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Biochemistry

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

Abstract

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in verschiedenen Signalwegen spielt und insbesondere an der Koordination von Chromatinfunktion und DNA-assoziierten Prozessen beteiligt ist. Diese Modifikation beinhaltet eine sequenzielle Wirkung mehrerer Enzyme, einschließlich E1-Ubiquitin-aktivierend, E2-Ubiquitin-konjugating und E3-Ubiquitin-Ligase und wird durch Deubiquitinasen (DUBs) umgekehrt. Ubiquitination induziert Abbau von Proteinen oder Veränderung der Proteinfunktion einschließlich Modulation der enzymatischen Aktivität, Protein-Protein-Interaktion und subzelluläre Lokalisierung. Ein entscheidender Schritt beim Nachweis der Proteinubiquitination oder Deubiquitination ist die Durchführung von In-vitro-Reaktionen mit gereinigten Komponenten. Effektive Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen könnten stark durch die verschiedenen verwendeten Komponenten, Enzym-Co-Faktoren, Pufferbedingungen und die Art des Substrats beeinflusst werden.  Hier bieten wir Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen. Wir veranschaulichen diese Reaktionen mit minimalen Komponenten der Maus Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 und RING1B, einer E3-Ubiquitinligase, die Denton H2A auf Lysin 119 monoubiquitiniert. Die Deubiquitination von nukleosomaler H2A erfolgt mit einem minimalen Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) Komplex, der durch die menschliche Deubiquitinase BAP1 und die DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) Domäne seines Co-Faktors ASXL2 gebildet wird. Diese Ubiquitination/Deubiquitination Assays können im Kontext entweder rekombinanter Nukleosomen durchgeführt werden, die mit bakteriellen gereinigten Proteinen oder einheimischen Nukleosomen, die aus Säugetierzellen gereinigt werden, rekonstituiert wurden. Wir weisen auf die Feinheiten hin, die einen erheblichen Einfluss auf diese Reaktionen haben können, und schlagen vor, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Protokolle rasch an andere E3-Ubiquitinligasen und Deubiquitinasen angepasst werden können.

Introduction

Ubiquitination ist eine der am besten erhaltenen post-translationalen Modifikationen und ist entscheidend für eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Hefe, Pflanzen und Wirbeltiere. Ubiquitination besteht aus der kovalenten Anhaftung von Ubiquitin, einem hochkonservierten 76-Aminosäure-Polypeptid, an Zielproteinen und erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten mit drei Enzymen, d.h. E1-aktivierend, E2-konjugierend und E3-Ligase1, 2,3. Diese posttranslationale Modifikation spielt eine zentrale Rolle in einem breiten Spektrum biologischer Prozesse. Tatsächlich bilden die E3-Ligasen, die die Spezifität der Reaktion liefern, eine große Überfamilie von Enzymen und sind die am häufigsten vorkommenden Enzyme des Ubiquitinsystems4,5,6. Die nachgelagerten Wirkungen der Proteinubiquitination hängen von der Art der Modifikation ab: Monoubiquitination, Multimonoubiquitination und lineare oder verzweigte Polyubiquitination. Monoubiquitination ist selten mit proteasomaler Degradation verbunden, aber stattdessen ist diese Modifikation bei der Vermittlung verschiedener Signalereignisse beteiligt. Polyubiquitination beinhaltet das N-Terminal oder die Lysin-Rückstände im Ubiquitin-Molekül selbst, und das Schicksal eines polyubiquitinierten Proteins hängt davon ab, welche Rückstände an der Ubiquitin-Kettenverlängerung beteiligt sind. Es ist seit langem bekannt, dass Polyubiquitination durch Lysin 48 von Ubiquitin vermittelt proteasomal Abbau induziert. Im Gegenteil, Polyubiquitination über Lysin 63 von Ubiquitin ist oft mit Proteinaktivierungassoziiert 7,8,9. Ähnlich wie bei anderen wichtigen posttranslationalen Modifikationen ist die Ubiquitination reversibel und die Ubiquitinentfernung von Proteinen wird durch spezifische Proteasen, die als Deubiquitinasen (DUBs) bezeichnet werden, gewährleistet, die sich als wichtige Regulatoren zellulärer Prozesse herauskristallisiert haben. 2 , 10. Wichtig ist, dass viele DUBs hochspezialisiert sind und durch Deubiquitination spezifische Substrate regulieren, was darauf hindeutet, dass ein feines Gleichgewicht zwischen Ubiquitination und Deubiquitination für die Proteinfunktion entscheidend ist. E3s und DUBs bilden zusammen mit den Proteasomenabbaumaschinen und Zubehörfaktoren das Ubiquitin Proteasome System (UPS, mit >1200 Genen), das wichtige Signalwege reguliert, von denen einige mit Zellwachstum und -proliferation verbunden sind, Zellschicksalsbestimmung, Differenzierung, Zellmigration und Zelltod. Wichtig ist, dass die Deregulierung mehrerer Signalkaskaden mit Ubiquitination Tumorgenese und Neurodegenerationerkrankungen5,11,12,13 , 14.

Ubiquitination spielt eine allgegenwärtige Rolle in der Chromatinbiologie und DNA-abhängigen Prozessen15,16,17. Zum Beispiel ist die Monoubiquitination des Histones H2A auf Lysin 119 (im Folgenden H2A K119ub) eine kritische posttranslationale Modifikation, die an der Transkriptionsrepression und DNA-Reparatur beteiligt ist18,19,20, 21,22. H2A K119ub wird durch den Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) katalysiert, der eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung epigenetischer Informationen spielt und von Drosophila bis zum Menschen hochkonserviert ist. Canonical PRC1 besteht insbesondere aus dem RING1B und BMI1, die der Kern Komplex E3 ubiquitin ligase sind, der für das oben erwähnte Ubiquitinationsereignis22,23verantwortlich ist. In Drosophilawird die H2A-Monoubiquitination (H2A K118ub, die H2A K119ub bei Säugetieren entspricht) durch den DUB Calypso umgekehrt, der mit Additional Sex Comb (ASX) interagiert und den Polycomb-repressiven DUB (PR-DUB) Komplexbildet 24. Der Säugetierortholog von calypso, BAP1, ist ein Tumorsuppressor, der bei verschiedenen menschlichen Malignomen gelöscht oder inaktiviert wurde25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguliert DNA-abhängige Prozesse im Zellkern und Calcium-Signal-vermittelte Apoptose am endoplasmatischen Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 montiert Multi-Subunit-Proteinkomplexe, die Transkriptionsregler, insbesondere ASXL1, ASXL2 und ASXL3 (ASXLs), drei Orthologues von ASX38,43enthalten. ASXLs verwenden die Domäne DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), auch ASXM-Domäne, um die BAP1 DUB-Aktivität35,36,44zu stimulieren. Daher spielen ASXLs eine wichtige Rolle bei der Koordination der BAP1 DUB-Aktivität bei Chromatin und allgemeiner seiner Tumorsuppressorfunktion.

Es gibt mehrere Methoden, um Ubiquitination und Deubiquitination Prozesse zu studieren. Insbesondere biochemische Assays mit Proteinen, die von Bakterien gereinigt werden, sind nach wie vor sehr mächtig, wenn es um die direkte Ubiquitinierung oder Entfernung von Ubiquitin aus bestimmten Substraten geht. Diese Experimente können durchgeführt werden, um eine Reihe von Parametern zu untersuchen, wie z. B. die Bestimmung der Anforderung von minimalen Komplexen, die Bestimmung der Reaktionskinetik, die Definition von Struktur-/Funktionsbeziehungen und das Verständnis der Auswirkungen pathologischer Genmutationen. Hier bieten wir Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen auf Chromatinsubstraten mit gereinigten Komponenten. Als Modellsystem wird in vitro Ubiquitination und Deubiquitination von nukleosomalem H2A-Protein vorgestellt. Bakteriengereinigte Proteine, die in minimalen Komplexen von RING1B/BMI1 und BAP1/DEUBAD zusammengesetzt sind, werden zur Ubiquitination bzw. Deubiquitination von nukleosomalem H2A verwendet.

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Protocol

1. GSH-Agarose Affinitätsreinigung des GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Verwenden Sie das PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) Bakterienexpressionkonstrukt, um BL21 (DE3) Bakterien zu transformieren (siehe Tabelle der Materialien)23. Dieses Konstrukt ermöglicht die Expression der murinen RING1B-Domäne 1-159, die mit der BMI1-Domäne 1-109 mit GST-Tag im pGEX-6P-2-Backbone verschmolzen wird.
  2. Führen Sie eine Nacht-Starterkultur durch Impfung von RIL-Bakterien, die GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) in 20 ml LB-Brühenmedium in Gegenwart von 100 g/ml Ampicillin und 50 g/ml Chloramphenicol exokulieren. Durch Schütteln bei 37 °C über Nacht bebrüten. Am nächsten Tag die Starterkultur zu einem 1 L Kolben mit 500 ml frischem LB-Brühemedium (1/26 Verdünnung) mit Ampicillin hinzufügen und die Kultur im Shaker bei 37 °C für 2 bis 4 h bebrüten.
  3. Messen Sie während der Inkubationszeit die OD bei 600 nm mit einem Spektralphotometer. Wenn die Bakterienkultur 0,6 OD-Einheiten bei 600 nm erreicht, nehmen Sie ein 1 ml Aliquot in einem 1,5 ml-Rohr als nicht induzierte Probe. Fügen Sie der 1 L-Kultur 400 M Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren. Bakterien bei 25 °C für 6 h bis über Nacht inkubieren.
    1. Zentrifugieren Sie die 1 ml Aliquots bei 14.000 x g für 30 s, entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in 200 l Laemmli-Probenpuffer wieder auf und halten Sie für SDS-PAGE und Coomassie blaue Analyse der Proteininduktion.
  4. Die induzierte Bakterienkultur aus dem Kolben in eine saubere Zentrifugationsflasche geben und bei 3.500 x g 15 min bei 4 °C abdrehen. Den Überstand entsorgen und das Pellet mit 40 ml kaltem PBS wieder aufhängen und bei 3.500 x g 15 min bei 4 °C nach unten drehen.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bei -80 °C ein oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Proteine mit dem erwarteten Molekulargewicht induziert werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
  6. Das Bakterienpellet in 25 ml eiskaltem Lysepuffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT und 1/100 Anti-Protease-Cocktail mit AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin und Pepstatin A). Stellen Sie sicher, dass alle Bakterienpellets resuspendiert werden. PMSF und Anti-Protease-Cocktail müssen erst zur Zeit der Bakterienlyse frisch in den Lysepuffer aufgenommen werden.
    ACHTUNG: Halten Sie die Probe immer auf Eis.
    HINWEIS: Lysozym kann bei 100 g/ml zugegeben werden, um die Bakterienlyse zu verbessern.
  7. Inkubieren Sie die Bakterien 15 min auf Eis. Verwenden Sie einen Sondenbeschalltosonicator und beschallen Sie bei 70% Ausgangsamplitude für 30 s (4–5x), und zentrifugieren Sie dann bei 21.000 x g für 20 min bei 4 °C.
    ACHTUNG: Während der Beschallung, halten Sie immer die Proben auf Eis.
  8. Während der Zentrifugation 500 l verpackte GSH-Agarose-Perlen (50% Gülle) in einem 15 ml-Rohr einnehmen und 10 ml Puffer A ohne PMSF und Antiproteasen hinzufügen. Kurz mischen und bei 2.500 g 3 min bei 4 °C drehen, diesen Waschschritt noch zwei Mal wiederholen und die Perlen auf Eis halten.
  9. Nach der bakteriellen Lysatzentrifugation den Überstand sammeln und in ein 50 ml konisches Rohr geben. Nehmen Sie ein Aliquot von 100 L als Gesamtlysat und fügen Sie 100 L 2x Laemmli Probenpuffer für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzu.
  10. Filtern Sie das Lysat durch 0,45 m Porenspritzenfilter und mischen Sie es mit den GSH-Perlen. Bei 4 °C mit Schütteln für 5 h inkubieren. Die Perlen bei 2.500 x g 3 min abdrehen, entfernen und den Überstand beim Durchfließen speichern. Waschen Sie die Protein-GSH gebundenen Perlen 6 mal (je 5 ml) mit Puffer A mit Anti-Protease-Cocktail und PMSF.
  11. Nach der letzten Wäsche die Perlen zusammen mit 10 ml Puffer in eine leere Chromatographiesäule geben, 1,5 ml Puffer A mit 25 ml Glutathion hinzufügen und die Elution durch Schwerkraft in 1,5 ml Mikroröhren sammeln. Wiederholen Sie den Elution-Vorgang 4 Mal.
    HINWEIS: Glutathion-Stammlösung wird bei 200 mM Konzentration in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Nehmen Sie aus jeder der 4 Elutionen ein Aliquot von 10 l und fügen Sie 10 L 2x Laemmli-Probenpuffer hinzu. Diese Proben werden für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse verwendet, um das Vorhandensein und die Reinheit der gereinigten Proteine zu bestimmen.
    HINWEIS: Halten Sie die Perlen nach der letzten Elution bei 4 °C für das Recycling und die zukünftige Verwendung im Puffer.
  13. Wählen Sie die eluierten Fraktionen mit angemessenen Mengen an gereinigten Proteinen für die weitere Analyse. Machen Sie kleine Aliquots der Vorbereitung. Bewahren Sie die gereinigten Proteine in -80°C auf. In der Regel liegt die Proteinkonzentration zwischen 0,5 und 2 g pro L und Proben können in diesem Zustand gelagert werden.
  14. OPTIONAL: Konzentrieren Sie die Probe oder wechseln Sie puffer mit einer 10K Zentrifugalfiltereinheit

2. Reinigung des DEubiquitinase-Komplexes BAP1/DEUBAD (ASXL2)

  1. Verwenden Sie pET30a+-His-BAP138 und pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 bakterielle Expressionskonstrukte, um BL21 (DE3) RIL-Bakterien für die Produktion von His-BAP1 bzw. MBP-DEUBAD zu transformieren.
  2. Führen Sie zwei getrennte Nachtstarterkulturen durch Inkubation von His-BAP1 und MBP-DEUBAD (ASXL2) aus, die Bakterien in 20 ml LB-Brühe von Ampicillinmedium mit 50 g/ml Chloramphenicol und dem entsprechenden Antibiotikum für jedes Plasmid, 100 g/ mL von Kanamycin bzw. 100 g/ml Ampicillin. Auf Shaker bei 37°C legen.
  3. Führen Sie die Schritte 1.3–1.6 aus.
  4. Die Bakterienpellets in 25 ml eiskaltem Lysepuffer B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM -Mercaptoethanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF und 1/100 Anti-Protease-Cocktail) wieder aufsetzen. Gleiche Volumina des His-BAP1 mit den MBP-DEUBAD-Lysaten mischen und 15 min auf Eis brüten. Das Lysat wie in Protokoll 1 (Schritt 9) angegeben zentrisieren und dann zentrifugieren.
    1. Während der Zentrifugation 500 l verpackte Ni-NTA-Agaroseperlen (50% Gülle) zubereiten, indem Sie sie dreimal mit Puffer B ohne PMSF und Anti-Protease-Cocktail waschen.
  5. Nach der bakteriellen Lysatzentrifugation den Überstand sammeln und in ein 50 ml konisches Rohr geben. Nehmen Sie ein Aliquot von 100 L als Gesamtlysat und fügen Sie 100 L 2x Laemmli Probenpuffer für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzu.
  6. Filtern Sie das Lysat durch 0,45 m Porenspritzenfilter und mischen Sie es mit den Ni-NTA-Perlen. Bei 4°C mit Schütteln für 5 h inkubieren. Die Perlen bei 2.500 x g 3 min nach unten drehen, entfernen und den Überstand als Durchfluss speichern.
    1. Waschen Sie die Perlen 6 mal (je 5 ml) mit Puffer B mit 20 mM 1,3-Diaza-2,4-Cyclopentadien (Imidazol).
      HINWEIS: Machen Sie eine Lagerlösung von 2 M Imidazol bei pH 7,3.
  7. Nach der letzten Wäsche die Perlen mit 10 ml Puffer in eine leere Chromatographiesäule geben, 1 ml Puffer B mit 200 mM Imidazol hinzufügen und die Elution durch Schwerkraft in 1,5 ml Mikroröhren mit 10 l DTT (500 mM) und 2 x L EDTA (500 mM) , pH:: 8). Wiederholen Sie den Elutionsvorgang 4 Mal. Nehmen Sie 10 l jeder Elutionsfraktion und fügen Sie 10 l 2x Laemmli Probenpuffer für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzu. Die gewünschten eluierten Fraktionen bündeln.
    HINWEIS: Halten Sie die Perlen bei 4 °C für das Recycling und die zukünftige Verwendung im Puffer.
  8. Verdünnen Sie den eluierten Komplex 3 mal mit Puffer C (50 mM Tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF und 1/100 Protease-Hemmer-Cocktail) vor der Inkubation mit den Amylose-Agarose-Perlen.
    1. Bereiten Sie Amylose-Agarose-Perlen (500 l verpackt) vor, indem Sie sie 2 Mal mit dem Puffer C waschen, ohne PMSF und Anti-Protease-Cocktail hinzuzufügen. Die Perlen in die verdünnte Elution geben und über Nacht bei 4 °C brüten.
  9. Zentrifuge bei 2.500 x g für 3 min und halten Sie den Durchfluss durch. Waschen Sie die Protein-gebundenen Perlen mit 5 ml Puffer C (5–6x).
  10. Bewahren Sie den gereinigten His-BAP1/MBP1/MBP-DEUBAD-Komplex auf den Amylose-Agarose-Perlen im Puffer D (50 mM HEPES pH 8,0, 50 mM NaCl, 10% Glycerol und 1 mM DTT) auf und lagern Sie bei -80 °C. Nehmen Sie 20 l der Perlenfraktion (50% Perlenlösung) und fügen Sie 20 L 2x Laemmli Probenpuffer für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzu.

3. Reinigung der Nukleosomen aus HEK293T-Zellen

  1. Kultur HEK293T Zellen in vollständig Dulbecco modifiziert Eagle es Medium (DMEM) ergänzt mit 5% Neugeborenen Kalbsserum (NBS), 2 mM L-Glutamin, und 1% Penicillin/Streptomycin.
  2. Platte um 12 x 106 HEK293T Zellen in 20 ml Komplettemedien pro 15 cm Kulturschale einen Tag vor der Transfektion (10 Gerichte wurden verwendet). Vor der Transfektion das Medium der Zelle auf 12 ml serumfreies Medium ändern und die Zellen mit 21 g pCDNA-Flag-H2A mit 63 l Polyethylenimin (PEI) bei 1 mg/ml36transfekieren. Wechseln Sie zu komplettem Medium 12 h später.
  3. Drei Tage nach der Transfektion die Zellen mit 15 ml eiskaltem PBS (zweimal) waschen und in 3 ml eiskaltem PBS mit einem Zellschaber ernten. Zentrifuge bei 2.100 x g für 8 min bei 4 °C. Entsorgen Sie die PBS und fahren Sie mit dem Lyseschritt fort oder frieren Sie das Zellpellet bei -80 °C ein.
  4. Das Zellpellet in ca. 10 Bändepuffer E (50 mM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1/100 Protease-Inhibitor-Cocktail und 20 mM N-Methylmaleimid (NEM)) und Inkubation auf Eis für 20 min. Zugabe N-Methylmaleimid (NEM) ist entscheidend, um DUBs zu hemmen, die mit Nukleosomen koreinigen.
  5. Nach zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min, den Überstand entsorgen und das Chromatinpellet in 10 BändePuffer E wieder aufsetzen. Inversion und Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min mischen.
    1. Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal mit Puffer E und zweimal mit Puffer F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.3 M Saccharose, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF und 1/100 Proteasehemmer Cocktail).
      VORSICHT: Pellet wird während der Wass- und Zentrifugation schweben.
  6. Das Chromatin in 5 ml Puffer F wieder aufsetzen und das Pellet mit Micrococcal Nuklease (MNase) (3 U/ml für 10 min bei Raumtemperatur) behandeln.
    HINWEIS: Die Reaktion kann durch Mischen mit einem Dounce Homogenizer unterstützt werden.
  7. Nach der Inkubation nehmen Sie ein 40-L-Aliquot der Mischung zur Analyse von nukleosomalen DNA-Fragmenten. Mischen Sie dieses Aliquot mit 40 l Phenol/Chloroform und 20 l 6x DNA-Ladepuffer, Wirbel, drehen Sie bei 18.000 x g für 2 min, und laden Sie die DNA auf ein 2% Agarose-Gel.
    1. Wenn es sich bei der DNA überwiegend um ein 147 bp-Fragment handelt, das Mononukleosomen entspricht, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 5 mM EDTA in der endletzten Konzentration hinzufügen.
  8. Nach Zentrifugation bei 21.000 x g für 20 min bei 4°C die lösliche Chromatinfraktion mit Anti-Flag-Harz über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Perlen mit 6x Buffer G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 Protease-Inhibitoren Cocktail).
  9. Übertragen Sie die Perlen mit 5 ml Puffer G in eine leere Chromatographiesäule. Elute die Perlen-gebundenen Nukleosomen mit 200 g/ml Flag Elution Peptid. Verwenden Sie einen Elutionspuffer, der aus Puffer G besteht, der 200 g/ml Flag-Elutionspeptide (siehe Materialtabelle)und 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8,0 enthält. Elute die Nukleosomen 3x mit 260 l Flag Elutionspuffer (2 h pro Elution).
  10. Testen Sie die 3 Elutionen, indem Sie ein Aliquot für die Phenol-Chlor-Form-Extraktion nehmen und die DNA in ein 2% Agarose-Gel laden. Nehmen Sie 10 l jeder Elutionsfraktion und fügen Sie 10 L Laemmli Probenpuffer 2x für sDS-PAGE und Coomassie blue Analyse hinzu und laden Sie jede Elution für den Western Blot Nachweis von ubiquitiniertem H2A. Bewahren Sie die Elution bei -80 °C auf. Im Allgemeinen liefert die Reinigung aus menschlichen Zellen weniger Proteine als die von Bakterien, mit Konzentrationen zwischen 0,1 und 0,5 g/l.

4. Nukleosom Ubiquitination Assay mit BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Zentrifugieren Sie die Nukleosomen durch 10K Poren 0,5 ml Zentrifugalfilter, um das Substrat vom Elutionspuffer in den Reaktionspuffer H (25 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl2und 5 mM ATP) zu wechseln. Alternativ können handelsübliche Nukleosomen für den Assay verwendet werden.
    HINWEIS: Der Wechsel der Substratsuspensionslösung zum Reaktionspuffer sorgt für Reproduzierbarkeit und verhindert eine mögliche E3-Ligase-Hemmung durch Verbindungen, die im Flag-Elutionsgemisch enthalten sind.
  2. Inkubieren Sie 1 g der Nukleosomen in 40 l Gesamtvolumen des Puffers H. Fügen Sie Ub-Aktivierendes Enzym (UBE1) (250 ng), Ub (50 ng/l) und E2 Ub-konjugating Enzyme (672 ng) und 1 g BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase-Komplex hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion für 3 h bei 37 °C mit gelegentlichem Schütteln.
    HINWEIS: Mehrere Kontrollen können parallel durchgeführt werden, einschließlich Auslassung, E1, E2, E3, ATP und Ubiquitin. Dies stellt die Spezifität für die Ubiquitinationsreaktion sicher.
  3. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 40 l 2x Laemmli Probenpuffer hinzufügen und Histon H2A K119 Ubiquitination durch SDS-PAGE und Western Blotting analysieren, nach Standardverfahren. Verwenden Sie entweder Anti-H2A- oder Anti-H2A K119ub-Antikörper (siehe Materialtabelle).

5. In Vitro Nukleosomal H2A DUB Assay mit BAP1/DEUBAD

  1. Verwenden Sie die gereinigten Nukleosomen für den In-vitro-Deubiquitinationstest. 100–500 ng Nukleosomen in 40 l Puffer I (50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 1 mM MgCl2, 50 mM NaCl und 1 mM DTT) wieder aufsetzen. Fügen Sie 1 g BAP1-Bakterien-gereinigtes His-BAP1 und MBP-DEUBAD hinzu. Führen Sie die Entubiquitinationsreaktion für 3 h bei 37 °C mit gelegentlichem Schütteln aus.
  2. Stoppen Sie die In-vitro-Reaktion, indem Sie 40 l 2x Laemmli-Puffer hinzufügen und durch Immunoblotting analysieren.

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Representative Results

GST-BMI1- und RING1B-Proteine sind gut in Bakterien produziert und können leicht in der löslichen Fraktion extrahiert werden. Abbildung 1A zeigt eine Coomassie-Blaufärbung für eine typische Reinigung des GST-BMI1-RING1B-Komplexes. Die Bänder GST-BMI1 und RING1B wandern mit dem erwarteten Molekulargewicht von 45 kDa bzw. 13 kDa. Insbesondere der E3-Ligase-Komplex ist sehr homogen mit sehr niedrigen Konzentrationen von Bakterienproteinen Verunreinigungen und/oder Abbauprodukten. Darüber hinaus ist die Stoichiometrie des gereinigten Komplexes optimal, da bei einem Molverhältnis von 1:1 die Bandintensität des GST-RING1B-Proteins zwei- bis dreimal stärker sein dürfte als die von BMI1. In ähnlicher Weise führte die Reinigung des His-BAP1/MBP-DEUBAD-Komplexes auch zu relativ sehr homogenen Präparaten mit Bändern von 90 kDa bzw. 55 kDa (Abbildung1B). Die Tandemaffinitätsreinigung von BAP1 und DEUBAD durch Nickel-Agarose bzw. Amylose-Agarose sorgt für eine ausreichende Störiometrie und die Entfernung von freiem BAP1 aus dem gereinigten Komplex. Auf der anderen Seite besteht die gereinigte nukleosomale Fraktion im Wesentlichen aus einem 147bp-Band, das auf das Vorhandensein einer hoch angereicherten mononukleosomalen Fraktion hinweist (Abbildung 1C). Die coomassieblaue Färbung dieser gereinigten Nukleosomen zeigt ein typisches Bandmuster der vier Histonuntereinheiten mit stoichiometrischen Mengen (Abbildung 1D). Kommerziell erhältliche rekombinante Mononukleosomen zeigen auch ähnliche Protein- und DNA-Muster, wenn sie auf SDS-PAGE bzw. Agarose-Gelen migriert werden. Bemerkenswert ist, dass monoubiquitinierte Formen von H2A und Flag-H2A leicht auf HEK293T-gereinigten Nukleosomen unterschieden werden können. Wir verwendeten rekombinante Nukleosomen zusammen mit E1/E2/Ubiquitin/ATP und beobachteten, dass die Ubiquitination des Histon-H2A mit dem BMI1-RING1B-Komplex eine zeitabhängige Zunahme der ubiquitinierten Form des Proteins zeigt, während die Ebenen der nicht modifizierten Form gleichzeitig abgenommen. Die Ubiquitinationsreaktion ist insgesamt, da praktisch alle H2A-Proteine in H2A K119ub umgewandelt werden (Abbildung 1E). Auf der anderen Seite wurde deubiquitination assay an einheimischen Nukleosomen durchgeführt. Nach der Inkubation dieser Nukleosomen mit BAP1/DEUBAD beobachteten wir eine zeitabhängige Reduktion des H2A K119ub Signals (Abbildung 1F). Beachten Sie, dass zwei Bänder ubiquitinierter H2A, die mit Anti-H2A K119ub beobachtet wurden, transfizierten Flag-H2A- und endogenen H2A-Migrationsbändern von 30 kDa bzw. 25 kDa-Bändern entsprechen.

Figure 1
Abbildung 1: Reinigung, Ubiquitination und Entubiquitination. (A) Reinigung von GST-RING1B-BMI1-Proteinen und Analyse mit Coomassie-Blaufärbung. GST-RING1B-BMI1 wurden in Bakterien hergestellt und mit GST-Affinitätsperlen gereinigt. Zur Bestätigung der Reinigungsreinheit und der Proteingröße wurden Elutionen auf 15% SDS-PAGE Gel geladen und mit Coomassie blue gebeizt. Zur Bestimmung der Proteinmenge werden unterschiedliche BSA-Mengen verwendet. Das gefärbte Gel wurde gescannt, um die Figur zu erzeugen. (B) Reinigung des MBP-DEUBAD/His-BAP1-Komplexes. MBP-DEUBAD und HIS-BAP1 wurden getrennt in Bakterien hergestellt. Nach der Lyse wurden MBP-DEUBAD und HIS-BAP1 mit Nickel- und Maltoseperlen gemischt und gereinigt. Der gereinigte Komplex wurde mit 8% SDS-PAGE Gel beladen und mit Coomassie blue gefärbt. (C) Reinigung des Mononukleosoms nach MNase-Behandlung. Chromatin aus HEK293T, das pcDNA.3 Flag-H2A ausdrückt, wurde extrahiert und mit MNase behandelt, um Mononukleosomen zu erzeugen und zu reinigen. Um die Entstehung von Mononukleosom zu bestätigen, wurde ein Bruchteil von Chromatin für die Phenolchlorformextraktion und -detektion unter UV-Licht genommen. Die Belastung mit 2% Agarose-Gel zeigt ein typisches 147 Base-Pair-DNA-Fragment, das auf Mononukleosom hinweist. (D) Gereinigte Mononukleosomen wurden für Coomassie blaue Färbung verwendet. (E) In-vitro-Ubiquitination von Nukleosomen. Rekombinante Nukleosomen wurden bei 37 °C mit dem bakteriellen gereinigten E3-Ubiquitinligase dimer, GST-RING1B/BMI1 und E1/E2/ATP/Ubiquitin für die angegebenen Zeiten inkubiert. H2A-Monoubiquitination (H2A K119ub) wurde durch Western-Blotting analysiert. (F) Deubiquitinationstest von H2A K119ub unter Verwendung des BAP1/DEUBAD Deubiquitinase-Komplexes. In-vitro-Deubiquitinationstests wurden mit Bakterien gereinigt His-BAP1/MBP-DEUBAD und Säugetier gereinigten Nukleosomen durchgeführt. Reaktionen wurden für die angeklagten Zeiten gemacht und durch Western Blotting analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Steuerung und Übersicht des Protokolls. (A) Gereinigte Säugetiere BAP1 oder seine katalytische tote Mutante (C91S) sowie bakteriengereinigtes rekombinantes BAP1 wurden zur H2A-Deubiquitination an Nukleosomen verwendet. Nukleosomen, die allein mit Puffer oder mit Elutionen aus der Scheinreinigung inkubiert wurden, wurden ebenfalls als Kontrollen einbezogen. (B) BAP1 entubiquitiniert nicht H2A K13/K15, dessen Ubiquitination durch RNF168 E3 ligase vermittelt wird. HEK293T-Zellen wurden entweder mit H2A K13R/K15R oder H2A K118R/K119R zusammen mit RNF168 kotransfiziert, um die Ubiquitination auf K13/K15-Rückständen zu gewährleisten. Die gereinigten Nukleosomen wurden zur Entubiquitination durch die BAP1-Komplexe verwendet. Die Reaktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt und immunoblotting unterzogen. (C) Reinigung von nicht ubiquitiniertem und monoubiquitiniertem DEUBAD in Komplex mit BAP1 aus Säugetierzellen. Der gereinigte Komplex wurde für die Deubiquitination assay auf nukleosomal H2A K119ub verwendet. Die Reaktionen wurden für die angegebenen Zeitpunkte durchgeführt und durch Western Blotting analysiert. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T-Zellen wurden zusammen mit H2A- oder H2A-Mutanten (H2A K118R, K119R, K118R/K119R oder K13R/K15R) zusammen mit BAP1- und ASXL2-Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Zellen zur Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern geerntet. (E) Schematische Darstellung des experimentellen Workflows. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Es gibt mehrere Vorteile der Etablierung robuster In-vitro-Ubiquitination und Deubiquitination Assays für Proteine von Interesse. Diese Assays können verwendet werden, um: (i) optimale Bedingungen zu schaffen und minimale Anforderungen für diese Reaktionen zu definieren, (ii) enzymatische kinetische und biochemische Konstanten zu bestimmen, (iii) die Rolle von Kofaktoren oder Inhibitoren zu definieren, die diese Reaktionen beeinflussen können, (iv) Identifizierung von Wechselwirkungsschnittstellen, (v) Untersuchung der Auswirkungen künstlicher oder krankheitsassoziierter Mutationen und (vi) Etablierung von Assay-Bedingungen, die weiter zur Entwicklung chemischer Screening-Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden können. Hier veranschaulichen wir diese Assays, indem wir beschreiben, wie wir BMI1/RING1B-vermittelte H2A-Ubiquitination und BAP1/ASXL-vermittelte H2A-Deubiquitination auf nukleosomalen Substraten durchführen.

Die Ubiquitination von Histon H2A kann in vitro mit minimalen Komponenten rekapituliert werden, da mit dem BMI1-RING1B-Komplex eine nahezu vollständige Ubiquitination von H2A beobachtet werden kann. Bemerkenswert ist, dass diese Reaktion auf rekombinante Nukleosomen durchgeführt wird. Diese haben den Vorteil, dass sie frei von anderen Histonen nachdertranslationalen Modifikationen sind, die in Säugetierzellen auftreten. Dennoch kann die Ubiquitinationsreaktion auch effizient an nativen Nukleosomen durchgeführt werden. Wenn die Ubiquitinationsreaktion schwach ist, kann das Verhältnis von Enzymen zu Substraten erhöht werden, um eine optimale Ubiquitinligation zu beobachten. Wenn Deubiquitinationsreaktionen oder Interaktionstests nach Substrat-Ubiquitination durchgeführt werden sollen, kann die Ubiquitination direkt auf perlengebundenen Substraten durchgeführt werden. Das ubiquitinierte Substrat kann durch Abziehen zurückgewonnen und der Überstand, der die Bestandteile der Ubiquitinationsreaktion enthält, verworfen werden. Wenn jedoch enzymatische Eigenschaften festgestellt werden sollen, müssen Enzyme eluiert und die Stoichiometrie von Komponenten durch Größenausschlusschromatographie bewertet werden.

Die Deubiquitinationsreaktion erfordert weniger Komponenten als die Ubiquitinationsreaktion. Die Reinigung des DEUBAD allein führt jedoch in der Regel zu Proteinniederschlägen. Wichtig ist, wenn die DEUBAD mit BAP1 gereinigt wird, erhöht dies ihre Löslichkeit erheblich. Bemerkenswert ist, dass wir die Durchführung von Deubiquitinationstests mit verschiedenen Mengen des Substrats und Enzymkomplexes vorschlagen. Die Deubiquitinationsreaktion kann durch übermäßige Mengen an Chromatin gehemmt werden, was wahrscheinlich durch erhöhte Konzentrationen von Inhibitoren im Zusammenhang mit Nukleosomen erklärt werden kann. Wir beobachteten auch eine Entubiquitination mit einem Überschuss an freiem BAP1. Daher müssen mehrere Kontrollen einbezogen werden, wie z. B. das Inkubieren von Nukleosomen mit BAP1 allein (Abbildung 2A). Es ist auch wichtig zu beachten, dass einige DUBs mit Chromatin mitreinigen könnten, und obwohl wir Chromatin mit NEM behandeln, könnten DUBs nach Zugabe von DTT, das das katalytische Cystein reduziert, teilweise reaktiviert werden. Darüber hinaus können auch Metalloproteinase-DUBs vorhanden sein, und diese Enzyme sind unempfindlich gegen NEM und werden daher nicht gehemmt. Daher sollten zusätzliche Kontrollen einbezogen werden, die nur aus Nukleosomen bestehen, ohne Enzyme und DUB-katalytische tote Mutante (Abbildung 2A). Bemerkenswert ist, dass die Spezifität der BAP1 DUB-Aktivität gegenüber H2A K119ub gut dokumentiert ist und in unseren Assay-Bedingungen validiert wurde. Wir gereinigten aus HEK293T-Zellen Nukleosomen, die entweder H2A K118/K119R oder H2A K13/K15R exdrücken. Die Expression von RNF168 führt zu einer wichtigen Ubiquitination auf K13/K15. BAP1 DUB-Aktivität wird nur bei Nukleom beobachtet, das H2A K13/K15R entsprechend H2A K119ub enthält (Abbildung 2B). Eine weitere Überlegung ist, dass posttranslationale Modifikationen, die für die enzymatische Aktivität entscheidend sein können, wahrscheinlich nicht in bakteriellen Proteinen vorhanden sind. So könnten in vitro-Reaktionen mit Komponenten, die aus Säugetierzellen gereinigt wurden, auch als35betrachtet werden. Zum Beispiel, Monoubiquitination von DEUBAD, ein Prozess in höheren Eukaryoten beobachtet, stark fördern die Deubiquitinase-Aktivität von BAP135 (Abbildung 2C). So könnte auch die Reinigung von Komponenten aus Säugetierzellen in Betracht gezogen werden. Zusätzlich zu In-vitro-Reaktionen ist es möglich, die BAP1-DUB-Aktivität direkt in Zellen nach der Transfektion zu überwachen. Zum Beispiel kann die Transfektion von HEK293T-Zellen mit H2A-Konstrukt ein klares Signal von H2A K119ub geben, da es in den Zellen reichlich vorhanden ist. Unter diesen Bedingungen findet der größte Teil der Ubiquitination auf K118/K119-Rückständen statt, da die Mutation dieser Standorte zu Arginin zu einem vollständigen Fehlen von H2A-Ubiquitination führt (Abbildung 2D). Die Co-Expressing BAP1 und ASXL2 zusammen mit H2A ermöglicht es, auf die BAP1 DUB Aktivität in Zellen abzuschließen. Mehrere Punkte müssen jedoch als Überexpression betrachtet werden, was zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann. Daher müssen diese Experimente optimiert und gut kontrolliert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebenen Protokolle, die in Abbildung 2Ezusammengefasst sind, einfach sind, keine spezielle Infrastruktur oder Versuchsaufbau erfordern und so skaliert werden können, dass erhebliche Mengen modifizierter Nukleosomen für mehrere Anwendungen nachgelagert, einschließlich enzymatischer Assays, Massenspektrometrie und Protein-Protein-Interaktionstests.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir danken Diana Adjaoud für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) und Genome Canada (2016-2019) an E.B.A. E.B.A. unterstützt, der ein leitender Wissenschaftler des Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ist. L.M und N.S.K. haben ein Promotionsstipendium der FRQ-S. H.B. erhielt ein Promotionsstipendium des Ministeriums für Hochschulbildung und der wissenschaftlichen Forschung Tunesiens und der Cole Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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References

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Biochemie Ausgabe 149 Ubiquitination Deubiquitination E3 ubiquitin ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB Chromatin BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones
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