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Biochemistry

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

यूबीक्विटीशन एक पोस्ट-ट्रांस्लेशनल संशोधन है जो सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और डियूबिक्विटिनेशन द्वारा कसकर समन्वित होता है। दोनों प्रतिक्रियाओं में दोष मानव रोगों के तहत. हम शुद्ध घटकों का उपयोग कर इन विट्रो में सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रिया के संचालन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Abstract

यूबीक्विटीशन एक पोस्ट-अनुवादीय संशोधन है जो विभिन्न संकेतन पथों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और विशेष रूप से क्रोमैटिन समारोह और डीएनए-संबद्ध प्रक्रियाओं के समन्वय में शामिल है। इस संशोधन में कई एंजाइमों की अनुक्रमिक क्रिया शामिल है, जिनमें E1 सबेक्विटिन-सक्रिय, E2 सबविक्विटीन-कंजुगाऔर और E3 सबबीक्विटिन-लिगाज़ शामिल हैं और इसे डेयूबिक्विटिनेस (डीयूबी) द्वारा उलट दिया गया है। यूबीक्विटीन प्रोटीन की गिरावट या एंजाइमी गतिविधि, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और subcellular स्थानीयकरण के मॉडुलन सहित प्रोटीन समारोह में परिवर्तन लाती है। प्रोटीन सर्वव्यापकता या deubicuitination का प्रदर्शन करने में एक महत्वपूर्ण कदम शुद्ध घटकों के साथ इन विट्रो प्रतिक्रियाओं में प्रदर्शन करने के लिए है। प्रभावी सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रियाओं बहुत इस्तेमाल किया विभिन्न घटकों से प्रभावित किया जा सकता है, एंजाइम सह कारक, बफर स्थितियों, और सब्सट्रेट की प्रकृति.  यहाँ, हम सर्वव्यापकता और deubicuitination प्रतिक्रियाओं के संचालन के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम माउस Polycomb दमनकारी परिसर 1 (PRC1), BMI1, और RING1B, एक E3 ubicuitin ligase कि monoubiquitines histone H2A के न्यूनतम घटकों का उपयोग कर इन प्रतिक्रियाओं वर्णन lysine 119 पर. न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए का डियूबिक्विटिनेशन अपने सह-कारक ASXL2 के मानव डेउबिक्विटिनेस BAP1 और DEUBiQuitinase ADaptor (DEUBAD) डोमेन द्वारा गठित एक न्यूनतम पॉलीकॉम्ब दमनकारी Deubiquitinase (पीआर-DUB) परिसर का उपयोग करके किया जाता है। ये सर्वव्यापकता/देवत्व परख या तो पुनः संयोजक न्यूक्लिओसोम के संदर्भ में आयोजित किया जा सकता है जो बैक्टीरिया-शुद्ध प्रोटीन या स्तनधारी कोशिकाओं से शुद्ध देशी न्यूक्लिओसोम के साथ पुनर्गठित होता है। हम जटिलताओं है कि इन प्रतिक्रियाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है पर प्रकाश डाला और हम प्रस्ताव है कि इन प्रोटोकॉल के सामान्य सिद्धांतों को तेजी से अन्य E3 ubicuitin ligases और deubicuitinas के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

यूबीक्विटीशन सबसे संरक्षित पोस्ट-अनुवाद संशोधनों में से एक है और खमीर, पौधों और कशेरुकियों सहित जीवों की एक विस्तृत विविधता के लिए महत्वपूर्ण है। यूबीक्विटीन में सर्वव्यापक लगाव, एक अत्यधिक संरक्षित 76 एमिनो एसिड पॉलीपेप्टाइड, प्रोटीन को लक्षित करने के लिए होते हैं और तीन अनुक्रमिक चरणों में होते हैं जिनमें तीन एंजाइम शामिल होते हैं, अर्थात, ई1-सक्रियीकरण, E2-कंजुगाटिंग और E3 ligase1, 2,3. इस पोस्ट-अनुवाद संशोधन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम में केंद्रीय भूमिका निभाता है. वास्तव में, E3 ligases, जो प्रतिक्रिया की विशिष्टता प्रदान करते हैं, एंजाइमों का एक बड़ा superfamily का गठन और सर्वव्यापकन प्रणाली4,5,6के सबसे प्रचुर मात्रा में एंजाइमों रहे हैं. प्रोटीन सर्वव्यापकता के डाउनस्ट्रीम प्रभाव संशोधन की प्रकृति पर निर्भर करते हैं: एक-एक-मोनोबिक्विटीशन, और रैखिक या शाखाकृत बहुविक्षिका। Monoubiquitination शायद ही कभी proteasomal गिरावट के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन इसके बजाय इस संशोधन विभिन्न संकेतन घटनाओं मध्यस्थता में शामिल है. बहु-टर्मिनल या सर्वव्यापक अणु में लाइसिन अवशेष शामिल हैं, और एक बहुविक्विटीनाट प्रोटीन की नियति इस बात पर निर्भर करती है कि सर्वव्यापक श्रृंखला विस्तार में अवशेष किस अवशेष को शामिल किया जाता है। यह लंबे समय से ज्ञात किया गया है कि सर्वव्यापकता के लाइसिन 48 द्वारा मध्यस्थता की गई पॉलीयुबिक्विटेशन प्रोटीसोमल अवक्रमण को प्रेरित करती है। इसके विपरीत, यूबिक्विटिन के लाइसिन 63 के माध्यम से बहु-विक्विक्विटीकरण प्रायः प्रोटीन सक्रियण7,8,9के साथ जुड़ा होता है । अन्य महत्वपूर्ण पोस्ट-अनुवाद संशोधनों की तरह, सर्वव्यापकता उत्क्रमणीय है और प्रोटीन से सर्वव्यापकहटाने को विशिष्ट प्रोटीज़ द्वारा सुनिश्चित किया जाता है जिसे डेयूबिक्विटिनेस (डीयूबी) कहा जाता है, जो सेलुलर प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरा है। २ , 10. महत्वपूर्ण बात यह है कि कई डब्बा अत्यधिक विशिष्ट होते हैं, और deubiquitination, विशिष्ट substrates के माध्यम से विनियमित, यह दर्शाता है कि सर्वव्यापकता और deubiquitination के बीच एक अच्छा संतुलन प्रोटीन समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. E3s और DUBs, proteasome गिरावट मशीनरी और सहायक कारकों के साथ, Ubicuitin Proteasome प्रणाली के रूप में (यूपीएस, के साथ gt; 1200 जीन) जो प्रमुख संकेतन रास्ते को नियंत्रित करता है, जिनमें से कई सेल विकास और प्रसार के साथ जुड़े रहे हैं, सेल भाग्य निर्धारण, भेदभाव, सेल प्रवास, और सेल मौत. महत्वपूर्ण बात यह है कि सर्वव्यापकता से जुड़े कई संकेतन झरनाों का विनियमन ट्यूमरीजनन और तंत्रिकाजनन रोगों को बढ़ावा देता है5,11,12,13, 14.

यूबीक्विटीयन क्रोमैटिन जीव विज्ञान और डीएनए पर निर्भर प्रक्रियाओं15,16,17में व्यापक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, lysine 119 पर histone H2A के monoubicuination (बाद H2A K119ub) एक महत्वपूर्ण पोस्ट-अनुवाद संशोधन ट्रांसक्रिप्शनल दमन और डीएनए की मरम्मत में शामिल है18,19,20, 21,22. H2A K119ub Polycomb दमनकारी परिसर 1 (PRC1) द्वारा उत्प्रेरित है, जो epigenetic जानकारी के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और अत्यधिक Drosophila से मानव के लिए संरक्षित है. विहित PRC1 विशेष रूप से RING1B और BMI1 द्वारा गठित किया गया है, जो कोर E3 सर्वव्यापक लिगेस परिसर के ऊपर उल्लिखित सर्वव्यापकता घटना22,23के लिए जिम्मेदार हैं. Drosophilaमें, H2A monoubiquitination (H2A K118ub जो स्तनधारी में H2A K119ub से मेल खाती है) DUB Calypso द्वारा उलट है, जो अतिरिक्त सेक्स कंघी (ASX) के साथ सूचना का आदान-देना Polycomb-दबाव DUB (पीआर-DUB) परिसर24. कैलिप्सोका स्तनधारी ऑर्थोलॉग , BAP1, एक ट्यूमर निरोधक है जो विभिन्न मानव द्रोहों में नष्ट या निष्क्रिय है25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 केंद्रक और कैल्शियम-संकेतन-मध्यस्थ एपोप्टोसिस में अंत:द्रव्यीय रेटिकुलम33,34,35,36में डीएनए पर निर्भर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 बहु-सबयूनिट प्रोटीन परिसरों जिसमें प्रतिलेखन विनियामक विशेष रूप से ASXL1, ASXL2 और ASXL3 (ASXLs), ASX38,43के तीन ऑर्थोलॉग शामिल हैं . ASXLs का उपयोग करें DEUBiCuitinase ADaptor (DEUBAD) डोमेन, भी कहा जाता है ASXM डोमेन, BAP1 DUB गतिविधि को प्रोत्साहित करने केलिए 35,36,44. इसलिए, ASXLs क्रोमैटिन पर BAP1 DUB गतिविधि समन्वय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और अधिक मोटे तौर पर अपने ट्यूमर suppressor समारोह.

सर्वव्यापकता और विमुक्तीकरण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई विधियाँ मौजूद हैं। विशेष रूप से, बैक्टीरिया से शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर जैव रासायनिक assays के प्रत्यक्ष सर्वव्यापकता का प्रदर्शन करने में बहुत शक्तिशाली रहते हैं, या से सर्वव्यापकता को हटाने, विशिष्ट substrates. इन प्रयोगों को न्यूनतम परिसरों की आवश्यकता का निर्धारण, प्रतिक्रियाओं गतिकी का निर्धारण, संरचना/ जीन उत्परिवर्तन. यहाँ, हम शुद्ध घटकों के साथ क्रोमैटिन substrates पर सर्वव्यापकता और deubitination प्रतिक्रियाओं का संचालन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक आदर्श प्रणाली के रूप में, इन विट्रो सर्वव्यापकता और न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए प्रोटीन का विमुक्तिकरण प्रस्तुत किया जाता है। RING1B/BMI1 और BAP1/DEUBAD के न्यूनतम परिसरों में इकट्ठे बैक्टीरिया-शुद्ध प्रोटीन का उपयोग क्रमशः न्यूक्लिओसोमल एच 2 ए के सर्वव्यापकता या वियूबिक्विटिनेशन के लिए किया जाता है।

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Protocol

1. GSH-agarose आत्मीयता शुद्धि जीएसटी-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubicuitin लिगास परिसर

  1. PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1-109aa) बैक्टीरिया अभिव्यक्ति का उपयोग BL21 (DE3) बैक्टीरिया को बदलने के लिए निर्माण (सामग्री की तालिकादेखें)23. यह निर्माण murine RING1B डोमेन 1-159 की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है BMI1 डोमेन 1-109 pGEX-6P-2 रीढ़ की हड्डी में GST टैग के साथ जुड़े.
  2. आरआईएल-बैक्टीरिया को GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1-109 aa) को एलबी शोरबा माध्यम के 20 एमएल में 100 डिग्री/ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेट। अगले दिन, एक 1 एल फ्लास्क में स्टार्टर संस्कृति जोड़ें जिसमें ताजा एलबी शोरबा मध्यम (1/26 कमजोर पड़ने) के 500 एमएल के साथ एम्फीकिलिन के साथ और 2 से 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर में संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  3. ऊष्मायन समय के दौरान, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 600 एनएम पर ओडी को मापें। जब बैक्टीरिया संस्कृति 600 एनएम पर 0.6 OD इकाइयों तक पहुँचता है, एक 1,5 एमएल ट्यूब में एक 1,5 एमएल alicot गैर प्रेरित नमूना के रूप में ले लो. प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 एल संस्कृति में आइसोप्रोपिल जेड-डी-डी-1-थायोगालैक्टोपाइरानोसाइड (IPTG) के 400 डिग्री ग्राम जोड़ें। 6 एच से रात में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट बैक्टीरिया।
    1. सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल एलिकोट्स पर 14,000 x g के लिए 30 s, supernatant त्यागें, Laemli नमूना बफर के 200 $L में गोली resuspend, और एसडीएस-पेज और Coomasie प्रोटीन प्रेरण के Coomasie नीले विश्लेषण के लिए रखें.
  4. प्रेरित बैक्टीरिया संस्कृति को फ्लास्क से एक साफ अपकेंद्रीकरण बोतल में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेंट को त्याग दें और 40 एमएल ठंड पीबीएस के साथ गोली को फिर से करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर स्पिन करें।
  5. सुपरनेंट को त्याग ें और -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज करें या अगले चरण पर आगे बढ़ें। यदि प्रोटीन अपेक्षित आणविक वजन पर प्रेरित कर रहे हैं, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें.
  6. बर्फ-ठंडा lysis बफर ए (50 m Tris-HCl पीएच 7.5, के 25 एमएल में बैक्टीरिया गोली को फिर से निलंबित 100 एमएम NaCl, 1 एमएम EDTA, 1% NP40, 1 M PM PMSF, 0.5 MM DTT, और 1/100 विरोधी protease कॉकटेल AEBSF युक्त, Aprotinin, Bestatin, ई-64, Leupeptin, और Pepstatin ए). सुनिश्चित करें कि सभी बैक्टीरिया गोली resuspended है. पीएमएसएफ और एंटी-प्रोटीज़ कॉकटेल को ताजा lysis बफर में जोड़ा जाना चाहिए, केवल बैक्टीरिया lysis के समय।
    चेतावनी: हमेशा बर्फ पर नमूना रखें.
    नोट: बैक्टीरिया lysis को बढ़ाने के लिए 100 g/mL पर Lysozyme जोड़ा जा सकता है।
  7. 15 मिनट के लिए बर्फ पर बैक्टीरिया lysate इनक्यूबेट. 30 s (4-5x) के लिए 70% उत्पादन आयाम पर एक जांच sonicator और sonicate का उपयोग करें, और फिर 20 मिनट के लिए 20 मिनट पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    चेतावनी: sonication के दौरान, हमेशा बर्फ पर नमूने रखने के लिए।
  8. अपकेंद्रण के समय के दौरान, एक 15 एमएल ट्यूब में 500 डिग्री सेल्सियस पैक किए गए GSH-agarose मोती (50% घोल) लें और पीएमएसएफ और एंटी-प्रोटीज़ के बिना बफर ए के 10 एमएल जोड़ें। मिश्रण संक्षेप में और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर स्पिन, इस धोने कदम दो बार दोहराने और बर्फ पर मोती रखने के लिए।
  9. बैक्टीरियल lysate सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, सुपरनेंट को इकट्ठा करें और इसे 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। एक कुल lysate के रूप में 100 $L के एक aliquot ले लो और एसडीएस-पेज और Coomasie नीले विश्लेषण के लिए 2x Laemli नमूना बफर के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  10. 0.45 मीटर के छिद्र सिरिंज फिल्टर के माध्यम से lysate फ़िल्टर और यह GSH मोती के साथ मिश्रण. 5 ज के लिए मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 3 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर मोती नीचे स्पिन, निकालें, और के माध्यम से प्रवाह के रूप में supernatant बचाने के लिए। प्रोटीन-GSH बाध्य मोती धो लें 6 बार (5 एमएल प्रत्येक) बफर एक युक्त विरोधी protease कॉकटेल और PMSF युक्त के साथ.
  11. पिछले धोने के बाद, एक खाली क्रोमैटोग्राफी कॉलम में बफर के 10 एमएल के साथ मोती हस्तांतरण, 1.5 एमएल बफर एक 25 m glutathione युक्त जोड़ने के लिए, और 1.5 एमएल microtubes में गुरुत्वाकर्षण द्वारा elution इकट्ठा. एल्यूशन प्रक्रिया को 4 बार दोहराएँ।
    नोट: ग्लूटाथियोन स्टॉक समाधान 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.5 में 200 एमएम एकाग्रता पर तैयार किया जाता है।
  12. 4 elutions में से प्रत्येक से 10 डिग्री सेल्सियस की एक aliquot ले लो और 2x Laemli नमूना बफर के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. इन नमूनों एसडीएस-पेज और Coomassi नीले विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाएगा उपस्थिति और शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता का निर्धारण.
    नोट: पिछले elution के बाद, रीसाइक्लिंग और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर में मोती रखें.
  13. आगे के विश्लेषण के लिए शुद्ध प्रोटीन की उचित मात्रा में दिखा eluted भिन्न चुनें. तैयारी के छोटे alicots बनाओ. -80 डिग्री सेल्सियस में शुद्ध प्रोटीन स्टोर करें। आमतौर पर, प्रोटीन सांद्रता 0ण्5 ग्राम से लेकर 2 डिग्री ग्राम प्रति $एल तक होगी और नमूने इस अवस्था में संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  14. वैकल्पिक: 10K केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई का उपयोग करके नमूना केंद्रित करें या बफर बदलें

2. BAP1/DEUBAD (ASXL2) डेउबिक्विटिनस कॉम्प्लेक्स का शुद्धिकरण

  1. PET30a+-His-BAP138 और pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 जीवाणु अभिव्यक्ति का उपयोग क्रमशः उनके-BAP1 और MBP-DEUBAD के उत्पादन के लिए BL21 (DE3) RIL बैक्टीरिया को बदलने के लिए निर्माण।
  2. अपने-BAP1 और MBP-DEUBAD (ASXL2) incubating द्वारा दो अलग रात स्टार्टर संस्कृतियों प्रदर्शन एम्पीसिलिन माध्यम के एलबी शोरबा के 20 एमएल में बैक्टीरिया व्यक्त 50 ग्राम / एमएल कानामाइसिन या क्रमशः 100 ग्राम/एमएल एम्फिसिलिन। 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें।
  3. 1-3-1-6 चरणों का कार्य करें.
  4. बर्फ-ठंडा lysis बफर बी (50 एमएम Tris पीएच 7.3, 500 एम एम NaCl, 3 एम एम जेड-Mercaptoethanol, 0.2% Triton X-100, 1 एम एम पीएमएसएफ और 1/100 विरोधी protease कॉकटेल) के 25 एमएल में बैक्टीरिया छर्रों को फिर से निलंबित करें। MBP-DEUBAD lysates के साथ उसके-BAP1 के बराबर संस्करणों मिक्स और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट. Sonicate और फिर प्रोटोकॉल 1 (चरण 9) में संकेत के रूप में lysate centrifuge.
    1. अपकेंद्रण के दौरान, पीएमएसएफ और एंटी-प्रोटीज़ कॉकटेल के बिना बफर बी के साथ तीन बार धोने से 500 जेडएल पैक नी-एनटीए एगारोस मोती (50% घोल) तैयार करें।
  5. बैक्टीरियल lysate सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, सुपरनेंट को इकट्ठा करें और इसे 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। एक कुल lysate के रूप में 100 $L के एक aliquot ले लो और एसडीएस-पेज और Coomasie नीले विश्लेषण के लिए 2x Laemli नमूना बफर के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  6. 0.45 मीटर के छिद्र सिरिंज फिल्टर के माध्यम से lysate फ़िल्टर करें और इसे Ni-NTA मोती के साथ मिलाएं। 5 ज के लिए मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 3 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर मोती नीचे स्पिन, हटाने, और के माध्यम से प्रवाह के रूप में supernatant बचाने के लिए।
    1. 20 एमएम 1,3-डायज़ा-2,4-साइक्लोपेन्टाइन (इमिडाज़ोल) युक्त बफर बी के साथ मोती 6 बार (5 एमएल प्रत्येक) को धोएं।
      नोट: पीएच 7.3 पर 2 M imidazole का एक शेयर समाधान करें।
  7. पिछले धोने के बाद, एक खाली क्रोमैटोग्राफी कॉलम में बफर के 10 एमएल के साथ मोती हस्तांतरण, 200 एमएल Imidazole युक्त 1 एमएल बफर बी जोड़ें और 10 डिग्री डीटी (500 एम) और 2 जेडएल डीटीटी (500 एम) युक्त 1.5 एमएल microtubes में गुरुत्वाकर्षण द्वारा elution इकट्ठा , pH: 8). elution प्रक्रिया 4 बार दोहराएँ. प्रत्येक elution अंश के 10 डिग्री ले लो और एसडीएस-पेज और Coomasie नीले विश्लेषण के लिए 2x Laemli नमूना बफर के 10 डिग्री एल जोड़ें। वांछित eluted भिन्नपूल.
    नोट: रीसाइक्लिंग और भविष्य के उपयोग के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर बकरा में मोती रखें।
  8. बफर सी (50 एमएम ट्राइस पीएच 7.3, 300 एमएम NaCl, 1% Triton X-100, 5 MM DTT, 1 M EDTA, 1 M PMSF, और 1/1/100 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ ऊष्मायन से पहले 3 बार प्रदान करें) amylose agarose beads के साथ ऊष्मायन करने से पहले.
    1. पीएमएसएफ और एंटी-प्रोटीज़ कॉकटेल को जोड़ने के बिना बफर सी के साथ 2 बार धोने से एमिलोस एगारोस मोती (500 जेडएल पैक) तैयार करें। पतला elution करने के लिए मोती जोड़ें और रात भर में इनक्यूबेट 4 डिग्री सेल्सियस.
  9. 3 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से रखने के लिए। प्रोटीन-सीमा मोती को 5 एमएल बफर सी (5-6x) से धोएं।
  10. बफर डी (50 एम एम HEPES पीएच 8.0, 50 एम एम NaCl, 10% ग्लिसरॉल, और 1 एम एम डीटीटी) में एमिलोस एगारोस मोती पर शुद्ध अपने-बीएपीएपी/एमबीपी-डीयूबीएडी परिसर को रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मोती अंश (50% मोती समाधान) के 20 डिग्री एल ले लो और एसडीएस-पेज और Coomasie नीले विश्लेषण के लिए 2x Laemli नमूना बफर के 20 $L जोड़ें।

3. HEK293T कोशिकाओं से न्यूक्लिओसोम की शुद्धि

  1. संस्कृति HEK293T कोशिकाओं को पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में 5% नवजात बछड़ा सीरम (एनबीएस), 2 एम एम एल-ग्लूटामाइन, और 1% पेनिसिलिन /
  2. 12 x 106 HEK293T कोशिकाओं के आसपास प्लेट ट्रांसफेक्शन (10 व्यंजन इस्तेमाल किया गया) से पहले एक दिन 15 सेमी संस्कृति पकवान प्रति पूरा मीडिया के 20 एमएल में. transfection से पहले, सीरम मुक्त मध्यम के 12 एमएल करने के लिए सेल के माध्यम को बदलने और pCDNA-Flag-H2A के 21 डिग्री ग्राम के साथकोशिकाओं transfect 1 मिलीग्राम / बाद में मध्यम 12 घंटे पूरा करने के लिए बदलें।
  3. तीन दिन के बाद ट्रांसफेक्शन, 15 एमएल बर्फ ठंडा पीबीएस (दो बार) के साथ कोशिकाओं को धोने और उन्हें एक सेल खुरचनी का उपयोग कर बर्फ ठंडा पीबीएस के 3 एमएल में फसल। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 2,100 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। पीबीएस को छोड़ दें और lysis चरण पर आगे बढ़ें या -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली फ्रीज करें।
  4. बफर ई (50 एमएम Tris-HCl पीएच 7.3, 420 एम एम NaCl, 1% एनपी-40, 1 एम एम एमजीसीएल2,1 एम एम पीएमएसएफ, 1/100 प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल, और 20 एमएम के एन-मेथिलमेलीमिड (एनईएम) और 20 मिनट के लिए एन-मेथिलमेलीमिड (एनईएम) और इनक्यूबा के बारे में 10 एमएम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एन-मेथिलमेलीमाइड (एनईएम) न्यूक्लिओसोम के साथ सह-शुद्ध करने वाले डब्बों को बाधित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण के बाद, सुपरनेंट को त्याग ें और 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर व्युत्क्रम ई. मिक्स के 10 खंडों में क्रोमैटिन गोली को पुन: बंद करें।
    1. बफर एफ "MNase बफर" (20 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 100 एमएम KCl, 2 एमएम MgCl2, 1 एमएम CaCl2, 0.3 M sucrose, 0.1% एनपी-40, 1 एमएम पीएमएसएफ, और 1/ कॉकटेल)।
      चेतावनी: गोली washes और अपकेंद्रण के दौरान तैर जाएगा.
  6. 5 एमएल बफर एफ में क्रोमैटिन को पुन: निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए माइक्रोकोकल न्यूक्लेस (MNase) (3 U/mL) के साथ गोली का इलाज करें।
    नोट: प्रतिक्रिया एक डेंक Homogenizer का उपयोग कर मिश्रण से सहायता प्राप्त किया जा सकता है.
  7. ऊष्मायन के बाद, न्यूक्लिओसोमल डीएनए के टुकड़ों के विश्लेषण के लिए मिश्रण का 40 डिग्री सेल्सियस एलिकोट लें। इस एलिकोट को 40 जेडएल के साथ फेनोल/क्लोरोफॉर्म और 6x डीएनए लोडिंग बफर, भंवर, 2 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर स्पिन के साथ मिलाएं, और डीएनए को 2% agarose जेल पर लोड करें।
    1. जब डीएनए मुख्य रूप से एक 147 बीपी टुकड़ा mononucleosomes के लिए इसी है, अंतिम एकाग्रता में 5 m EDTA जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 21,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर विरोधी फ़्लाग राल के साथ घुलनशील क्रोमैटिन अंश इनक्यूबेट करें। 6x बफर जी (50 एमएम Tris-HCl, पीएच 7.3, 5 एमएम EDTA, 150 एमएम NaCl, 1% एनपी-40, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1 एमएम डीटीटी, 1/100 प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) के साथ मोती धो लें।
  9. एक खाली क्रोमैटोग्राफी कॉलम में 5 एमएल बफर जी के साथ मोती स्थानांतरण। ध्वज-एल्यूशन पेप्टाइड के 200 ग्राम/एमएल के साथ मोती-बद्ध न्यूक्लिओसोम को एल्यूट करें। बफर जी से बना एक elution बफर का प्रयोग करें जिसमें 200 g/mL Flag elution पेप्टाइड्स (सामग्री की तालिकादेखें ) और 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. न्यूक्लिओसोम 3x के साथ 260 डिग्री एल ध्वज इलुशन बफर (2 ज प्रत्येक elution) को एल्यूट करें।
  10. फीनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए एक एलिकोट लेने के द्वारा 3 elutions का परीक्षण करें और डीएनए को 2% agarose जेल में लोड करें। प्रत्येक elution अंश के 10 डिग्री सेल्सियस ले लो और SDS-पेज और Coomasie नीले विश्लेषण के लिए Laemli नमूना बफर 2x के 10 डिग्री एल जोड़ें और सर्वव्यापक H2A के पश्चिमी ब्लॉट का पता लगाने के लिए प्रत्येक elution लोड. -80 डिग्री सेल्सियस पर elution स्टोर करें। सामान्य तौर पर, मानव कोशिकाओं से शुद्धि बैक्टीरिया से प्रोटीन की तुलना में कम मात्रा में पैदावार, सांद्रता के साथ 0.1 से 0.5 ग्राम /

4. न्यूक्लिओसम Ubicuitination परख BMI1/RING1B E3 Ubicuitin लिगास परिसर का उपयोग

  1. 10K pore0.5 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से न्यूक्लिओसोम को केंद्रानुभूति से क्रांति बफर एच (25 एमएम ट्रास, पीएच 7.5; 10 एमएम एमजीसीएल2, और 5 एम एम एटीपी) के लिए सब्सट्रेट को बदलने के लिए। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिओसोम परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: प्रतिक्रिया बफर करने के लिए सब्सट्रेट निलंबन समाधान बदलने reproducibility सुनिश्चित करता है और ध्वज elution मिश्रण में मौजूद यौगिकों द्वारा संभावित E3 लिगेस अवरोध को रोकता है।
  2. बफर एचके 40 डिग्री एल कुल आयतन में न्यूक्लिओसोम का 1 डिग्री ग्राम। Ub Activating एंजाइम जोड़ें (UBE1) (250 एनजी), Ub (50 एनजी / कभी कभी मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए प्रतिक्रिया इनक्यूबेट करें।
    नोट: कई नियंत्रण omitting सहित समानांतर में आयोजित किया जा सकता है, E1, E2, E3, एटीपी और सर्वव्यापकता. यह सर्वव्यापकता प्रतिक्रिया के लिए विशिष्टता सुनिश्चित करता है।
  3. 2x Laemli नमूना बफर के 40 डिग्री एल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और मानक प्रक्रियाओं के अनुसार, एसडीएस-पेज और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा histone H2A K119 सर्वव्यापकता का विश्लेषण करें। या तो विरोधी H2A या विरोधी H2A K119ub एंटीबॉडी का प्रयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें).

5. इन विट्रो न्यूक्लिओसोमल H2A DUB परख का उपयोग कर BAP1/

  1. इनविट्रो ड्यूबिक्विटिन परख के लिए शुद्ध न्यूक्लिओसोम का प्रयोग करें। 40 डिग्री एल बफर I (50 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.3, 1 एमएम एमजीसीएल2, 50 एमएम नैक्ल, और 1 एमएम डीटीटी) में न्यूक्लिओसोम का 100-500 एनजी का पुनर्गठन करें। BAP1 बैक्टीरिया के 1 डिग्री जोड़ें शुद्ध उसके-BAP1 और MBP-DEUBAD. कभी कभी मिलाते हुए के साथ 3h पर 3 h के लिए deubicuitination प्रतिक्रिया बाहर ले.
  2. 2x Laemli बफर के 40 डिग्री एल जोड़कर इन विट्रो प्रतिक्रिया बंद करो और इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा विश्लेषण।

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Representative Results

GST-BMI1 और RING1B प्रोटीन बैक्टीरिया में अच्छी तरह से उत्पादित कर रहे हैं और घुलनशील अंश में आसानी से निकाला जा सकता है. चित्र 1A GST-BMI1-RING1B परिसर के एक विशिष्ट शुद्धि के लिए एक Coomasie नीले दाग से पता चलता है. जीएसटी-बीएमआई1 और RING1B बैंड क्रमशः अपेक्षित आणविक वजन पर प्रवास करते हैं, $ 45 kDa और $ 13 kDa क्रमशः। विशेष रूप से E3 लिगेज परिसर बैक्टीरिया प्रोटीन contaminants और / इसके अलावा, शुद्ध परिसर की स्टोइकियोमेट्री इष्टतम है, क्योंकि 1:1 के मोलर अनुपात के साथ, जीएसटी-RING1B प्रोटीन की बैंड तीव्रता बीएमआई 1 की तुलना में दो से तीन गुना मजबूत होने की उम्मीद है। इसी प्रकार, उनके-बीएपी1/एमबीपी-डीयूबीडी परिसर की शुद्धि के परिणामस्वरूप भी क्रमशः 90 केडीए और $55 केडीए पर बैंडों के साथ अपेक्षाकृत अत्यधिक समरूप तैयारी हुई (चित्र1 बी)। निकल-अगारोस और एमिलोस-अगारोस के माध्यम से BAP1 और DEUBAD के अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि क्रमशः सुनिश्चित करता है और पर्याप्त stoichimetry और शुद्ध परिसर से मुक्त BAP1 को हटाने. दूसरी ओर, शुद्ध न्यूक्लिओसोमल अंश अनिवार्य रूप से 147bp बैंड द्वारा बना है अत्यधिक समृद्ध mononucleosomal अंश की उपस्थिति का संकेत (चित्र 1C) . इन शुद्ध न्यूक्लिओसोम के कॉमासी नीले दाग स्टोइकियोमेट्रिक मात्रा के साथ चार हिस्टोन उपइकाइयों के एक विशिष्ट बैंड पैटर्न को दर्शाता है (चित्र 1D)। वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध रिकॉमबिनेंट mononucleosomes भी इसी तरह के प्रोटीन और डीएनए पैटर्न प्रदर्शित जब एसडीएस-पेज और agarose जैल पर क्रमशः चले गए. ध्यान दें, H2A और Flag-H2A के मोनोयूबिक्टिनेट रूपों को HEK293T-शुद्ध न्यूक्लिओसोम पर आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। हमने E1/E2/Ubicuitin/ATP के साथ रिकॉमबिनेंट न्यूक्लिओसोम का उपयोग किया और देखा कि बीएमआई1-RING1B परिसर के साथ हिस्टोन H2A की सर्वव्यापकता प्रोटीन के सर्वव्यापक रूप की समय-निर्भर वृद्धि दर्शाती है, जबकि गैर-संशोधित रूप का स्तर सहवर्ती रूप से कमी आई। सर्वव्यापकता अभिक्रिया कुल है, क्योंकि लगभग सभी H2A प्रोटीन H2A K119ub (चित्र 1E) में परिवर्तित हो जाते हैं। दूसरी ओर, देशी न्यूक्लिओसोम पर देवत्व परख की गई। BAP1/DEUBAD के साथ इन न्यूक्लिओसोम के ऊष्मायन के बाद, हमने एच 2 ए K119ub संकेत (चित्र 1F) के समय पर निर्भर कमी देखी। ध्यान दें कि सर्वव्यापक H2A के दो बैंड विरोधी H2A K119ub के साथ मनाया क्रमशः $ 30 kDa और $ 25 kDa बैंड पर पलायन transfected ध्वज H2A और अंतर्जात H2A के अनुरूप हैं.

Figure 1
चित्र 1: शुद्धि, सर्वव्यापकता, और deubitination. (क) जी एस टी-RING1B-BMI1 प्रोटीन का शुद्धिकरण और Coomasie नीले दाग का उपयोग कर विश्लेषण. GST-RING1B-BMI1 बैक्टीरिया में उत्पादित और जीएसटी आत्मीयता मोती का उपयोग कर शुद्ध किया गया. शुद्धि शुद्धता और प्रोटीन आकार की पुष्टि करने के लिए, elutions 15% एसडीएस-पेज जेल पर लोड किया गया और Coomassi नीले रंग के साथ दाग. प्रोटीन मात्रा निर्धारित करने के लिए बीएसए की विभिन्न मात्रा का उपयोग किया जाता है। दाग जेल आंकड़ा उत्पन्न करने के लिए स्कैन किया गया था. (B) MBP-DEUBAD/His-BAP1 परिसर का शुद्धिकरण। MBP-DEUBAD और HIS-BAP1 बैक्टीरिया में अलग से उत्पादित किया गया. lysis के बाद, MBP-DEUBAD और HIS-BAP1 मिला और निकल और माल्टोज मोती का उपयोग कर शुद्ध किया गया. शुद्ध परिसर 8% एसडीएस-पेज जेल पर लोड किया गया था और Coomasie नीले रंग के साथ दाग. (ग) MNase उपचार के बाद mononucleosome की शुद्धि. HEK293T से Chromatin pcDNA.3 झंडा-H2A व्यक्त निकाला गया था और उत्पन्न करने के लिए और mononucleosomes शुद्ध करने के लिए MNase के साथ इलाज किया. मोनोन्यूक्लिसोम की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए, क्रोमैटिन का एक अंश यूवी प्रकाश के तहत फिनोल क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और पता लगाने के लिए लिया गया था। 2% agarose जेल पर लोड हो रहा है एक ठेठ 147 आधार जोड़ी डीएनए टुकड़ा mononucleosome का संकेत पता चलता है. (डी) शुद्ध मोनोन्यूलियोसोम का उपयोग कोमासी नीले दाग के लिए किया गया था। (ई) नाभिकों का विट्रो सर्वव्यापकता में। रिकॉमबिनेंट न्यूक्लिओसोम को 37 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु शुद्ध ई 3 सबबिक्युटिन लिगासे डाइमर, जीएसटी-RING1B/BMI1 और E1/E2/ATP/Ubicuitin के साथ incubated किया गया था। H2A monoubiquitination (H2A K119ub) पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था. (च) एच 2 ए के119ub की देउबिक्विटिनेशन परख बीएपी1/ इन विट्रो ड्यूबिक्विटेशन परख बैक्टीरिया का उपयोग करके आयोजित किया गया था शुद्ध उसके-BAP1/MBP-DEUBAD और स्तनधारी शुद्ध न्यूक्लिओसोम. दोषी समय के लिए प्रतिक्रियाओं किया गया और पश्चिमी blotting द्वारा विश्लेषण किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रोटोकॉल के नियंत्रण और ओवरव्यू. (ए) शुद्ध स्तनधारी BAP1 या इसके उत्प्रेरक मृत उत्परिवर्ती (C91S) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया शुद्ध पुनः संयोजक BAP1 न्यूक्लिओसोम पर H2A deubicuitination के लिए इस्तेमाल किया गया. Nucleosomes अकेले बफर के साथ या नकली शुद्धि से प्राप्त elutions के साथ incubated भी नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया. (बी. बी.ए.बी.ए.1 एच 2 ए के13/ HEK293T कोशिकाओं को या तो H2A K13R/K15R या H2A K118R/K119R के साथ साथ सह-अनुवाद किया गया था ताकि K13/K15 अवशेषों पर सर्वव्यापकता सुनिश्चित की जा सके। शुद्ध न्यूक्लिओसोम का उपयोग बीएएपी1 परिसरों द्वारा वियूबिक्विटिनेशन के लिए किया जाता था। प्रतिक्रिया अलग अलग समय बिंदुओं पर बंद कर दिया और इम्यूनोब्लोtting के अधीन किया गया था. (ग) स्तनधारी कोशिकाओं से BAP1 के साथ परिसर में असर्वित और मोनोबित ड्यूबाड का शुद्धिकरण। शुद्ध जटिल न्यूक्लिओसोमल H2A K119ub पर deubicuitination परख के लिए इस्तेमाल किया गया था. संकेत समय बिंदुओं के लिए प्रतिक्रियाओं किया गया और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया. (डी) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub में विवो. HEK293T कोशिकाओं को H2A या H2A म्यूटेंट (H2A K1118R, K119R, K118R/K119R या K13R/K15R) के साथ BAP1 और ASXL2 निर्माणके साथ सह-रूपांतरण किया गया। ट्रांसफेक्शन के दो दिन बाद, संकेत एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग के लिए कोशिकाओं को काटा गया था। (ई) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ब्याज के प्रोटीन के लिए इन विट्रो सर्वव्यापकता और deubicuitination assays में मजबूत स्थापित करने के कई फायदे हैं. इन परखों का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है: (i) इष्टतम परिस्थितियों की स्थापना और इन प्रतिक्रियाओं के लिए न्यूनतम आवश्यकता को परिभाषित, (ii) एंजाइमी गतिज और जैव रासायनिक स्थिरांक निर्धारित, (iii) cofactors या अवरोधकरनेवालों कि इन प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं की भूमिकाओं को परिभाषित, (पप) बातचीत इंटरफेस की पहचान, (v) कृत्रिम या रोग से जुड़े उत्परिवर्तनों के प्रभाव का परीक्षण और (vi) परख शर्तों है कि आगे उच्च थ्रूपुट रासायनिक स्क्रीनिंग परख विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित. यहाँ, हम इन परखों का उदाहरण देते हैं कि हम कैसे BMI1/RING1B-मध्यस्थ H2A सर्वव्यापकता और BAP1/ASXL-मध्यस्थ H2A न्यूक्लिओसोमल substrates पर deubination प्रदर्शन करते हैं.

हिस्टोन H2A की सर्वव्यापकता न्यूनतम घटकों का उपयोग करते हुए विट्रो में recapitulated किया जा सकता है, के रूप में H2A के लगभग पूरा सर्वव्यापकन बीएमआई 1-RING1B परिसर का उपयोग कर मनाया जा सकता है. नोट की, यह प्रतिक्रिया पुनः संयोजक न्यूक्लिओसोम पर आयोजित की जाती है। ये अन्य histones पोस्ट-अनुवाद संशोधनों कि स्तनधारी कोशिकाओं में पाए जाते हैं से मुक्त होने का लाभ है. फिर भी, सर्वव्यापकता अभिक्रिया को देशी न्यूक्लिओसोम पर कुशलतापूर्वक संचालित किया जा सकता है। यदि सर्वव्यापकता अभिक्रिया कमजोर है, तो इष्टतम सर्वव्यापक ताकारण देखने के लिए एंजाइमों बनाम उपप्रगकाओं का अनुपात बढ़ाया जा सकता है। ध्यान दें, यदि deubicuitination प्रतिक्रियाओं या बातचीत परख सब्सट्रेट सर्वव्यापकता के बाद आयोजित किया जाना है, तो सर्वव्यापकता सीधे मोती बाध्य substrates पर आयोजित किया जा सकता है. सर्वव्यापक उपप्रवर्तन को पुल-डाउन द्वारा पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और सर्वव्यापकता अभिक्रिया के घटकों वाले अधिनाट को त्याग दिया जा सकता है। हालांकि, जब एंजाइमी विशेषताओं को स्थापित किया जाना है, एंजाइमों को eluted और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा मूल्यांकन घटकों की स्टोइचीमिट्री की आवश्यकता है।

देउबिक्विटेशन अभिक्रिया के लिए सर्वव्यापकता अभिक्रिया की तुलना में कम घटकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, अकेले DEUBAD की शुद्धि आम तौर पर प्रोटीन वर्षा के लिए नेतृत्व. महत्वपूर्ण बात, जब DEUBAD BAP1 के साथ शुद्ध है, यह बहुत अपनी विलेयता बढ़ जाती है. ध्यान दें, हम सब्सट्रेट और एंजाइम परिसर के विभिन्न मात्रा के साथ deubicuitination assays आयोजित करने का सुझाव देते हैं. डेयूबिक्विटिनेशन प्रतिक्रिया को क्रोमैटिन की अतिरिक्त मात्रा से रोका जा सकता है, जिसे शायद न्यूक्लिओसोम के साथ जुड़े अवरोधकों की बढ़ी हुई सांद्रता द्वारा समझाया जा सकता है। हम भी मुक्त BAP1 की अधिक के साथ deubitination मनाया. इस प्रकार, कई नियंत्रणों को शामिल करना होगा जैसे कि केवल BAP1 के साथ इनक्यूबेटिंग न्यूक्लिओसोम (चित्र 2क)। यह भी ध्यान दें कि कुछ DUBs क्रोमैटिन के साथ सह-शुद्ध हो सकता है, और भले ही हम NEM के साथ क्रोमैटिन का इलाज, DUBs आंशिक रूप से डीटीटी जो उत्प्रेरक cysteine कम कर देता है के अलावा के बाद पुनः सक्रिय किया जा सकता है. इसके अलावा, धातु प्रोटीनेज DUBs भी मौजूद हो सकता है, और इन एंजाइमों NEM के प्रति असंवेदनशील हैं और इस प्रकार बाधित नहीं कर रहे हैं. अतः अतिरिक्त नियंत्रणों को एंजाइमों को जोड़ए केवल न्यूक्लिओसोम से मिलकर शामिल किया जाना चाहिए तथा DUB उत्प्रेरक मृत उत्परिवर्ती (चित्र 2क) शामिल किया जाना चाहिए। नोट की, H2A K119ub की ओर BAP1 डब गतिविधि की विशिष्टता अच्छी तरह से प्रलेखित है और हमारे परख शर्तों में मान्य किया गया था. हम H2A K1118/K119R या H2A K119R या H2A K13/K15R व्यक्त करने वाली कोशिकाओं न्यूक्लिओसोम से शुद्ध। RNF168 की अभिव्यक्ति K13/K15 पर एक महत्वपूर्ण सर्वव्यापकता की ओर जाता है. BAP1 DUB गतिविधि केवल न्यूक्लिओसोम पर देखी जाती है जिसमें H2A K13/K15R H2A K119ub (चित्र 2B) के अनुरूप होता है। एक और विचार यह है कि बाद अनुवाद संशोधनों कि एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जीवाणु प्रोटीन में मौजूद होने की संभावना नहीं है. इस प्रकार स्तनधारी कोशिकाओं से शुद्ध घटकों का प्रयोग करते हुए इन विट्रो अभिक्रियाओं में भी35माना जा सकता है . उदाहरण के लिए, उच्च यूकैरियोट में पाई जाने वाले एक प्रक्रिया, DEUBAD का एक-एकात्मकता, BAP135 की देउबिक्विटिनेस गतिविधि को बहुत बढ़ावा देता है (चित्र2ब्)। इस प्रकार, स्तनधारी कोशिकाओं से घटकों की शुद्धि पर भी विचार किया जा सकता है। इन विट्रो प्रतिक्रियाओं के अलावा, यह transfection के बाद कोशिकाओं में सीधे BAP1 डब गतिविधि पर नजर रखने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, H2A निर्माण के साथ HEK293T कोशिकाओं के transfection कोशिकाओं में अपनी बहुतायत की वजह से H2A K119ub का एक स्पष्ट संकेत दे सकते हैं. इन स्थितियों में, सर्वव्यापकता का अधिकांश हिस्सा K118/K119 अवशेषों पर होता है, क्योंकि इन स्थलों को आर्जिनिन में उत्परिवर्तन के कारण H2A सर्वव्यापकता का पूर्ण अभाव होता है (चित्र 2D)। H2A के साथ सह-एक्सएल2 कोशिकाओं में BAP1 DUB गतिविधि पर समाप्त करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, कई बिंदुओं overexpression के रूप में विचार करने की आवश्यकता गलत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस प्रकार, इन प्रयोगों को अनुकूलित और अच्छी तरह से नियंत्रित करने की आवश्यकता है.

संक्षेप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, चित्र 2Eमें recapitulated, सरल हैं, एक विशेष बुनियादी ढांचे या प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकता नहीं है, और बढ़ाया जा सकता है कई के लिए संशोधित न्यूक्लिओसोम की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन एन्जायजिक परख, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत परख सहित अनुप्रयोगों बहाव.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए डायना Adaoud धन्यवाद. यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (2015-2020), जीनोम क्यूबेक (2016-2019) और जीनोम कनाडा (2016-2019) से ई.बी.ए. ई.बी.ए. के एक वरिष्ठ विद्वान हैं, जो फोंड्स डे ला रीचरेचे डुक्यू-सेंट (एफआरक्यू) के एक वरिष्ठ विद्वान हैं। एल.एम. और एन.एस.के. एच.बी. उच्च शिक्षा मंत्रालय से और ट्यूनीशिया और कोल फाउंडेशन के वैज्ञानिक अनुसंधान से पीएचडी छात्रवृत्ति थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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जैव रसायन अंक 149 सर्वव्यापकता deubicuitination E3 सर्वव्यापक लिगेज़ PRC1 deubicuitinase पीआर-DUB क्रोमैटिन BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख
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Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

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