Мы представляем высокую пропускную силу силы ассеис изготовлены с силиконовой резины (PDMS). Этот новый ассси подходит для изучения физических изменений в сотрудничности клеток во время различных биологических и биомедицинских процессов и заболеваний. Мы демонстрируем полезность этого метода, измеряя tGF-я зависимое увеличение контрактности во время эпителиального перехода к мезенхимальному.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сотовая контрактность имеет важное значение в различных аспектах биологии, движущих процессов, которые варьируются от подвижности и деления, для сокращения тканей и механической стабильности, и представляет собой основной элемент многоклеточной жизни животных. В клетках атто-миозина, акто-миосин сокращения наблюдается в тяговых сил, которые клетки оказывают на их субстрат. Дисрегуляция клеточной контрактильности появляется в множестве патологий, что делает контрактность перспективной мишенью в различных диагностических подходах с использованием биофизики в качестве метрики. Кроме того, новые терапевтические стратегии могут быть основаны на исправлении очевидной неисправности клеточной контрактности. Однако эти приложения требуют прямой количественной оценки этих сил.
Мы разработали силиконовую эластомерную масляную силовую микроскопию (TFM) в параллельном формате мультиколодца. Наше использование силиконовой резины, в частности полидиметилсилоксана (PDMS), а не широко используемых гидрогель полиакриламид (PAA) позволяет нам сделать надежные и инертные субстраты с неопределенным исполидных сроков хранения, не требующих специализированных условий хранения. В отличие от подходов на основе столба-PDMS, которые имеют модуль в диапазоне GPa, PDMS, используемый здесь, очень совместим, от примерно 0,4 кПа до 100 кПа. Мы создаем платформу высокой пропускной силы для TFM путем раздела этих больших монолитных субстратов, пространственно в биохимически независимых скважин, создавая многоскважинную платформу для скрининга силы тяги, совместимую с существующими многоскважинными системами.
В этой рукописи мы используем эту многостороннюю систему силы тяги для изучения Эпителия к мезенхимальному переходу (EMT); мы индуцируем EMT в клетках NMuMG путем подвергать их к TGF-я, и для того чтобы количественно биофизические изменения во время EMT. Мы измеряем сородичность как функцию концентрации и продолжительности воздействия TGF-я. Наши выводы здесь демонстрируют полезность параллелизированного TFM в контексте биофизики болезней.
Введение
Контрактность акто-миозина является важным элементом активной клеточной механики, влияющим на поведение клеток от подвижности и пролиферации до дифференциации стволовых клеток. В тканях контрактность приводит к активности от полярного разделения при эмбриогенезе, к сужению дыхательных путей и сердечной деятельности. Критически, для того чтобы произвести напряжение, клетки должны сперва придерживаться к их внеклеточной окружающей среде. При этом эта договорность генерирует силы тяги на их окрестностях. Микроскопия силы тяги (TFM) вытекла в множество форм как путь к количественной оценке этих усилий от различных клеток на по-разному условиях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол будет направлять исследователей в изготовлении и использовании многоскважины TFM блюдо показано на рисунке 1.
1. Приготовление силиконовых субстратов PDMS
- Приготовление силиконовой резиновой смеси PDMS на основе композитной смеси из двух коммерчески доступных комплектов.
- Добавьте часть А и часть B комплекта PDMS (например, GEL-8100, см. таблицуматериалов) в соотношении веса 1:1 в трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь смешивается на ротаторе со скоростью достаточно медленно для смеси течь вперед и назад во время революции, чтобы обеспечить полное сме....
- Добавьте часть А и часть B комплекта PDMS (например, GEL-8100, см. таблицуматериалов) в соотношении веса 1:1 в трубку 50 мл.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перед добавлением TGF-я, слияние монослой клеток имеет булыжник, как форма и плотно упакованы. После лечения TGF-я, клетки становятся более удлиненные в морфологии, увеличение области клеток и приобретения более мезенхимального фенотипа. Используя мульти-хорошо устройство, изготовленное с мягкими elastomers PDMS, были изучены физические свойства клеток в общей сложности 17 различных условиях. Клетки были обработаны с четырьмя различными концентрациями TGF-я (0,5, 1, 2 и 4 нг/мл) и четыре .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для успеха этого метода, очень важно иметь равномерно покрытый образец с постоянной толщиной около 100 мкм. Модули должны быть тщательно отобраны для изучения физической значимости биологической системы интересов. При изготовлении верхнего слоя, концентрация фидуциальных флуоресцентных частиц должна быть оптимизирована для точного анализа смещения и тяги стресса. Анализ изолированных одиночных клеток требует более плотного фидуциарного слоя, чем измерение сольящих монослойных. Кроме того, поверхность субстрата должна име.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
AJE и RK заинтересованы в Компании Live Cell Technologies, которая изготавливает материалы, описанные в этой статье.
Благодарности
Авторы благодарят Тома Кодгера, Майкла Лэндри и Кристофера Барретта за помощь в синтезе биса. A.J.E. признает гранты Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям RGPIN/05843-2014 и E-PE/472339-2015, Канадские институты исследований в области здравоохранения No 143327, Грант Канадского онкологического общества No 703930 и Канадский фонд инноваций Проект #32749. Р. Кришнан признает, национальные институты здравоохранения грант нет. R21HL123522 и R01HL136209. H.Y. была поддержана Фондами де Рехерче Санте Квебеки и Fonds de recherche Nature et Technologies Квебека. Авторы благодарят Johanan Idicula за помощь в видео и рукописи и Зиксин Он за помощь в подготовк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | Диэлектрик, мягкий силиконовый гель высокой чистоты |
| Dow Corning Sylgard 184 Силиконовая капсуляция Прозрачный 0,5 кг Набор | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0,5 кг | отвердителя |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109,6 мм x 72,8 мм x толщина 1 мм | |
| Мишень 2TM Нейлоновый шприц Фильтр | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-луночный держатель полоски для ящика для яиц | Stripwell Corning | 2572 | |
| Полистирол универсальная микропластина крышка с угловой выемкой; | Corning | 3099 | |
| Этиловый спирт | Greenfield Global | P016EA95 | 0,95 |
| 2-пропанол | Сигма-Олдрич | 190764 | реагент ACS, ≥ 99,5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Фибронектин бычьей плазмы | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | раствор, стерильно-отфильтрованный, биореагент, подходит для клеточной культуры |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7,4, без кальция и магния |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4,5 г/л глюкозы, с L-глутамином, пируватом натрия и феноловым красным |
| FBS (фетальная бычья сыворотка) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Эндотоксин < 1, Гемоглобин < 25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, свободная кислота |
| человеческий инсулин рекомбинантный | Wisent | 511-016-CM | USP класс |
| Пенициллин-стрептомицин раствор | Wisent | 450-201-EL | 100 X, стерильный фильтрованный для клеточной культуры |
| L-глутаминовый раствор | Wisent | 609-065-EL | 200mM раствор, стерильный отфильтрованный для клеточной культуры |
| Амфотерицин B | Wisent | 450-105-QL | 250μ г/мл, стерильный отфильтрованный для клеточной культуры |
| Рекомбинантный человеческий TGF-β 1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Производная |
| уксусная кислота | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥ 99.85% |
| Чиктриновая кислота | Sigma-Aldrich | 251275 | реагент ACS, ≥ 99,5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Клеточная линия молочной железы мыши |
| Азид натрия | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, экстра чистый, ACROS Organics |
| Гидроксид калия | Сигма-Олдрич | 221473 | реагент ACS, ≥ 85%, пеллеты |
| ТритонХ-100 | Сигма-Олдрич | Х100 | лабораторный сорт |
| <сильный>Синтез бусин | |||
| 1,1&прайм;-Диоктадецил-3,3,3&прайм;,3&прайм;-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат (DiI) | Сигма-Олдрич | 468495-100MG | 97% |
| Метилметакрилат | Сигма-Олдрич | M55909-500ML | содержит; 30 ppm MEHQ в качестве ингибитора, 99% |
| Средство для удаления ингибитора | Sigma-Aldrich | 306312-1ЭА | Колонка для удаления гидрохинона и монометилового эфира гидрохинона |
| Метакрилоксилпропил Терминированный полидиметилсилоксан | Гелест | DMS-R31 (25 000 г/моль) | Стабилизатор полидиметилсилоксана, 25 000 г/моль, 1 000 сСт |
| 2,2′-Азобис(2-метилпропионитрил) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| гексана | Сигма-Олдрич | 296090-2L | безводный, 95% |
| Гексан, смесь изомеров | Sigma-Aldrich | 227064-1л | безводный, ≥ 99% |
| Ватман качественная фильтровальная бумага, Сорт 1 | Sigma-Aldrich; | WHA1001055 | круги, диаметр 55 мм, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Ручная УФ-лампа Модель UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Реометр | Anton Paar | MCR 302 WESP |
Ссылки
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995). <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
