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Biochemistry

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

Abstract

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante in vari percorsi di segnalazione ed è particolarmente coinvolta nel coordinamento della funzione della cromatina e dei processi associati al DNA. Questa modifica comporta un'azione sequenziale di diversi enzimi, tra cui E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjuging e E3 ubiquitin-ligase ed è invertita da deubiquitinaes (DUB). L'ubiquitinazione induce la degradazione delle proteine o l'alterazione della funzione proteica, compresa la modulazione dell'attività enzimatica, l'interazione proteina-proteina e la localizzazione subcellulare. Un passo fondamentale nella dimostrazione dell'ubiquitinazione proteica o della deubiquitinazione è quello di eseguire reazioni in vitro con componenti purificati. Un'efficace ubiquitinazione e reazioni di deubiquitinazione potrebbero essere fortemente influenzate dai diversi componenti utilizzati, dai co-fattori enzimatici, dalle condizioni di buffer e dalla natura del substrato.  Qui, forniamo protocolli passo-passo per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Illustriamo queste reazioni utilizzando componenti minimi del mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, un E3 ubiquitin ligase che monoubiquizza istone H2A sulla lisina 119. La deubiquitinazione del nucleosomal H2A viene eseguita utilizzando un complesso minimo Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) formato dal deubiquitinase BAP1 umano e dal dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) del suo co-fattore ASXL2. Questi saggi di ubiquitinazione/deubiquitinazione possono essere condotti nel contesto di nucleosomi ricombinanti ricostituiti con proteine purificate dai batteri o nucleosomi nativi purificati dalle cellule dei mammiferi. Mettiamo in evidenza la complessità che può avere un impatto significativo su queste reazioni e proponiamo che i principi generali di questi protocolli possano essere rapidamente adattati ad altri legamenti e deubiquitinasi E3.

Introduction

L'ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un'ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L'ubiquitinazione consiste nell'attaccamento covalente dell'ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l'attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase1: 2,3. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, che forniscono la specificità della reazione, costituiscono una grande superfamiglia di enzimi e sono gli enzimi più abbondanti del sistema di ubiquitina4,5,6. Gli effetti a valle dell'ubiquitinazione proteica dipendono dalla natura della modificazione: monoubiquitinazione, multimonoscanto e poliubiquitinazione lineare o ramificata. La monoubiquitinazione è raramente associata alla degradazione proteasomica, ma questa modifica è coinvolta nella mediazione di vari eventi di segnalazione. La poliubiquitinazione coinvolge i residui di lisina o di lisina nella molecola di ubiquitina stessa, e il destino di una proteina poliubificata dipende da quale residuo è coinvolto nell'estensione della catena di ubiquitina. È noto da tempo che la poliubiquitinazione mediata dalla lisina 48 dell'ubiquitina induce la degradazione proteasomica. Al contrario, la poliubiquitinazione via lisina 63 di ubiquitina è spesso associata all'attivazione della proteina7,8,9. Simile ad altre importanti modifiche post-traduzionali, l'ubiquitinazione è reversibile e la rimozione dell'ubiquitina dalle proteine è garantita da proteasi specifici rivolte deubiquitinase (DUB), che sono emerse come importanti regolatori dei processi cellulari 2 Il nome del sistema , 10. È importante sottolineare che molti DUB sono altamente specializzati e regolano, attraverso la deubiquitinazione, substrati specifici, indicando che un sottile equilibrio tra ubiquitazione e deubiquitinazione è fondamentale per la funzione proteica. Gli E3 e i DUB, insieme ai meccanismi proteasomeri di degradazione e ai fattori accessori, formano il sistema Ubiquitin Proteasome System (UPS, con geni >1200) che regola i principali percorsi di segnalazione, molti dei quali sono associati alla crescita cellulare e alla proliferazione, determinazione del destino cellulare, differenziazione, migrazione cellulare, e la morte delle cellule. È importante sottolineare che la deregolazione di diverse cascate di segnalazione che coinvolgono l'ubiquitazione promuove la tumoralgenesi e le malattie di neurodegenerazione5,11,12,13, 14.

L'ubiquitazione svolge ruoli pervasivi nella biologia della cromatina e nei processi dipendenti dal DNA15,16,17. Per esempio, la monoubiquitinazione dell'istono H2A sulla lisina 119 (qui dopo H2A K119ub) è una modifica fondamentale post-traduzionale coinvolta nella repressione trascrizionale e nella riparazione del DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub è catalizzato dal Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), che svolge un ruolo chiave nel mantenimento delle informazioni epigenetiche ed è altamente conservato dalla Drosophila all'uomo. Canonical PRC1 è costituito in particolare dal RING1B e BMI1, che sono il complesso principale E3 ubiquitin ligase responsabile del suddetto evento di ubiquitinazione22,23. In Drosophila, la monoubiquitinazione H2A (H2A K118ub che corrisponde a H2A K119ub nei mammiferi) è invertita dal DUB Calypso, che interagisce con Additional Sex Comb (ASX) formando il complesso DUB policomb-repressivo (PR-DUB)24. L'ortologo mammifero di calypso, BAP1, è un soppressore tumorale cancellato o inattivato in varie neoplasie umane25,26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33.BAP1 regola i processi dipendenti dal DNA nel nucleo e l'apoptosi mediata dalla segnalazione del calcio al reticolo endoplasmico33,34,35,36, 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 42. BAP1 assembla complessi proteici multi-subunità contenenti regolatori di trascrizione in particolare ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (ASXL), tre ortologhi di ASX38,43. Gli ASXL utilizzano il dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), anche chiamato dominio ASXM, per stimolare l'attività BAP1 DUB35,36,44. Quindi, gli ASXL svolgono un ruolo importante nel coordinare l'attività di BAP1 DUB alla cromatina e più in generale la sua funzione di soppressore tumorale.

Esistono diversi metodi per studiare i processi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. In particolare, i saggi biochimici che utilizzano proteine purificate dai batteri rimangono molto potenti nel dimostrare l'ubiquitinazione diretta o la rimozione dell'ubiquitina da substrati specifici. Questi esperimenti possono essere condotti per studiare una serie di parametri come la determinazione del requisito di complessi minimi, la determinazione della cinetica delle reazioni, la definizione delle relazioni struttura/funzione e la comprensione dell'impatto mutazioni genetiche. Qui, forniamo protocolli per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione su substrati di cromatina con componenti purificati. Come sistema modello, viene presentata l'ubiquitinazione in vitro e la deubiquitinazione della proteina H2A nucleosomica. Le proteine purificate dai batteri assemblate in complessi minimi di RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD vengono utilizzate rispettivamente per l'ubiquitinazione o la deubiquitinazione del nucleosomal H2A.

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Protocol

1. GSH-agarose Affinity Purification del GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Utilizzare il costrutto di espressione batterica pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) per trasformare i batteri BL21 (DE3) (vedere Tabella deimateriali)23. Questo costrutto consente l'espressione del dominio murine RING1B 1-159 fuso al dominio BMI1 1-109 con il tag GST nella backbone pGEX-6P-2.
  2. Eseguire una coltura di avviamento durante la notte inoculando RIL-batteri esprimendo GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) in 20 mL di mezzo di brodo LB in presenza di 100 g/mL di ampicillina e 50 g/mL chloramphenicol. Incubare agitando a 37 gradi durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere la coltura di avviamento a un pallone da 1 L contenente 500 mL di brodo LB fresco (1/26 diluizione) con ampicillina e incubare la coltura nello shaker a 37 gradi centigradi per 2-4 h.
  3. Durante il periodo di incubazione, misurare l'OD a 600 nm con uno spettrometro. Quando la coltura batterica raggiunge 0,6 unità OD a 600 nm, prendere una aliquota da 1 mL in un tubo da 1,5 mL come campione non indotto. Aggiungere al 1 L l'espressione proteica al numero di isopropilei il z-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla coltura da 1 L. Incubare i batteri a 25 gradi centigradi per 6 h durante la notte.
    1. Centrifugare 1 mL di aliquote a 14.000 g per 30 s, scartare il supernatante, rimettere in sospensione il pellet in 200 -L di buffer campione Laemmli, e mantenere per SDS-PAGE e Coomassie blu analisi di induzione delle proteine.
  4. Trasferire la coltura batterica indotta dal flacone in una bottiglia di centrifugazione pulita e girare verso il basso a 3.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet con 40 mL di PBS freddo e scendere a 3.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
  5. Scartare il supernatante e congelare il pellet a -80 gradi centigradi o procedere al passo successivo. Se le proteine sono indotte al peso molecolare previsto, procedere al passo successivo.
  6. Risospendere il pellet batterico in 25 mL di ilttante a freddo A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT e 1/100 cocktail anti-proteasi contenenti AEBSF, Aprotin, Bestatin, E-64, Leupeptin e Pepstatin A). Assicurarsi che tutti i batteri pellet è risospeso. PMSF e cocktail anti-proteasi devono essere aggiunti al buffer di lisi, solo al momento della lisi batterica.
    ATTENZIONE: Tenere sempre il campione sul ghiaccio.
    NOT: Lysozyme a 100 g/mL può essere aggiunto per migliorare la lisi batterica.
  7. Incubare i batteri lise sul ghiaccio per 15 min.
    ATTENZIONE: Durante la sonicazione, tenere sempre i campioni sul ghiaccio.
  8. Durante il periodo della centrifugazione, prendere 500 perline GSH-agarose imballate 50 in un tubo da 15 mL e aggiungere 10 mL di tampone A senza PMSF e anti-proteasi. Mescolare brevemente e girare a 2.500 g per 3 min a 4 gradi centigradi, ripetere questa fase di lavaggio altre due volte e tenere le perline sul ghiaccio.
  9. Seguendo la centrifugazione lisatea batterica, raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico 50 mL. Prendere un aliquota di 100 ll come lisato totale e aggiungere 100 L di 2x buffer di campione Laemmli per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blue.
  10. Filtrare il lisato attraverso il filtro di siringa di pori 0,45 m e mescolare con le perline GSH. Incubare a 4 gradi centigradi con agitazione per 5 h. Ruotare le perline a 2.500 x g per 3 min, rimuovere e salvare il supernatante come il flusso attraverso. Lavare le proteine-GSH legato perline 6 volte (5 mL ciascuna) con tampone A contenente cocktail anti-proteasi e PMSF.
  11. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline insieme a 10 mL di tampone in una colonna di cromatografia vuota, aggiungere 1,5 mL tampone A contenente 25 mM glutathione, e raccogliere l'elusione per gravità in 1.5 mL microtubi. Ripetere la procedura di eluizione 4 volte.
    NOT: La soluzione stock Glutathione è preparata a 200 mM di concentrazione in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  12. Prendere un'aliquota di 10 gradi da ciascuna delle 4 eluzioni e aggiungere 10 -L di 2x buffer di campione Laemmli. Questi campioni saranno utilizzati per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie per determinare la presenza e la purezza delle proteine purificate.
    NOT: Dopo l'ultima elusione, tenere le perline in tampone a 4 gradi centigradi per il riciclaggio e l'uso futuro.
  13. Scegli le frazioni eluite che mostrano quantità ragionevoli di proteine purificate per un'ulteriore analisi. Fare piccole aliquote della preparazione. Conservare le proteine purificate in -80 gradi centigradi. Di solito, la concentrazione delle proteine varia da 0,5 g a 2 g per luna e i campioni possono essere conservati in questo stato.
  14. FACOLTATIVO: Concentrare il campione o modificare il buffer utilizzando un'unità filtro centrifuga 10K

2. Purificazione del complesso BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase

  1. Utilizzare i costrutti di espressione batterica pET30a-His-BAP138 e pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 per trasformare i batteri RIL BL21 (DE3) rispettivamente per la produzione di His-BAP1 e MBP-DEUBAD.
  2. Eseguire due colture di avviamento notturne separate incubando His-BAP1 e MBP-DEUBAD (ASXL2) esprimendo batteri in 20 mL di brodo LB di mezzo di ampicillina contenente 50 g/mL di chloramphenicol e l'antibiotico corrispondente per ogni plasmide, 100 g/ mL di kanamycin o rispettivamente di 100 g/mL di ampicillina. Mettere sullo shaker a 37 gradi centigradi.
  3. Eseguire i passaggi da 1.3 a 1.6.
  4. Risospendere i batteri pellet in 25 mL di lisi ghiacciata Tan B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM-Mercaptoetanool, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF e 1/100 cocktail anti-protease). Mescolare volumi uguali del His-BAP1 con le lisate MBP-DEUBAD e incubare sul ghiaccio per 15 min. Sonicato e quindi centrifugare il lisato come indicato nel protocollo 1 (fase 9).
    1. Durante la centrifugazione, preparare 500 perline di agarose Ni-NTA compresse (50% di liquami) lavandole tre volte con buffer B senza PMSF e cocktail anti-proteasi.
  5. Seguendo la centrifugazione lisatea batterica, raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico 50 mL. Prendere un aliquota di 100 ll come lisato totale e aggiungere 100 L di 2x buffer di campione Laemmli per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blue.
  6. Filtrare il lisato attraverso il filtro di siringa di pori 0,45 m e mescolare con le perline Ni-NTA. Incubare a 4 gradi centigradi con agitazione per 5 h. Ruotare le perline a 2.500 x g per 3 min, rimuovere e salvare il supernatante come il flusso attraverso.
    1. Lavare le perline 6 volte (5 mL ciascuna) con il buffer B contenente 20 mMM 1,3-Diaza-2,4 ciclidi (Imidazolo).
      NOTA: Creare una soluzione stock di 2 M imidazolo a pH 7.3.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline con 10 mL di tampone in una colonna di cromatografia vuota, aggiungere 1 tampone B contenente 200 mM Imidazole e raccogliere l'eluzione per gravità in microtubi da 1,5 mL contenenti 10 DTT l(500 mM) e 2 EDTA (500 mM , pH: 8). Ripetere la procedura di eluizione 4 volte. Prendere 10 l di ogni frazione di eluizione e aggiungere 10 L di 2x Laemmli buffer campione per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie. Mettere in comune le frazioni eluite desiderate.
    NOT: Tenere le perline in tampone a 4 gradi centigradi per il riciclaggio e l'uso futuro.
  8. Diluire il complesso eluito 3 volte con il buffer C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF e 1/100 protease inhibitor cocktail) prima dell'incubazione con le perline di amiloaro aga.
    1. Preparare le perline di agarose di amilosio (500 o L imballate) lavandole 2 volte con il tampone C senza aggiungere il PMSF e il cocktail anti-proteasi. Aggiungere le perline all'eluizione diluita e incubare pernottamento a 4 gradi centigradi.
  9. Centrifuga a 2.500 x g per 3 min e mantenere il flusso attraverso. Lavare le perline legate alle proteine con 5 mL di buffer C (5–6x).
  10. Mantenere il complesso His-BAP1/MBP-DEUBAD purificato sulle perline di agarose amylose nel buffer D (50 m HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% Glycerol e 1 mM DTT) e conservare a -80 . Prendere 20 l della frazione di perline (soluzione 50% perline) e aggiungere 20 -L di 2x Laemmli buffer campione per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blu.

3. Purificazione dei Nucleosomes dalle cellule HEK293T

  1. Coltura HEK293T cellule in completo Dulbecco modificato mezzo di Eagle (DMEM) integrato con 5% neonatale siero vitello (NBS), 2 mM L-glutamina, e 1% penicillina / streptomicina.
  2. Piatto intorno 12 x 106 cellule HEK293T in 20 mL di supporti completi per piatto di coltura 15 cm un giorno prima della trasfezione (sono stati utilizzati 10 piatti). Prima della trasfezione, modificare il mezzo della cellula a 12 mL di mezzo senza sieri e trasfecare le cellule con 21 g di pCDNA-Flag-H2A utilizzando 63 l di polietilenimina (PEI) a 1 mg/mL36. Passare al supporto completo 12 h in un secondo momento.
  3. Tre giorni dopo la trasfezione, lavare le cellule con 15 mL di PBS ghiacciato (due volte) e raccoglierle in 3 mL di PBS ghiacciate utilizzando un raschietto cellulare. Centrifuga a 2.100 x g per 8 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il PBS e procedere al passo della lisi o congelare il pellet cellulare a -80 gradi centigradi.
  4. Risospendere il pellet cellulare in circa 10 volumi di buffer E (50 mM MM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1/100 proteasi inhibitor cocktail, e 20 mM di N-methylmaleimide (NEM)) e incubare su 20 m. N-metilmaleimide (NEM) è fondamentale per inibire i DUB che co-purificano con i nucleosomi.
  5. Dopo la centrifugazione a 3.000 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet cromatina in 10 volumi di tampone E. Mix per inversione e centrifuga a 3.000 x g per 5 min.
    1. Ripetere la fase di lavaggio un'altra volta utilizzando il buffer E e due volte utilizzando il buffer F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,3 M di saccarosio, 0,1% NP-40, 1 mM PMSF e 1/100 proteasi inibitore cocktail).
      AMMONImento: Pellet fluttuerà durante i fusti e la centrifugazione.
  6. Risospendere la cromatina in un buffer F da 5 mL e trattare il pellet con nucleale micrococcale (MNase) (3 U/mL per 10 min a temperatura ambiente).
    NOT: La reazione può essere aiutata mescolando utilizzando un Omogenizer Dounce.
  7. Dopo l'incubazione, prendi un 40 o Ll della miscela per l'analisi dei frammenti di DNA nucleosomico. Mescolare questa aliquota con 40 lun di Phenol/cloroformio e 20 -L di 6x tamburo di carico del DNA, vortice, girare a 18.000 x g per 2 min, e caricare il DNA su un gel di agarose 2%.
    1. Quando il DNA è prevalentemente un frammento di 147 bp corrispondente ai mononucleosomi, arrestare la reazione aggiungendo 5 mM EDTA alla concentrazione finale.
  8. Dopo la centrifugazione a 21.000 x g per 20 minuti a 4oC, incubare la frazione di cromatina solubile con resina anti-bandiera durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare le perline con 6x Buffer G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 cocktail di inibitori proteasi).
  9. Trasferire le perline con buffer G da 5 mL in una colonna di cromatografia vuota. Elutare i nucleosomi legati alle perline con 200 g/mL di peptide di eluizione Flag. Utilizzare un buffer di elusione composto da un buffer G contenente 200 peptidi di eluizione del flag g/mL (vedere Tabella dei materiali) e 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. Elutizzare i nucleosomi 3x con 260 buffer di eguagliazione flag (2 h ogni eluizione).
  10. Testare le 3 eluzioni prendendo un per l'estrazione del fenolo-cloroformio e caricare il DNA in un gel di aliquota agarose del 2%. Prendere 10 l di ogni frazione di eluizione e aggiungere 10 L di laemmli buffer campione 2x per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie e caricare ogni elusione per il rilevamento Western Blot di H2A onniquiterato. Conservare l'eluizione a -80 gradi centigradi. In generale, la purificazione dalle cellule umane produce una quantità inferiore di proteine rispetto a quella dei batteri, con concentrazioni che vanno da 0,1 a 0,5 g/l.

4. Nucleosome Ubiquitination Assay Using BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Centrifugare i nucleosomi attraverso 10K poro 0,5 mL filtri centrifughi per cambiare il substrato dal buffer di eluzione al buffer di reazione H (25 mM Tris, pH 7.5; 10 mM MgCl2e 5 mM ATP). In alternativa, i nucleosomi disponibili in commercio possono essere utilizzati per il saggio.
    NOT: La modifica della soluzione di sospensione del substrato al buffer di reazione garantisce la riproducibilità e previene la potenziale inibizione delle ligasi E3 da parte dei composti presenti nella miscela di elusione della bandiera.
  2. Incubare 1 g di nucleosomi in 40:L volume totale del buffer H. Aggiungere gli enzimi Ub Activating Enzyme (UBE1) (250 ng), Ub (50 ng/L) e gli enzimi coniugati E2 Ub-coniugati (672 ng) e 1 g di BMI1/RING1B E3 ubiquitina ligase complesso. Incubare la reazione per 3 h a 37 gradi centigradi con scosse occasionali.
    NOT: Diversi controlli possono essere condotti in parallelo, tra cui l'omissione, E1, E2, E3, ATP e ubiquitina. Ciò garantisce la specificità della reazione di ubiquitinazione.
  3. Fermare la reazione aggiungendo 40 lofun di 2x laemmli buffer campione e analizzare l'istone H2A K119 ubiquitination by SDS-PAGE e gonfiore occidentale, secondo le procedure standard. Utilizzare gli anticorpi anti-H2A o Anti-H2A K119ub (vedere Tabella dei materiali).

5. In Vitro Nucleosomal H2A DUB Saggio utilizzando BAP1/DEUBAD

  1. Utilizzare i nucleosomi purificati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. Risospendere 100-500 ng di nucleosomi nel buffer I da 40 mM, pH 7,3, 1 mM MgCl2, 50 mM NaCl e 1 mM DTT). Aggiungete 1 g di His-BAP1, purificati dai batteri BAP1 e MBP-DEUBAD. Eseguire la reazione di deubiquitinazione per 3 h a 37 gradi centigradi con scosse occasionali.
  2. Fermare la reazione in vitro aggiungendo 40 luna di 2x laemmli tampone e analizzare con immunoblotting.

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Representative Results

Le proteine GST-BMI1 e RING1B sono ben prodotte nei batteri e possono essere facilmente estratte nella frazione solubile. La figura 1A mostra una colorazione blu Coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BMI1-RING1B. Le bande GST-BMI1 e RING1B migrano al peso molecolare previsto, rispettivamente 45 kDa e 13 kDa. In particolare il complesso della ligia E3 è altamente omogeneo con livelli molto bassi di contaminanti proteici batterici e/o prodotti di degradazione. Inoltre, la stoichiometria del complesso purificato è ottimale, come con un rapporto molare di 1:1, l'intensità della banda della proteina GST-RING1B dovrebbe essere da due a tre volte più forte di quella di BMI1. Allo stesso modo, la purificazione del complesso His-BAP1/MBP-DEUBAD ha portato anche a preparazioni relativamente altamente omogenee con bande rispettivamente a 90 kDa e 55 kDa (Figura 1B). La purificazione dell'affinità tandem di BAP1 e DEUBAD, attraverso il nichel-agarose e l'amilose-agarose, assicura rispettivamente e un'adeguata stoichiometria e la rimozione del BAP1 libero dal complesso purificato. D'altra parte, la frazione nucleosomica purificata è essenzialmente composta da una banda di 147 bp che indica la presenza di una frazione mononucleosomica altamente arricchita (Figura 1C). La colorazione blu coomassie di questi nucleosomi purificati mostra un tipico schema a bande delle quattro sottounità istone con quantità stoicometriche (Figura 1D). I mononucleosomi ricombinanti disponibili commercialmente mostrano anche modelli di proteine e DNA simili quando vengono migrati rispettivamente sui gel SDS-PAGE e agarose. Da notare che le forme monoiquitinate di H2A e Flag-H2A possono essere facilmente distinte sui nucleosomi olfatici purificati da HEK293T. Abbiamo usato nucleosomi ricombinanti insieme a E1/E2/Ubiquitin/ATP e abbiamo osservato che l'ubiquitazione dell'istone H2A con il complesso BMI1-RING1B mostra un aumento dipendente dal tempo della forma ubiquiterata della proteina, mentre i livelli della forma non modificata sono concomitante diminuito. La reazione di ubiquitinazione è totale, in quanto praticamente tutte le proteine H2A vengono trasformate in H2A K119ub (Figura 1E). D'altra parte, il saggio di deubiquitinazione è stato condotto su nucleosomi nativi. A seguito dell'incubazione di questi nucleosomi con BAP1/DEUBAD, abbiamo osservato una riduzione dipendente dal tempo del segnale H2A K119ub (Figura 1F). Si noti che due bande di H2A ubiquitinated osservato con anti-H2A K119ub corrispondono a transfected Flag-H2A e Endogenous H2A migrando a 30 kDa e 25 kDa bande rispettivamente.

Figure 1
Figura 1: Purificazione, ubiquitazione e deubiquitinazione. (A) Purificazione delle proteine GST-RING1B-BMI1 e analisi utilizzando la colorazione blu Coomassie. GST-RING1B-BMI1 sono stati prodotti in batteri e purificati utilizzando perline di affinità GST. Per confermare la purezza della purificazione e le dimensioni delle proteine, le eluzioni sono state caricate su gel SDS-PAGE del 15% e macchiate con blu Coomassie. Per determinare la quantità proteica vengono utilizzati diversi quantitativi di BSA. Il gel colorato è stato scansionato per generare la figura. ((B)Purificazione del complesso MBP-DEUBAD/His-BAP1. MBP-DEUBAD e HIS-BAP1 sono stati prodotti separatamente nei batteri. Dopo la lisi, MBP-DEUBAD e HIS-BAP1 sono stati mescolati e purificati utilizzando nichel e perline maltosi. Il complesso purificato è stato caricato su gel SDS-PAGE dell'8% e macchiato di blu Coomassie. (C) Purificazione del mononucleosomo dopo il trattamento MNase. La cromatina di HEK293T che esprimeva pcDNA.3 Flag-H2A è stata estratta e trattata con MNase per generare e purificare i mononucleooni. Per confermare la generazione del mononucleosome, è stata presa una frazione di cromatina per l'estrazione e il rilevamento del cloroformio fenolo sotto la luce UV. Il caricamento su gel di agarose del 2% rivela un tipico frammento di DNA di coppia base di 147 coppie di basi indicativo di mononucleosome. (D) I mononucleosomi purificati sono stati utilizzati per la colorazione blu Coomassie. (E) Ubiquitinazione in vitro dei nucleosomi. I nucleosomi ricombinanti sono stati incubati a 37 gradi centigradi con il dimero batterica per ligase di ubiquitina, GST-RING1B/BMI1 e E1/E2/ATP/Ubiquitin, per i tempi indicati. La monoubiquitinazione H2A (H2A K119ub) è stata analizzata dal gonfiore occidentale. (F) Analisi della deubiquitinazione di H2A K119ub sull'utilizzo del complesso di deubiquitinase BAP1/DEUBAD. I saggi di deubiquitinazione in vitro sono stati condotti utilizzando batteri purificati His-BAP1/MBP-DEUBAD e nucleoboni purificati di mammiferi. Le reazioni sono state fatte per i tempi incriminati e analizzate dal gonfiore occidentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Controlli e panoramica del protocollo. (A) Il mammifero purificato BAP1 o il suo mutante catalitico morto (C91S) e il BAP1 ricombinante depurificato dai batteri sono stati utilizzati per la deubiquitinazione H2A sui nucleosomi. I nucleosomi incubati con cuscinetto da soli o con le eluzioni ottenute dalla finta purificazione sono stati inclusi anche come controlli. (B) BAP1 non deubiquitinate H2A K13/K15 la cui ubiquitinazione è mediata dalla RNF168 E3 ligase. Le cellule HEK293T sono state co-trascate con H2A K13R/K15R o H2A K118R/K119R insieme a RNF168 per garantire l'ubiquitazione sui residui K13/K15. I nucleosomi purificati sono stati utilizzati per la deubiquitinazione dai complessi BAP1. La reazione è stata interrotta in momenti diversi e sottoposta a immunoblotting. (C) Purificazione del DEUBAD non onniccinato e monoiccofonizzato in complesso con BAP1 da cellule di mammiferi. Il complesso purificato è stato utilizzato per il saggio di deubicco sul nucleosomal H2A K119ub. Le reazioni sono state fatte per i punti temporali indicati e analizzate dal gonfiore occidentale. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. Le cellule HEK293T sono state co-trascate con mutanti H2A o H2A (H2A K118R, K119R, K118R/K1119R o K13R/K15R) insieme a costrutti BAP1 e ASXL2. Due giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte per l'immunoblotting utilizzando gli anticorpi indicati. (E) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono diversi vantaggi di stabilire robusti saggi di ubiquitinazione in vitro e deubiquitinazione per le proteine di interesse. Questi saggi possono essere utilizzati per: (i) stabilire condizioni ottimali e definire requisiti minimi per queste reazioni, (ii) determinare costanti cinetiche e biochimiche enzimatiche, (iii) definire i ruoli dei cofattori o inibitori che possono influenzare queste reazioni, (iv) identificare le interfacce di interazione, (v) testare l'impatto di mutazioni artificiali o associate alla malattia e (vi) stabilire condizioni di analisi che possono essere ulteriormente utilizzate per sviluppare analisi chimiche ad alto consumo. Qui, esemplifichiamo questi saggi descrivendo come eseguiamo l'ubiquitinazione H2A mediata bMI1/RING1B e la deubiquitinazione H2A mediata da BAP1/ASXL sui substrati nucleosomici.

L'ubiquitinazione dell'istono H2A può essere recapitata in vitro utilizzando componenti minimi, in quanto l'ubiquitinazione quasi completa di H2A può essere osservata utilizzando il complesso BMI1-RING1B. Da notare che questa reazione è condotta su nucleosomi ricombinanti. Questi hanno il vantaggio di essere liberi da altri istoni modifiche post-traduzionali che si verificano nelle cellule dei mammiferi. Ciò nonostante, la reazione di ubiquitinazione può anche essere condotta in modo efficiente sui nucleosomi nativi. Se la reazione di ubiquitinazione è debole, il rapporto tra enzimi e substrati può essere aumentato per osservare una legatura ottimale dell'ubiquitazione. Da notare che, se le reazioni di deubiquitinazione o i saggi di interazione devono essere condotti a seguito di ubiquitinazione substrato, allora l'ubiquitinazione può essere condotta direttamente su substrati legati a perline. Il substrato ubiquitinato può essere recuperato con il pull-down e il supernatante contenente i componenti della reazione di ubiquitinazione può essere scartato. Tuttavia, quando si devono stabilire caratteristiche enzimatiche, gli enzimi devono essere eluiti e la stoichiometria dei componenti valutati dalla cromatografia di esclusione delle dimensioni.

La reazione di deubiquitinazione richiede meno componenti rispetto alla reazione di ubiquitinazione. Tuttavia, la depurazione del DEUBAD da solo porta generalmente alla precipitazione delle proteine. È importante sottolineare che, quando il DEUBAD viene purificato con BAP1, questo aumenta notevolmente la sua solubilità. Da notare, suggeriamo di condurre saggi di deubiquitinazione con varie quantità del complesso di substrati ed enzimi. La reazione di deubiquitinazione può essere inibita da quantità in eccesso di cromatina, che può essere probabilmente spiegata da un aumento delle concentrazioni di inibitori associati ai nucleosomi. Abbiamo anche osservato la deubiquitination con eccesso di BAP1 gratuito. Pertanto, è necessario includere diversi controlli, come l'incubazione di nucleosomi con BAP1 da solo (Figura 2A). È anche importante notare che alcuni DUB potrebbero co-purificare con la cromatina, e anche se trattiamo la cromatina con NEM, i DUB potrebbero essere parzialmente riattivati in seguito all'aggiunta di DTT che riduce il cisteino catalitico. Inoltre, potrebbero essere presenti anche DUB di metalloproteinasi, e questi enzimi sono insensibili a NEM e quindi non sono inibiti. Pertanto, dovrebbero essere inclusi controlli aggiuntivi costituiti solo da nucleosomi senza aggiungere enzimi e mutanti morti catalitici DUB (Figura 2A). Da notare che la specificità dell'attività BAP1 DUB verso H2A K119ub è ben documentata ed è stata convalidata nelle nostre condizioni di teste. Abbiamo purificato dai nucleosomi delle cellule HEK293T che esprimono H2A K118/K119R o H2A K13/K15R. L'espressione di RNF168 porta ad un'importante ubiquitinazione su K13/K15. L'attività BAP1 DUB è osservata solo sul nucleonoma contenente H2A K13/K15R corrispondente a H2A K119ub (Figura 2B). Un'altra considerazione è che le modifiche post-traduzionali che possono essere critiche per l'attività enzimatica probabilmente non sono presenti nelle proteine batteriche. Così le reazioni in vitro utilizzando componenti purificati dalle cellule dei mammiferi potrebbero anche essere considerate35. Ad esempio, la monoubiquitinazione del DEUBAD, un processo osservato negli eucarioti più elevati, promuove notevolmente l'attività di deubiquitinasi della BAP135 (Figura 2C). Così, purificazione dei componenti dalle cellule dei mammiferi potrebbe anche essere considerato. Oltre alle reazioni in vitro, è possibile monitorare l'attività BAP1 DUB direttamente nelle cellule dopo la trasfezione. Ad esempio, la trasfezione delle cellule HEK293T con costrutto H2A può dare un chiaro segnale di H2A K119ub a causa della sua abbondanza nelle cellule. In queste condizioni, la maggior parte dell'ubiquitinazione avviene sui residui K118/K119, poiché la mutazione di questi siti in arginina porta alla completa assenza di ubiquitinazione H2A (Figura 2D). Co-esprimere BAP1 e ASXL2 insieme a H2A permette di concludere sull'attività BAP1 DUB nelle cellule. Tuttavia, è necessario considerare diversi punti in quanto la sovraespressione può portare a risultati errati. Pertanto, questi esperimenti devono essere ottimizzati e ben controllati.

In sintesi, i protocolli qui descritti, riassunti nella Figura 2E, sono semplici, non richiedono un'infrastruttura specializzata o una configurazione sperimentale e possono essere scalati per produrre notevoli quantità di nucleosomi modificati per più applicazioni a valle, tra cui saggi ezimatici, spettrometria di massa e saggi di interazione proteina-proteina.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Diana Adjaoud per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) e Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. è uno studioso senior del Fonds de la Recherchetchedu duébec-Santé (FRQ-S). L.M e N.S.K. hanno una borsa di dottorato dal FRQ-S. H.B ha ricevuto una borsa di studio presso il Ministero dell'istruzione superiore e dalla ricerca scientifica della Tunisia e dalla Fondazione Cole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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References

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Biochimica Numero 149 ubiquitinazione deubiquitinazione E3 ubiquitin ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB cromatina BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici
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