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Biochemistry

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

Abstract

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans diverses voies de signalisation et est notamment impliquée dans la coordination de la fonction de chromatine et des processus associés à l'ADN. Cette modification implique une action séquentielle de plusieurs enzymes, y compris E1 ubiquiitin-activation, E2 ubiquiitin-conjugué et E3 ubiquiitin-ligase et est inversée par deubiquitinases (DUBs). L'ubiquitination induit la dégradation des protéines ou l'altération de la fonction protéique, y compris la modulation de l'activité enzymatique, l'interaction protéine-protéine et la localisation subcellulaire. Une étape critique dans la démonstration de l'ubiquitination ou de la déubiquitination des protéines est d'effectuer des réactions in vitro avec des composants purifiés. Les réactions efficaces d'ubiquitination et de deubiquitination pourraient être grandement affectées par les différents composants utilisés, les cofacteurs enzymatiques, les conditions tampons et la nature du substrat.  Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer des réactions d'ubiquitination et de déubiquitination. Nous illustrons ces réactions en utilisant des composants minimes de la souris Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, et RING1B, une ligase d'ubiquitine E3 qui monoubiquitinates histone H2A sur la lysine 119. La deubiquitination de H2A nucléosomal est exécutée utilisant un complexe minimal de Deubiquitinase répressif de Polycomb (PR-DUB) formé par le BAP1 deubiquitinase humain et le domaine d'ADaptor de DEUBiquitinase (DEUBAD) de son co-facteur ASXL2. Ces essais d'ubiquitination/deubiquitination peuvent être effectués dans le contexte des nucléosomes recombinants reconstitués avec des protéines bactéries purifiées ou des nucléosomes indigènes purifiés à partir de cellules de mammifères. Nous soulignons les subtilités qui peuvent avoir un impact significatif sur ces réactions et nous proposons que les principes généraux de ces protocoles puissent être rapidement adaptés à d'autres ligases et deubiquitinases ubiquitine e3.

Introduction

L'ubiquitination est l'une des modifications post-traductionnelles les plus conservées et est essentielle pour une grande variété d'organismes, y compris la levure, les plantes et les vertébrés. L'ubiquitination consiste en l'attachement covalent de l'ubiquitine, un polypeptide d'acide aminé hautement conservé 76, pour cibler les protéines et se produit en trois étapes séquentielles impliquant trois enzymes, c'est-à-dire E1-activation, E2-conjugué et E3 ligase1, 2,3. Cette modification post-traductionnelle joue un rôle central dans un large éventail de processus biologiques. En effet, les ligases E3, qui fournissent la spécificité de la réaction, constituent une grande superfamille d'enzymes et sont les enzymes les plus abondantes du système d'ubiquitine4,5,6. Les effets en aval de l'ubiquitination des protéines dépendent de la nature de la modification : monoubiquitination, multi-monoubiquitination et polyubiquitination linéaire ou ramifiée. La monoubiquitination est rarement associée à la dégradation protéasomal, mais au lieu de cela cette modification est impliquée dans la médiation de divers événements de signalisation. La polyubiquitination implique le N-terminal ou les résidus de lysine dans la molécule d'ubiquitine elle-même, et le destin d'une protéine polyubiquitinated dépend de quel résidu est impliqué dans l'extension de la chaîne d'ubiquitine. On sait depuis longtemps que la polyubiquitination médiée par la lysine 48 de l'ubiquitine induit une dégradation protéasomale. Au contraire, la polyubiquitination par lysine 63 de l'ubiquitine est souvent associée à l'activation des protéines7,8,9. Semblable à d'autres modifications post-traductionnelles importantes, l'ubiquitination est réversible et l'élimination de l'ubiquitine des protéines est assurée par des protéases spécifiques appelées deubiquitinases (DUB), qui ont émergé comme régulateurs importants des processus cellulaires 2 (en) , 10. Fait important, de nombreux DUB sont hautement spécialisés, et régulent, par la déubiquitination, des substrats spécifiques, ce qui indique qu'un équilibre fin entre l'ubiquitination et la deubiquitination est essentiel pour la fonction protéique. Les E3 et les DUB, ainsi que les machines de dégradation protéasome et les facteurs accessoires, forment le système de protéasome d'Ubiquitin (UPS, avec les gènes de '1200) qui règle les voies de signalisation principales, dont plusieurs sont associées à la croissance et à la prolifération cellulaires, détermination du destin cellulaire, différenciation, migration cellulaire et mort cellulaire. Fait important, la déréglementation de plusieurs cascades de signalisation impliquant l'ubiquitination favorise la tumorigénèse et les maladies de neurodégénérescence5,11,12,13, 14.

L'ubiquitination joue un rôle omniprésent dans la biologie de la chromatine et les processus dépendants de l'ADN15,16,17. Par exemple, la monoubiquitination de l'histone H2A sur la lysine 119 (ci-après H2A K119ub) est une modification post-traduction essentielle impliquée dans la répression transcriptionnelle et la réparation de l'ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub est catalysé par le Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), qui joue un rôle clé dans le maintien de l'information épigénétique et est fortement conservé de Drosophila à l'homme. Canonical PRC1 est constitué notamment par le RING1B et BMI1, qui sont le complexe de base E3 ubiquitin ligase responsable de l'événement d'ubiquitination mentionné ci-dessus22,23. Dans Drosophila, La monoubiquitination H2A (H2A K118ub qui correspond à H2A K119ub chez les mammifères) est inversée par le DUB Calypso, qui interagit avec Le Comb sexuel supplémentaire (ASX) formant le polycomb-répressif DUB (PR-DUB) complexe24. L'ortholog mammifère de calypso, BAP1, est un suppresseur de tumeur supprimé ou inactivé dans diverses malignités humaines25,26,27,28, 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33. BAP1 régule les processus dépendants de l'ADN dans le noyau et l'apoptose à médiation calcique à l'endoplasmique33,34,35,36 ,36, 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 42. BAP1 assemble des complexes protéiques multi-subunit contenant des régulateurs de transcription notamment ASXL1, ASXL2 et ASXL3 (ASXLs), trois orthologues de l'ASX38,43. ASXLs utilisent le domaine DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), également appelé domaine ASXM, pour stimuler l'activité BAP1 DUB35,36,44. Par conséquent, ASXLs jouent des rôles importants en coordonnant l'activité DEB DEB de BAP1 à la chromatine et plus largement sa fonction de suppresseur de tumeur.

Plusieurs méthodes existent pour étudier les processus d'ubiquitination et de déubiquitination. Notamment, les essais biochimiques utilisant des protéines purifiées des bactéries restent très puissants en démontrant l'ubiquitination directe de, ou l'élimination de l'ubiquiitin de, substrats spécifiques. Ces expériences peuvent être menées pour étudier une gamme de paramètres tels que la détermination de l'exigence de complexes minimaux, la détermination des réactions cinétiques, la définition des relations structure/fonction, et la compréhension de l'impact des pathologies mutations génétiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour mener des réactions d'ubiquitination et de deubiquitination sur des substrats de chromatine avec des composants purifiés. En tant que système modèle, l'ubiquitination in vitro et la deubiquitination de la protéine nucléosomale H2A sont présentées. Les protéines purifiées par les bactéries assemblées dans des complexes minimaux de RING1B/BMI1 et BAP1/DEUBAD sont utilisées respectivement pour l'ubiquitination ou la déubiquitination du H2A nucléosomal.

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Protocol

1. Purification d'affinité GSH-agarose du complexe Gst-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase

  1. Utilisez le pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) bactéries expression construire pour transformer BL21 (DE3) bactéries (voir Tableau des matériaux)23. Cette construction permet l'expression du domaine ring1B murine 1-159 fusionné au domaine BMI1 1-109 avec l'étiquette de TPS dans l'épine dorsale pGEX-6P-2.
  2. Effectuer une culture de démarrage de nuit en inoculant rIL-bactéries exprimant GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109 aa) en 20 ml de bouillon LB moyen en présence de 10 'g/mL ampicillin et 50 'g/mL chloramphenicol. Incuber en secouant à 37 oC pendant la nuit. Le lendemain, ajouter la culture de démarrage à un flacon de 1 L contenant 500 ml de bouillon LB frais (1/26 dilution) avec de l'ampicilline et incuber la culture dans le shaker à 37 oC pendant 2 à 4 h.
  3. Pendant la période d'incubation, mesurez l'OD à 600 nm à l'avance à l'avance à l'avance d'un spectrophotomètre. Lorsque la culture des bactéries atteint 0,6 unité d'OD à 600 nm, prenez un aliquot de 1 ml dans un tube de 1,5 ml comme échantillon non induit. Ajoutez 400 M d'Isopropyl à D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture 1 L pour induire l'expression des protéines. Incuber les bactéries à 25 oC pendant 6 h jusqu'à la nuit.
    1. Centrifuger les aliquots de 1 ml à 14 000 x g pour 30 s, jeter le supernatant, resuspendre la pastille dans 200 l de tampon d'échantillon de Laemmli, et conserver pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie de l'induction de protéines.
  4. Transférer la culture bactérienne induite du flacon dans une bouteille de centrifugation propre et faire tourner vers le bas à 3 500 x g pendant 15 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille avec 40 ml de PBS froid et faire tourner vers le bas à 3 500 x g pendant 15 min à 4 oC.
  5. Jeter le supernatant et congeler la pastille à -80 oC ou passer à l'étape suivante. Si les protéines sont induites au poids moléculaire prévu, passez à l'étape suivante.
  6. Resuspendre la granule de bactéries dans 25 ml de tampon de lyse glacée A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, et 1/100 cocktail anti-protéase contenant AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, et Pepstatin A). Assurez-vous que toutes les bactéries granulés sont suspendus. Le PMSF et le cocktail anti-protéase doivent être fraîchement ajoutés au tampon de lyse, seulement au moment de la lyse bactérienne.
    MISE EN GARDE: Gardez toujours l'échantillon sur la glace.
    REMARQUE: Le lysozyme à 100 g/mL peut être ajouté pour améliorer la lyse bactérienne.
  7. Incuber la bactérie lysaiser sur la glace pendant 15 min. Utilisez un sonicateur de sonde et sonicate à 70% d'amplitude de sortie pour 30 s (4-5x), puis centrifugeuse à 21.000 x g pendant 20 min à 4 oC.
    MISE EN GARDE: Pendant la sonication, gardez toujours les échantillons sur la glace.
  8. Pendant la centrifugation, prenez 500 perles GSH-agarose emballées de 50l (50% de boue) dans un tube de 15 ml et ajoutez 10 ml de tampon A sans PMSF et anti-protéases. Mélanger brièvement et faire tourner à 2 500 g pendant 3 min à 4 oC, répéter cette étape de lavage deux fois de plus et garder les perles sur la glace.
  9. Après centrifugation bactérienne de lysate, recueillir le supernatant et le transférer dans un tube conique de 50 ml. Prenez un aliquot de 100 L comme lysate total et ajoutez 100 l de tampon d'échantillon 2x Laemmli pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie.
  10. Filtrer le lysate à travers un filtre à seringues de pores de 0,45 m et mélangez-le avec les perles GSH. Incuber à 4 oC en secouant pendant 5 h. Faites tourner les perles à 2 500 x g pendant 3 min, retirez et enregistrez le supernatant au fur et à mesure que le flux passe. Laver les protéines-GSH perles liées 6 fois (5 mL chacun) avec tampon A contenant cocktail anti-protéase et PMSF.
  11. Après le dernier lavage, transférer les perles avec 10 ml de tampon dans une colonne de chromatographie vide, ajouter 1,5 mL tampon A contenant 25 mM de glutathion, et de recueillir l'élution par gravité dans 1,5 mL microtubes. Répétez la procédure d'élution 4 fois.
    REMARQUE: La solution de stock de glutathion est préparée à 200 mM de concentration en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Prenez un aliquot de 10 L de chacune des 4 élutions et ajoutez 10 l de tampon d'échantillon 2x Laemmli. Ces échantillons seront utilisés pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie afin de déterminer la présence et la pureté des protéines purifiées.
    REMARQUE: Après la dernière élution, garder les perles dans un tampon à 4 oC pour le recyclage et l'utilisation future.
  13. Choisissez les fractions élucées montrant des quantités raisonnables de protéines purifiées pour une analyse plus approfondie. Faire de petits aliquots de la préparation. Conserver les protéines purifiées dans -80 oC. Habituellement, la concentration en protéines varie de 0,5 à 2 g par L et les échantillons peuvent être stockés dans cet état.
  14. EN OPTION: Concentrez l'échantillon ou modifiez la mémoire tampon à l'aide d'une unité de filtre centrifuge de 10 000

2. Purification du complexe BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase

  1. Utilisez pET30a-His-BAP138 et pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 constructions d'expression bactérienne pour transformer les bactéries BL21 (DE3) RIL pour la production de His-BAP1 et MBP-DEUBAD respectivement.
  2. Effectuer deux cultures de démarrage de nuit distinctes en incubant His-BAP1 et MBP-DEUBAD (ASXL2) exprimant des bactéries dans 20 ml de bouillon LB de milieu d'ampicilline contenant 50 g/mL de chloramphenicol et l'antibiotique correspondant pour chaque plasmide, 100 g/ mL de kanamycine ou 100 g/mL d'ampicilline respectivement. Placer sur le shaker à 37oC.
  3. Effectuer des étapes 1.3-1.6.
  4. Resuspendre les granulés bactériens dans 25 ml de tampon de lyse glacée B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM MM-Mercaptoethanol, 0,2 % Triton X-100, 1 mM PMSF et 1/100 cocktail anti-protéase). Mélanger les volumes égaux du His-BAP1 avec les lysates MBP-DEUBAD et incuber sur glace pendant 15 min. Sonicate, puis centrifuger le lysate comme indiqué dans le protocole 1 (étape 9).
    1. Pendant la centrifugation, préparez des perles d'agarose Ni-NTA emballées de 500 ll (50 % de lisier) en les lavant trois fois avec un tampon B sans PMSF et un cocktail anti-protéase.
  5. Après centrifugation bactérienne de lysate, recueillir le supernatant et le transférer dans un tube conique de 50 ml. Prenez un aliquot de 100 L comme lysate total et ajoutez 100 l de tampon d'échantillon 2x Laemmli pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie.
  6. Filtrer le lysate à travers un filtre à seringues de pores de 0,45 m et le mélanger avec les perles Ni-NTA. Incuber à 4 oC en secouant pendant 5 h. Faites tourner les perles à 2 500 x g pendant 3 min, retirez et enregistrez le supernatant au fur et à mesure que le flux passe.
    1. Laver les perles 6 fois (5 ml chacune) avec un tampon B contenant 20 mM 1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene (Imidazole).
      REMARQUE: Faire une solution de stock de 2 M imidazole au pH 7.3.
  7. Après le dernier lavage, transférer les perles avec 10 ml de tampon dans une colonne de chromatographie vide, ajouter 1 mL tampon B contenant 200 mM d'Imidazole et recueillir l'élution par gravité dans des microtubes de 1,5 mL contenant 10 TNT l (500 mL) et 2 L EDTA (500 mM , pH : 8). Répétez la procédure d'élution 4 fois. Prenez 10 L de chaque fraction d'élution et ajoutez 10 l de tampon d'échantillon 2x Laemmli pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie. Mettre en commun les fractions élucées désirées.
    REMARQUE: Gardez les perles dans un tampon à 4 oC pour le recyclage et l'utilisation future.
  8. Diluer le complexe élucidé 3 fois avec un tampon C (50 mM Tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, et 1/100 cocktail inhibiteur de la protéase) avant l'incubation avec les perles d'amylose agarose.
    1. Préparer les perles d'amylose agarose (500 l emballés) en les lavant 2 fois avec le tampon C sans ajouter de PMSF et de cocktail anti-protéase. Ajouter les perles à l'élution diluée et incuber toute la nuit à 4 oC.
  9. Centrifugeuse à 2 500 x g pendant 3 min et garder le débit à travers. Laver les perles protéiques avec 5 ml de tampon C (5 à 6x).
  10. Gardez le complexe purifié His-BAP1/MBP-DEUBAD sur les perles d'amylose agarose en tampon D (50 mM HEPES pH 8,0, 50 mM NaCl, 10% Glycerol, et 1 mM DTT) et entreposez à -80 oC. Prenez 20 ll de la fraction de perles (solution de perles à 50 %) et ajoutez 20 l de tampon d'échantillon 2x Laemmli pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie.

3. Purification des nucléosomes des cellules HEK293T

  1. Culture Les cellules HEK293T dans le milieu complet modifié de Dulbecco d'aigle (DMEM) complété avec le sérum nouveau-né de veau de 5% (NBS), 2 mM L-glutamine, et 1% pénicilline/streptomycine.
  2. Assiette autour de 12 x 106 cellules HEK293T dans 20 ml de support complet par plat de culture de 15 cm un jour avant la transfection (10 plats ont été utilisés). Avant la transfection, changer le milieu de la cellule à 12 ml de milieu sans sérum et transfect les cellules avec 21 g de pCDNA-Flag-H2A en utilisant 63 ol de polyéthylénimine (PEI) à 1 mg/mL36. Changer pour terminer le milieu 12 h plus tard.
  3. Trois jours après la transfection, lavez les cellules avec 15 ml de PBS glacé (deux fois) et récoltez-les dans 3 ml de PBS glacé à l'aide d'un grattoir cellulaire. Centrifugeuse à 2 100 x g pendant 8 min à 4 oC. Jeter le PBS et procéder à l'étape de lyse ou de congeler la pastille cellulaire à -80 oC.
  4. Resuspendre la pastille cellulaire dans environ 10 volumes de tampon E (50 mM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1/100 cocktail inhibiteur de la protéase, et 20 mM de N-méthylmaleimide (NEM)) et incubé sur glace pour 20 min. N-méthylmaleimide (NEM) est essentiel pour inhiber les DUB qui co-purifient avec les nucléosomes.
  5. Après centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min, jetez le supernatant et suspendez la boulette de chromatine en 10 volumes de tampon E. Mélanger par inversion et centrifugeuse à 3 000 x g pendant 5 min.
    1. Répétez l'étape de lavage une autre fois en utilisant le tampon E et deux fois en utilisant le tampon F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,3 M sucrose, 0,1% NP-40, 1 mM PMSF, et 1/100 protease inhibitor cocktail).
      CAUTION : Les pellets flotteront pendant les lavages et la centrifugation.
  6. Resuspendre la chromatine en tampon F de 5 ml et traiter la pastille avec de la nucléase micrococcique (MNase) (3 U/mL pendant 10 min à température ambiante).
    REMARQUE: La réaction peut être facilitée en mélangeant à l'aide d'un Homogénéisateur Dounce.
  7. Après l'incubation, prendre un aliquot de 40 L du mélange pour l'analyse des fragments d'ADN nucléosomal. Mélanger cet aliquot avec 40 oL de phénol/chloroforme et 20 l de tampon de chargement d'ADN 6x, vortex, tourner à 18 000 x g pendant 2 min, et charger l'ADN sur un gel agarose de 2 %.
    1. Lorsque l'ADN est principalement un fragment de 147 pb correspondant aux mononucléosomes, arrêter la réaction en ajoutant 5 mM EDTA à la concentration finale.
  8. Après centrifugation à 21 000 x g pendant 20 min à 4 oC, incuber la fraction soluble de chromatine avec de la résine anti-flagependante pendant la nuit à 4 oC. Laver les perles avec 6x Buffer G (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 aspirateurs à protéase cocktail).
  9. Transférer les perles avec un tampon G de 5 ml dans une colonne de chromatographie vide. Éluter les nucléosomes liés aux perles avec 200 g/mL de peptide d'élution de drapeau. Utilisez un tampon d'élution composé d'un tampon G contenant 200 peptides d'élution du drapeau (voir Tableau des matériaux)et 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8,0. Élifier les nucléosomes 3x avec 260 'L Drapeau elution Buffer (2 h chaque élution).
  10. Testez les 3 élutions en prenant un aliquot pour l'extraction de phénol-chloroforme et chargez l'ADN dans un gel agarose de 2%. Prenez 10 L de chaque fraction d'élution et ajoutez 10 l de tampon d'échantillon Laemmli 2x pour l'analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie et chargez chaque élution pour la détection western Blot de H2A ubiquitinated. Conserver l'élution à -80 oC. En général, la purification des cellules humaines produit moins de protéines que celle des bactéries, avec des concentrations allant de 0,1 à 0,5 g/L.

4. Analyse de l'ubiquitination nucléosome à l'aide de BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Centrifugeles les nucléosomes à travers 10K pore 0.5 mL filtres centrifuges pour changer le substrat de la mémoire tampon d'élution à la réaction tampon H (25 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl2, et 5 mM ATP). Alternativement, les nucléosomes disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour l'analyse.
    REMARQUE: La modification de la solution de suspension du substrat en mémoire tampon de réaction assure la reproductibilité et empêche l'inhibition potentielle de la ligase E3 par les composés présents dans le mélange d'élution du drapeau.
  2. Incuber 1 g des nucléosomes dans 40 'L volume total de tampon H. Ajouter l'enzyme ub Activating (UBE1) (250 ng), l'Ub (50 ng/L) et les enzymes conjuguantes E2 Ub (672 ng), et 1 g de complexe de ligase d'ubiquitine BMI1/RING1B E3. Incuber la réaction pendant 3 h à 37 oC avec des secousses occasionnelles.
    REMARQUE: Plusieurs contrôles peuvent être effectués en parallèle, y compris l'omission, E1, E2, E3, ATP et ubiquitine. Cela assure la spécificité de la réaction d'ubiquitination.
  3. Arrêtez la réaction en ajoutant 40 L de tampon d'échantillon 2x Laemmli et d'analyser l'ubiquitination histone H2A K119 par SDS-PAGE et le ballonnement occidental, selon les procédures standard. Utiliser des anticorps anti-H2A ou anti-H2A K119ub (voir tableau des matériaux).

5. In Vitro Nucleosomal H2A DUB Assay Utilisation BAP1/DEUBAD

  1. Utilisez les nucléosomes purifiés pour l'in vitro deubiquitination test. Resuspendre 100 à 500 ng de nucléosomes dans un tampon I de 40 mL (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 1 mM MgCl2, 50 mM NaCl et 1 mM DTT). Ajouter 1 g de sa bactérie BAP1 purifiée His-BAP1 et MBP-DEUBAD. Effectuer la réaction de deubiquitination pendant 3 h à 37 oC avec des secousses occasionnelles.
  2. Arrêtez la réaction in vitro en ajoutant 40 l de tampon 2x Laemmli et analysez par immunoblotting.

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Representative Results

Les protéines GST-BMI1 et RING1B sont bien produites par les bactéries et peuvent être facilement extraites dans la fraction soluble. La figure 1A montre une coloration bleue Coomassie pour une purification typique du complexe GST-BMI1-RING1B. Les bandes GST-BMI1 et RING1B migrent au poids moléculaire prévu, soit 45 kDa et 13 kDa respectivement. Notamment le complexe de ligase E3 est très homogène avec de très faibles niveaux de bactéries protéines contaminants et / ou des produits de dégradation. De plus, la stoichiométrie du complexe purifié est optimale, car avec un rapport molaire de 1:1, on s'attend à ce que l'intensité de la bande de la protéine GST-RING1B soit deux à trois fois plus forte que celle de l'IMC1. De même, la purification du complexe His-BAP1/MBP-DEUBAD a également donné lieu à des préparations relativement très homogènes avec des bandes à 90 kDa et 55 kDa, respectivement (figure 1B). La purification d'affinité en tandem de BAP1 et DEUBAD, par nickel-agarose et amylose-agarose respectivement assure et stoichiométrie adéquate et le retrait de BAP1 libre du complexe purifié. D'autre part, la fraction nucléosomal purifiée est essentiellement composée par la bande 147bp indiquant la présence de fraction mononucléosomal fortement enrichie (figure 1C). La coloration bleue de Coomassie de ces nucléosomes purifiés montre un modèle typique de bande des quatre sous-unités histones avec des quantités stoichiométriques (figure 1D). Les mononucléosomes recombinants disponibles dans le commerce présentent également des modèles similaires de protéines et d'ADN lorsqu'ils migrent sur les gels SDS-PAGE et agarose respectivement. Il convient de noter que les formes monoubiquitinated de H2A et de Flag-H2A peuvent être facilement distinguées sur les nucléosomes PURifiés HEK293T. Nous avons utilisé des nucléosomes recombinants avec E1/E2/Ubiquitin/ATP et avons observé que l'ubiquitination de l'histone H2A avec le complexe BMI1-RING1B montre une augmentation dépendante du temps de la forme ubiquitinated de la protéine, alors que les niveaux de la forme non modifiée sont en même temps diminué. La réaction d'ubiquitination est totale, car pratiquement toutes les protéines H2A sont transformées en H2A K119ub (Figure 1E). D'autre part, l'étude de deubiquitination a été effectuée sur des nucléosomes indigènes. Après l'incubation de ces nucléosomes avec BAP1/DEUBAD, nous avons observé une réduction dépendante du temps du signal H2A K119ub (figure 1F). Notez que deux bandes de H2A ubiquitinated observées avec anti-H2A K119ub correspondent à des bandes transfected Flag-H2A et endogène H2A migrant à 30 kDa et 25 kDa bandes respectivement.

Figure 1
Figure 1 : Purification, ubiquitination et déubiquitination. (A) Purification des protéines GST-RING1B-BMI1 et analyse à l'aide de taches bleues Coomassie. Gst-RING1B-BMI1 ont été produits dans des bactéries et purifiés à l'aide de perles d'affinité avec la TPS. Pour confirmer la pureté de purification et la taille des protéines, les élutions ont été chargées sur 15% de gel SDS-PAGE et tachées de bleu Coomassie. Différentes quantités de BSA sont utilisées pour déterminer la quantité de protéines. Le gel taché a été numérisé pour générer la figure. (B) Purification du complexe MBP-DEUBAD/His-BAP1. MBP-DEUBAD et HIS-BAP1 ont été produits séparément dans les bactéries. Après lyse, MBP-DEUBAD et HIS-BAP1 ont été mélangés et purifiés à l'aide de perles de nickel et de maltose. Le complexe purifié a été chargé sur le gel SDS-PAGE de 8% et taché de bleu Decoomassie. (C) Purification du mononucléosome après le traitement de MNase. Chromatin de HEK293T exprimant pcDNA.3 Flag-H2A a été extrait et traité avec MNase pour générer et purifier des mononucléosomes. Pour confirmer la génération de mononucléosome, une fraction de chromatine a été prise pour l'extraction et la détection de chloroforme de phénol sous la lumière UV. Le chargement sur le gel d'agarose de 2% indique un fragment typique de 147 de base-paire d'ADN indicatif du mononucléosome. (D) Les mononucléosomes purifiés ont été utilisés pour la coloration bleue de Coomassie. (E) Ubiquitination in vitro des nucléosomes. Les nucléosomes recombinants ont été incubés à 37 oC avec le dimère d'ubiquitin e3, GST-RING1B/BMI1 et E1/E2/ATP/Ubiquitin, pour les temps indiqués. La monoubiquitination H2A (H2A K119ub) a été analysée par le ballonnement occidental. (F) Analyse de la déubiquitination de H2A K119ub à l'aide du complexe deubiquitinase BAP1/DEUBAD. Des essais de déubiquitination in vitro ont été effectués à l'aide de bactéries purifiées His-BAP1/MBP-DEUBAD et de nucléosomes purifiés de mammifères. Des réactions ont été faites pour les temps d'accusation et analysées par le blottissement occidental. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Contrôles et aperçu du protocole. (A) Les mammifères purifiés BAP1 ou son mutant mort catalytique (C91S) ainsi que le BAP1 recombinant purifié par les bactéries ont été utilisés pour la désuquitination H2A sur les nucléosomes. Les nucléosomes incubés avec un tampon seul ou avec des élutions obtenues à partir de la purification simulée ont également été inclus comme contrôles. (B) BAP1 ne deubiquitinate H2A K13/K15 dont l'ubiquitination est médiatisée par La LigaE RNF168. Les cellules HEK293T ont été co-transfectées avec H2A K13R/K15R ou H2A K118R/K119R ainsi que RNF168 pour assurer l'ubiquitination sur les résidus K13/K15. Les nucléosomes purifiés ont été employés pour la deubiquitination par les complexes BAP1. La réaction a été arrêtée à différents points de temps et soumise à l'immunoblotting. (C) Purification de DEUBAD non-ubiquitinated et monoubiquitinated dans le complexe avec BAP1 des cellules mammifères. Le complexe purifié a été utilisé pour l'analyse de la deubiquitination sur le h2A K119ub nucléosomal. Des réactions ont été faites pour les points de temps indiqués et analysées par le ballonnement occidental. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. Les cellules HEK293T ont été co-transfectées avec des mutants H2A ou H2A (H2A K118R, K119R, K118R/K119R ou K13R/K15R) avec les constructions BAP1 et ASXL2. Deux jours après la transfection, des cellules ont été moissonnées pour l'immunoblotting utilisant les anticorps indiqués. (E) Représentation schématique du flux de travail expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Il y a plusieurs avantages d'établir l'ubiquitination in vitro robuste et les essais de deubiquitination pour des protéines d'intérêt. Ces essais peuvent être utilisés pour : (i) établir des conditions optimales et définir l'exigence minimale pour ces réactions, (ii) déterminer les constantes cinétiques et biochimiques enzymatiques, (iii) définir les rôles des cofacteurs ou des inhibiteurs qui peuvent avoir un impact sur ces réactions, (iv) identifier les interfaces d'interaction, (v) tester l'impact des mutations artificielles ou associées à la maladie et (vi) établir des conditions d'analyse qui peuvent être utilisées pour développer des tests de dépistage chimiques à haut débit. Ici, nous exemplifions ces essais en décrivant comment nous effectuons l'ubiquitination H2A à médiation BMI1/RING1B et la deubiquitination H2A à médiation BAP1/ASXL sur les substrats nucléosomal.

L'ubiquitination de l'histone H2A peut être récapitulée in vitro à l'aide de composants minimes, comme l'ubiquitination presque complète de H2A peut être observée à l'aide du complexe BMI1-RING1B. Il est à noter que cette réaction est menée sur des nucléosomes recombinants. Ceux-ci ont l'avantage d'être exempts d'autres histones modifications post-traduction qui se produisent dans les cellules de mammifères. Néanmoins, la réaction d'ubiquitination peut également être conduite efficacement sur les nucléosomes indigènes. Si la réaction d'ubiquitination est faible, le rapport des enzymes par rapport aux substrats peut être augmenté pour observer la ligature optimale d'ubiquiitin. Il convient de noter que si des réactions de deubiquitination ou des essais d'interaction doivent être effectués après l'ubiquitination du substrat, l'ubiquitination peut être menée directement sur des substrats liés aux perles. Le substrat ubiquitited peut être récupéré par traction vers le bas et le supernatant contenant les composants de la réaction d'ubiquitination peut être jeté. Cependant, quand des caractéristiques enzymatiques doivent être établies, les enzymes doivent être élucées et la stoichiométrie des composants évalués par chromatographie d'exclusion de taille.

La réaction de deubiquitination exige moins de composants que la réaction d'ubiquitination. Cependant, la purification du DEUBAD seul conduit généralement à des précipitations protéiques. Surtout, lorsque le DEUBAD est purifié avec BAP1, cela augmente considérablement sa solubilité. Il convient de noter que nous suggérons de procéder à des essais de deubiquitination avec diverses quantités du substrat et du complexe enzymatique. La réaction de deubiquitination peut être inhibée par des quantités excessives de chromatine, qui peut probablement être expliquée par des concentrations accrues d'inhibiteurs associés aux nucléosomes. Nous avons également observé la deubiquitination avec l'excès de BAP1 libre. Ainsi, plusieurs contrôles doivent être inclus tels que l'incubation des nucléosomes avec BAP1 seul (Figure 2A). Il est également important de noter que certains DUB pourraient co-purifier avec la chromatine, et même si nous traitons la chromatine avec NEM, LES DUB pourraient être partiellement réactivés après l'ajout de la TNT qui réduit la cystéine catalytique. En outre, les DUB de metalloproteinase pourraient également être présents, et ces enzymes sont insensibles à NEM et ne sont donc pas inhibées. Par conséquent, des contrôles supplémentaires devraient être inclus composé uniquement de nucléosomes sans ajouter d'enzymes et de mutant mort catalytique DUB (Figure 2A). Il convient de noter que la spécificité de l'activité DUB BAP1 vers H2A K119ub est bien documentée et a été validée dans nos conditions d'essais. Nous avons purifié à partir de nucléosomes de cellules de HEK293T exprimant h2A K118/K119R ou H2A K13/K15R. L'expression de RNF168 conduit à une ubiquitination importante sur K13/K15. L'activité BAP1 DUB n'est observée que sur les nucléosomecontenants contenant H2A K13/K15R correspondant à H2A K119ub (Figure 2B). Une autre considération est que les modifications post-traductionnelles qui peuvent être critiques pour l'activité enzymatique ne sont probablement pas présentes dans les protéines bactériennes. Ainsi, les réactions in vitro à l'aide de composants purifiés à partir de cellules de mammifères pourraient également être considérées comme35. Par exemple, la monoubiquitination de DEUBAD, un processus observé chez les eucaryotes plus élevés, favorise grandement l'activité deubiquitinase de BAP135 (Figure 2C). Ainsi, la purification des composants des cellules de mammifères pourrait également être envisagée. En plus des réactions in vitro, il est possible de surveiller l'activité DUB BAP1 directement dans les cellules après la transfection. Par exemple, la transfection des cellules HEK293T avec la construction H2A peut donner un signal clair de H2A K119ub en raison de son abondance dans les cellules. Dans ces conditions, la majeure partie de l'ubiquitination se produit sur les résidus K118/K119, comme la mutation de ces sites à l'arginine conduire à l'absence complète de l'ubiquitination H2A (Figure 2D). Co-expression BAP1 et ASXL2 avec H2A permet de conclure sur l'activité BAP1 DUB dans les cellules. Cependant, plusieurs points doivent être considérés comme une surexpression peut conduire à des résultats erronés. Ces expériences doivent donc être optimisées et bien contrôlées.

En résumé, les protocoles décrits ici, récapitulés à la figure 2E, sont simples, ne nécessitent pas d'infrastructure spécialisée ou d'installation expérimentale, et peuvent être mis à l'échelle pour produire des quantités substantielles de nucléosomes modifiés pour plusieurs applications en aval, y compris les essais enzymatiques, la spectrométrie de masse et les essais d'interaction protéine-protéine.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions Diana Adjaoud pour son assistance technique. Ces travaux ont été appuyés par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (2015-2020), de Génome Québec (2016-2019) et de Génome Canada (2016-2019) à E.B.A. E.B.A. est chercheur principal au Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M et N.S.K. ont une bourse de doctorat du FRQ-S. H.B a obtenu une bourse de doctorat du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique de Tunisie et de la Fondation Cole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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References

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