त फीनोटाइपिक भिन्नता का निरीक्षण किया जा सके (चित्र 3)। नेत्रों का आकार एफ 1 पीढ़ी में छोटा होता है जो यह दर्शाता है कि नेत्रों की उपस्थिति आंशिक रूप से प्रभावी विशेषता है (चित्र3)। सतह-कैव एफ 2 संकरों में, हम नेत्र आकारों की एक विस्तृत श्रृंखला प्राप्त करते हैं, जो यह दर्शाता है कि ए मैक्सिकनस में नेत्र आकार को नियंत्रित करने वाले अनेक लोसी हैं, जिससे यह मात्रात्मक विशेषता (चित्र3)है। एक अन्य उदाहरण रंजकता है। सतह तथा गुफाफिश के एफ 1 संकर को प्रेक्षण करते हुए यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि शरीर रंजकता एक प्रमुख विशेषता है क्योंकि मछली पूरी तरह वर्णक होती है (चित्र 3)। F2 पीढ़ी में, शरीर रंजकता में भिन्नता फिर से एक मात्रात्मक विशेषता की ओर इंगित करता है. अनुक्रमण डेटा के साथ इस phenotypic डेटा का संयोजन अंतर्निहित आनुवंशिक loci इन phenotypes के लिए जिम्मेदार प्रकट कर सकते हैं. ये F2 जनसंख्या विभिन्न लक्षणों के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए एक अच्छा संसाधन है और ऐसी आबादियों का उपयोग पहले इन लक्षणों का अध्ययन करने के लिए किया गया है17,18,19. एक मानकीकृत आईवीएफ तकनीक बहुत संकर की पीढ़ी को कारगर बनाने, loci ऐसे लक्षण को नियंत्रित करने की आनुवंशिक मानचित्रण को सक्षम करने और हमें समझने में मदद कैसे कुछ phenotypes कुछ निवास और दूसरों में अनुकूली में हानिकारक हैं कर सकते हैं.
चित्र 1 : रैक के डिजाइन दिन शिफ्ट करने के लिए / A. मैक्सिकनस| (क) इस रैक प्रणाली के सामान्य सेटअप photoperiod हेरफेर की अनुमति देता है, दिन के घंटे के दौरान रात के समय का अनुकरण दे जब दरवाजे बंद कर रहे हैं, और शेल्फ रोशनी बंद कर रहे हैं. (ख ) ओवा परिपक्वता को प्रोत्साहित करने के लिए मछली को प्रतिक तापकों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें ) जो अलग-अलग टैंकों में स्थापित किया जा सकता है (लाल तीर) । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : ओवा संग्रह और व्यवहार्य और अव्यवहार्य अंडाणु के प्रतिनिधि चित्रण के लिए उपयुक्त महिलाओं के उदाहरण. (क) ग्रेविड, मादा मछली जिसके पेट बड़े होते हैं, बाहर निकलती हैं , मैनुअल ओवा संग्रह के लिए अधिक उपयुक्त होती हैं (ख) एक सुव्यवस्थित आकार के पेट वाली स्त्रियों की तुलना में। (ग) व्यवहार्य अंडाणु (अर्थात्, अंडाणु जब निषेचित व्यवहार्य भ्रूणों का उत्पादन करते हैं) की पहचान उनके स्पष्ट, यहां तक कि उपस्थिति द्वारा की जा सकती है, जबकि अव्यवहार्य अंडाणु (अर्थात्, अंडा न व्यवहार्य भ्रूणों का उत्पादन करते समय निषेचित), जैसा कि (घ) में दिखाया गया है , में दर्शाया गया है (घ) उपस्थिति. (ई) सफल निषेचन के बाद, व्यवहार्य भ्रूण अधिक पारदर्शी हो जाते हैं और एक कोशिका चरण में प्रवेश करते हैं जबकि अनिषेक अंडाणु (लाल तीर) धीरे-धीरे क्षय हो जाएगा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : आंख के आकार और शरीर pigmentation लक्षण के आनुवंशिक विश्लेषण. माता पिता (F0) सतह मछली (ऊपर बाएँ) और cavefish (ऊपर सही), F1 संकर (दूसरी पंक्ति) और F2 संकर के चित्रदिखा Pedigree. F1 मछली मध्यवर्ती आंख का आकार है और पूरी तरह से pigmented रहे हैं, जबकि F2 मछली दो रूपात्मक लक्षण में एक व्यापक भिन्नता दिखाने: आंख का आकार और pigmentation. इस आंकड़े अंतर्निहित सभी मूल डेटा http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365 पर Stowers मूल डेटा भंडार से पहुँचा जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जबकि आईवीएफ ऐसे ज़ेब्राफ़िश के रूप में कई अलग अलग मॉडल जीवों के लिए एक मानकीकृत विधि है, ए मैक्सिकनस के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल खाते में नहीं है कि इस प्रजाति स्वाभाविक रूप से रात के घंटे के दौरान अंडे6. यह देखते हुए कि cavefish और सतह मछली उनके circadian लय में काफी काफी अलग हैं, ova की परिपक्वता चक्र भी गुफा और सतह morphotypes के बीच अलग है. जबकि सतह ए मैक्सिकनस के लिए मचान तापमान और समय अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं12, cavefish उनके अंडे व्यवहार और परिपक्वता चक्र में अलग कर सकते हैं. संकर उत्पादन के पारंपरिक तरीकों इसलिए बहुत चुनौतीपूर्ण और ए मैक्सिकनस7की गुफा morphotype में circadian लय के नुकसान के कारण अनिश्चित हैं, जो इन मछली के बदल अंडे देने के समय में परिणाम. photoperiod स्थानांतरण करके, हम दो morphotypes के बीच दुर्लभ प्राकृतिक अंडे की घटनाओं पर भरोसा करने के लिए बिना समय विशिष्ट संकर भ्रूण प्रदान कर सकते हैं. गुफा और सतह मछली अलग रखते हुए भी प्रजनन पर प्रतिकूल प्रभाव होने से आक्रामक सतह morphs रोकता है.
कुछ सीमाएँ इस विधि के साथ मौजूद हैं जैसे कि ओवा गुणवत्ता में भिन्नताएँ. परिपक्व ओवा के साथ एक महिला (सतह या गुफा मछली) की पहचान तुच्छ नहीं है और मछली व्यवहार के सावधान टिप्पणियों की आवश्यकता है। आम तौर पर, अंडे देने के लिए तैयार gravid महिलाओं बड़ा पेट है और बार बार नीचे टैंक सतह या भ्रूण संग्रह जाल20के खिलाफ ब्रश होगा.
हमने देखा कि शुक्राणु की गुणवत्ता पूरे दिन / सफल आईवीएफ के महत्वपूर्ण कदम (उर्वरीकृत भ्रूण पैदा करने के मामले में सफल) अच्छी गुणवत्ता प्राप्त कर रहा है, व्यवहार्य ova. अतः प्राकृतिक रूप से अंडे देने वाली मछलियों से अंडाणु एकत्र करना अत्यंत महत्वपूर्ण है (चित्र 2क)। एक बार जब ओवा एकत्र कर रहे हैं, वे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है गुणवत्ता की जांच. रात के दौरान व्यवहार्य अंडाणु का संग्रह, तथापि, अनुसंधानकर्ता के लिए असुविधाजनक और चुनौतीपूर्ण है। सेटअप है कि हम यहाँ मौजूद ova की परिपक्वता चक्र के स्थानांतरण के लिए अनुमति देता है, तो आईवीएफ सामान्य काम के घंटे के दौरान बहाव आवेदन के लिए सिंक्रनाइज़ भ्रूण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
milt के cryopservation की प्रगति के साथ (उदाहरण के लिए, के रूप में यह ज़ेब्राफ़िश21में वर्णित है), आईवीएफ स्थापित करने और उभरते मॉडल प्रणाली ए मैक्सिकनसके लिए आनुवंशिक लाइनों को बनाए रखने की दिशा में एक शक्तिशाली उपकरण बन जाएगा. आनुवंशिक संशोधन के लिए तरीकों के साथ संयोजन में15 और morpholino आधारित knockdown17,इन प्रक्रियाओं विभिन्न करने के लिए अनुकूलन के आनुवंशिक और विकासात्मक underpinnings का अध्ययन करने के लिए methodological मंच प्रदान करेगा ए मैक्सिकनसमें निवास स्थान |
संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अन्य बहाव अनुप्रयोगों के लिए ए मैक्सिकनस के सिंक्रनाइज़ भ्रूण के उत्पादन को सक्षम करेगा, जैसे आनुवंशिक निर्माण ों के इंजेक्शन या जल्दी भ्रूण phenotypes का अध्ययन. प्रोटोकॉल की प्रमुख ताकत यह है कि यह सतह गुफा संकर है कि आनुवंशिक रूप से QTL (मात्रात्मक विशेषता loci) विश्लेषण के माध्यम से सतह मछली और cavefish के बीच phenotypic मतभेद नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के कुशल उत्पादन के लिए अनुमति देता है. एक साथ लिया, आईवीएफ के लिए दिन के दौरान व्यवहार्य ova प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है कि जैविक विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में भविष्य के अध्ययन की एक किस्म के लिए फायदेमंद होगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों वीडियो उत्पादन पर उनके समर्थन के लिए फिलिप Noguera और Kimberly Bland शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. लेखक भी पशुपालन के लिए Stowers संस्थान की पूरी तैराकी टीम को स्वीकार करना चाहते हैं. इस कार्य को डी पी बी और एनआर को संस्थागत वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था। एनआर एडवर्ड Mallinckrodt फाउंडेशन और JDRF द्वारा समर्थित किया गया था. आरपी ड्यूश Forschungsgemeinschaft से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (पीई 2807/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
