유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.
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방법 논문
체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유비퀴틴화는 다양한 신호 경로에서 중요한 역할을 하며 염색질 기능 및 DNA 관련 과정의 조정에 특히 관여하는 번역 후 수정입니다. 이 수정은 E1 유비퀴틴 활성화, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 및 E3 유비퀴틴-리가제 및 듀비퀴틴-리가제를 포함한 여러 효소의 순차적 작용을 수반하며 듀비퀴틴아제(DUBs)에 의해 역전된다. 유비퀴틴화는 효소 활성의 변조, 단백질-단백질 상호 작용 및 세포외 국소화를 포함한 단백질 기능의 저하 또는 단백질 기능의 변경을 유도합니다. 단백질 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화를 입증하는 중요한 단계는 정제된 성분으로 시험관 내 반응을 수행하는 것입니다. 효과적인 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응은 사용되는 다양한 성분, 효소 보조 인자, 완충조건 및 기질의 성질에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 여기서는 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 폴리콤 억압 복합체 1(PRC1), BMI1 및 RING1B, 리신 119에 대한 히스톤 H2A를 모노비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제의 최소한의 성분을 사용하여 이러한 반응을 설명한다. 핵소종 H2A의 듀비퀴틴화는 인간 듀비퀴티나제 BAP1 및 그 보조 인자 ASXL2의 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인에 의해 형성된 최소한의 폴리콤 억압적 듀비퀴타제(PR-DUB) 복합체를 사용하여 수행된다. 이러한 유비퀴틴화/듀비퀴틴화 분석은 포유류 세포로부터 정제된 박테리아 정제 단백질 또는 네이티브 뉴클레오좀으로 재구성된 재조합 뉴클레오좀의 맥락에서 수행될 수 있다. 우리는 이 반응에 중요한 영향을 미칠 수 있는 복잡성을 강조하고 우리는 이 프로토콜의 일반적인 원리가 그밖 E3 유비퀴틴 ligases 및 deubiquitinases에 신속하게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.
서론
유비퀴틴화는 번역 후 가장 보존된 변형 중 하나이며 효모, 식물 및 척추동물을 포함한 다양한 유기체에 매우 중요합니다. 유비퀴틴은 단백질을 표적으로 하는 76개의 아미노산 폴리펩티드를 고도로 보존한 유비퀴틴의 공유 부착으로 구성되며, 즉 E1-활성화, E2-컨쥬게이팅 및 E3 리가제1과 관련된 3가지 순차적 단계에서 발생합니다. 2,3. 이 번역 후 수정은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼에서 중심 역할을한다. 실제로 반응의 특이성을 제공하는 E3 ligases는 효소의 큰 슈퍼 패밀리를 구성하며 유비퀴틴 시스템 4,5,6의가장 풍부한 효소입니다. 단백질 유비퀴틴화의 하류 효과는 단핵화, 다중 단핵화, 선형 또는 분기된 폴리유퀴틴화와 같은 변형의 특성에 따라 달라집니다. 단핵화는 거의 프로테아소말 분해와 관련이 없지만, 대신이 수정은 다양한 신호 이벤트를 중재하는 데 관여합니다. 폴리비퀴틴화는 유비퀴틴 분자 자체에서 N 말단 또는 리신 잔기와 관련이 있으며, 폴리....
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프로토콜
1. GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 GSH-아가로즈 선호도 정화
- pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159 aa)-BMI1(1-109aa) 박테리아 발현 구조를 사용하여 BL21(DE3) 박테리아를 변형시키는 구조(재료표참조)23. 이러한 컨스트럭트는 pGEX-6P-2 백본에서 GST 태그를 사용하여 BMI1 도메인 1-109에 융합된 뮤린 RING1B 도메인 1-159의 발현을 허용한다.
- 100 μg/mL 암피실린 과 50 μg/mL 클로람페니콜이 있는 LB 국물 배지의 20 mL에서 GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109 aa)을 발현하는 RIL 박테리아를 접종하여 하룻밤 스타터 배양을 수행합니다. 밤새 37°C에서 흔들어 서 배양한다. 다음날, 500 mL의 신선한 LB 국물 배지(1/26 희석)를 포함하는 1 L 플라스크에 앰피실린을 넣고 37°C에서 2-4시간 동안 쉐이커에서 배양한다.
- 인큐베이션 시간 동안 분광광도계로 600 nm에서 OD를 측정합니다. 박테리아 배양이 600 nm에서 0.6 OD 단위에 도달하면, 비 유도 샘플로서 1,5 mL 튜브에서....
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결과
GST-BMI1 및 RING1B 단백질은 박테리아에서 잘 생성되며 수용성 분획에서 쉽게 추출될 수 있습니다. 도 1A는 GST-BMI1-RING1B 복합체의 전형적인 정제를 위한 쿠마시 블루 염색을 나타낸다. GST-BMI1 및 RING1B 대역은 각각 예상 분자량, ~45 kDa 및 ~13 kDa로 마이그레이션됩니다. 특히 E3 리가제 복합체는 매우 낮은 수준의 박테리아 단백질 오염 물질 및/또는 분해 산물로 매우 균일합니다. 더욱이, 정제된 복합체의 점치내측정은 1:1의 몰 비와 같이 최적이며, GST-RING1B 단백질의 밴드 강도는 BMI1보다 2~3배 더 강할 것으로 예상된다. 유사하게, His-BAP1/MBP-DEUBAD 복합체의 정제는 또한 각각 ~90 kDa 및 ~55 kDa에서 밴드와상대적으로 매우 균일한 제제를 초래하였다 (그림 1B). BAP1 .......
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토론
관심 있는 단백질에 대 한 강력한 시험관 내 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 어설션을 확립하는 몇 가지 장점이 있습니다. 이러한 분석에 사용할 수 있습니다: (i) 최적의 조건을 설정 하 고 이러한 반응에 대 한 최소한의 요구 사항을 정의, (ii) 효소 운동 및 생 화학 상수를 결정, (iii) 이러한 반응에 영향을 미칠 수 있는 공동 인자 또는 억제제의 역할을 정의, (iv) 상호 작용 인터페이스를 식별, (v) 인공 또는 질병 관련 돌연변이의 영향을 테스트하고 (vi) 더 높은 처리량 화학 스크리닝 분석을 개발하는 데 사용할 수있는 분석 조건을 설정합니다. 여기에서, 우리는 우리가 BMI1/RING1B 중재된 H2A 유비퀴틴화 및 BAP1/ASXL 중재된 H2A deubiquitination을 핵소체 기판에 어떻게 하는지 설명해서 이 계산을 예시합니다.
히스톤 H2A의 유비퀴틴은 최소한의 성분을 사용하여 시험관 내에서 재봉화될 수 있으며, H2A의 거의 완전한 유비퀴틴화는 BMI1.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
다이애나 아드자우드에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (2015-2020), 게놈 퀘벡 (2016-2019) 및 게놈 캐나다 (2016-2019)에서 E.B.A. E.B.B.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 레체 뒤 Québec-Santé의 수석 학자입니다. L.M과 N.S.K.는 FRQ-S에서 박사 학위를 취득했습니다. H.B는 고등 교육부와 튀니지 과학 연구와 콜 재단에서 박사 학위를 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아밀로스 아가로스 비즈 | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5mL 원심 필터 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | ||
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL 박테리아 | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| 빈 크로마토그래피 컬럼 | Biorad | #731-1550 | |
| 플래그 펩타이드 | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-아가로스 비드 | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| 이미다졸 | 시그마-알드리치 | #I5513 | |
| 미세코칼 뉴클레아제(MNase) | 시그마-알드리치 | #N3755 | |
| Ni-NTA 아가로스 비즈 | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-메틸말레이미드(NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| 기공 주사기 필터 0.45 μ m | Sarstedt | #83.1826 | |
| 폴리에틸레니민(PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6P2RBS-GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub 활성화 효소(UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
참고문헌
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews ....
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재인쇄 및 허가
