Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

Abstract

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen in verschillende signalering trajecten speelt en is met name betrokken bij de coördinatie van de chromatine functie en DNA-geassocieerde processen. Deze modificatie omvat een sequentiële werking van verschillende enzymen, waaronder E1 ubiquitin-activatie, E2 ubiquitin-conjugating en E3 ubiquitin-ligase en wordt omgekeerd door deubiquitinases (DUBs). Alomtegenwoordige werking induceert afbraak van eiwitten of wijziging van de eiwit functie, inclusief modulatie van enzymatische activiteit, eiwit-eiwit interactie en subcellulaire lokalisatie. Een kritieke stap bij het aantonen van de eiwit alomtegenwoordige of deubiquitatie is het uitvoeren van in vitro reacties met gezuiverde componenten. Effectieve Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties kunnen sterk worden beïnvloed door de verschillende gebruikte componenten, enzym co-factoren, buffer condities en de aard van het substraat.  Hier bieden we stap-voor-stap protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties. We illustreren deze reacties met behulp van minimale componenten van de muis Polycomb repressieve complex 1 (PRC1), BMI1, en RING1B, een E3 ubiquitine ligase dat monoubiquitinates Histon H2A op lysine 119. Deubiquitisatie van nucleosomale H2A wordt uitgevoerd met behulp van een minimale Polycomb repressief Deubiquitinase (PR-DUB) complex gevormd door de humane deubiquitinase BAP1 en het DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domein van zijn co-factor ASXL2. Deze assays van alomtegenwoordige/deubiquitatie kunnen worden uitgevoerd in de context van recombinant nucleosomes die zijn gereconstitueerd met bacteriën gezuiverde eiwitten of inheemse nucleosomes die worden gezuiverd uit zoogdiercellen. We belichten de fijne kneepjes die een aanzienlijke impact kunnen hebben op deze reacties en we stellen voor dat de algemene principes van deze protocollen snel kunnen worden aangepast aan andere E3 ubiquitine ligasen en deubiquitinases.

Introduction

Ubiquitination is een van de meest geconcongeerde post-translationele modificaties en is van cruciaal belang voor een breed scala aan organismen, waaronder gist, planten en gewervelde dieren. Ubiquitination bestaat uit de covalente gehechtheid van ubiquitin, een zeer geconconeerd 76 aminozuur polypeptide, om eiwitten te richten en treedt op in drie opeenvolgende stappen waarbij drie enzymen zijn betrokken, d.w.z. E1-activerende, E2-conjugating en E3 ligase1, 2,3. Deze post-translationele modificatie speelt centrale rollen in een breed spectrum van biologische processen. Inderdaad, de E3 ligases, die de specificiteit van de reactie bieden, vormen een grote superfamilie van enzymen en zijn de meest voorkomende enzymen van het ubiquitine-systeem4,5,6. De downstream effecten van het ubiquitineren van eiwitten zijn afhankelijk van de aard van de modificatie: monoubiquitination, multi-monoubiquitinatie, en lineaire of vertakte polyubiquitination. Monoubiquitination wordt zelden geassocieerd met proteasomale afbraak, maar in plaats daarvan is deze modificatie betrokken bij het bemedieren van verschillende signalering van gebeurtenissen. Polyubiquitination omvat de N-terminal of de lysine residuen in de ubiquitine-molecule zelf, en de bestemming van een polyubiquitineerd eiwit hangt af van welk residu betrokken is bij ubiquitine Chain extension. Het is al lang bekend dat polyubiquitination gemedieerd door lysine 48 van ubiquitine induceert proteasomale afbraak. Integendeel, polyubiquitination via lysine 63 van ubiquitine wordt vaak geassocieerd met eiwit activatie7,8,9. Net als bij andere belangrijke post-translationele modificaties, is ubiquitisatie omkeerbaar en wordt ubiquitine verwijdering van eiwitten verzekerd door specifieke proteasen die deubiquitinases (DUBs) worden genoemd, die zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van cellulaire processen 2 , 10. belangrijk, veel Dubs zijn zeer gespecialiseerd, en reguleren, door deubiquitination, specifieke substraten, wat aangeeft dat een fijne balans tussen Ubiquitination en deubiquitination essentieel is voor de eiwit functie. E3s en Dubs vormen samen met de proteasoom degradatie machines en accessoire factoren het ubiquitin proteasoom systeem (UPS, met > 1200 genen) die de belangrijkste signalerings trajecten reguleert, waarvan er verscheidene geassocieerd worden met celgroei en proliferatie, bepaling van het lot van cellen, differentiatie, Celmigratie en celdood. Belangrijker is dat deregulering van verschillende signalering van Cascades met alomtegenwoordige ziekten tumorigenese en neurodegeneratie aandoeningen5,11,12,13, 14.

Ubiquitination speelt pervasieve rollen in de chromatide biologie en DNA-afhankelijke processen15,16,17. Bijvoorbeeld, monoubiquitination van Histon H2A op lysine 119 (hierna H2A K119ub) is een kritische post-translationele modificatie die betrokken is bij transcriptionele repressie en DNA-reparatie18,19,20, 21,22. H2A K119ub wordt gekatalyseerd door het repressieve complex van Polycomb 1 (PRC1), dat een sleutelrol speelt bij het onderhoud van epigenetische informatie en zeer goed wordt bewaard van Drosophila tot mens. Canonical PRC1 wordt met name gevormd door de RING1B en BMI1, die het kern-E3 ubiquitine ligase-complex zijn dat verantwoordelijk is voor de bovengenoemde Ubiquitination-gebeurtenis22,23. In Drosophilawordt H2A monoubiquitination (H2A K118ub dat overeenkomt met H2A K119ub in zoogdieren) omgekeerd door de Dub Calypso, die samenwerkt met extra Sex Comb (ASX) die de Polycomb-repressieve Dub (PR-Dub) complex24vormt. Het zoogdier ortholog van Calypso, BAP1, is een tumor suppressor verwijderd of geïnactiveerd in verschillende menselijke maligniteiten25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguleert DNA-afhankelijke processen in de Nucleus en de door calcium-signalering gemedieerde apoptosis bij het endoplasmisch reticulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 assembleert multi-subunit eiwitcomplexen met transcriptie regelaars, met name ASXL1, ASXL2 en ASXL3 (asxls), drie orthologues van ASX38,43. Asxls gebruikt het domein deubiquitinase adapter (deubad), ook wel asxm Domain genoemd, om BAP1 Dub-activiteit te stimuleren35,36,44. Daarom speelt ASXLs belangrijke rollen bij het coördineren van BAP1 DUB-activiteit bij chromatine en meer in het algemeen zijn tumor suppressor-functie.

Er bestaan verschillende methoden om de processen van Ubiquitination en deubiquitination te bestuderen. Met name biochemische testen met behulp van eiwitten gezuiverd van bacteriën blijven zeer krachtig in het aantonen van directe alomtegenwoordige van, of verwijdering van ubiquitine van, specifieke substraten. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd om een reeks parameters te onderzoeken, zoals het bepalen van de eis van minimale complexen, het bepalen van reacties kinetiek, het definiëren van structuur/functie relaties en het begrijpen van de impact van pathologische gen mutaties. Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties op chromatine substraten met gezuiverde componenten. Als modelsysteem wordt in vitro Ubiquitination en deubiquitination van nucleosomale H2A eiwit gepresenteerd. Bacteriën-gezuiverde eiwitten geassembleerd in minimale complexen van RING1B/BMI1 en BAP1/DEUBAD worden gebruikt voor Ubiquitination of deubiquitinisatie van nucleosomale H2A, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GSH-agarose Affiniteits zuivering van de GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin ligase complex

  1. Gebruik de pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bacterie expressie construct om BL21 (DE3) bacteriën te transformeren (Zie tabel met materialen)23. Deze constructie kan de expressie van Murine RING1B domein 1-159 gefuseerde met BMI1 domein 1-109 met GST-tag in pGEX-6P-2 backbone.
  2. Voer een overnight starter cultuur door het inoculeren van RIL-bacteriën uitdrukken gst-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) in 20 ml lb Bouillon medium in aanwezigheid van 100 μg/ml ampicilline en 50 μg/ml chlooramfenicol. Incuberen door te schudden bij 37 °C 's nachts. Voeg de start cultuur op de volgende dag toe aan een 1 L kolf met 500 mL vers LB Bouillon medium (1/26 verdunning) met ampicilinaat en inbroed de kweek in de shaker bij 37 °C gedurende 2 tot 4 uur.
  3. Meet tijdens de incubatietijd de OD bij 600 nm met een spectrofotometer. Wanneer de bacteriecultuur 0,6 OD-eenheden bij 600 nm bereikt, neem dan een aliquot van 1 mL in een buisje van 1,5 mL als het niet-geïnduceerde monster. Voeg 400 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan de 1 L-cultuur om eiwit expressie te induceren. Incuberen bacteriën bij 25 °C gedurende 6 uur tot 's nachts.
    1. Centrifuge de 1 mL aliquots bij 14.000 x g gedurende 30 sec., gooi het supernatant weg, regeer de pellet in 200 ΜL Laemmli sample buffer en bewaar voor SDS-page en Coomassie Blue analyse van eiwit inductie.
  4. Breng de geïnduceerde bacteriecultuur uit de kolf in een schone centrifugatie fles en spin tot 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet met 40 mL koude PBS en spin neer bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
  5. Gooi de supernatant weg en Vries de pellet bij-80 °C of ga verder naar de volgende stap. Als de eiwitten worden geïnduceerd op het verwachte molecuulgewicht, gaat u verder met de volgende stap.
  6. Respendeer de bacterie pellet in 25 mL ijskoude lysisbuffer a (50 mm tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm PMSF, 0,5 mm dtt en 1/100 anti-protease cocktail met AEBSF, Aprotinine, Bestatin, E-64, Leupeptine en Pepstatin A). Zorg ervoor dat alle bacteriën pellet wordt geresuspendeerd. PMSF en anti-protease cocktail moeten vers worden toegevoegd aan de lysisbuffer, alleen ten tijde van de bacterie lysis.
    Let op: Houd het monster altijd op ijs.
    Opmerking: Lysozyme bij 100 μg/mL kan worden toegevoegd om de lysis van bacteriën te verbeteren.
  7. Inbroed de bacteriën lysaat op ijs voor 15 min. gebruik een probe-sonicator en sonificeren bij 70% uitgangs amplitude voor 30 s (4 – 5x) en centrifugeer vervolgens bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
    Let op: Tijdens sonicatie, houd altijd de monsters op ijs.
  8. Neem tijdens het centrifugeren 500 μL verpakte GSH-agarose kralen (50% slurry) in een buis van 15 mL en voeg 10 mL buffer a toe zonder PMSF en anti-proteasen. Meng kort en spin bij 2.500 g gedurende 3 minuten bij 4 °C, herhaal deze Wash stap nog twee keer en houd de parels op ijs.
  9. Na bacteriële lysaat centrifugeren, verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 50 mL. Neem een aliquot van 100 μL als totaal lysaat en voeg 100 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.
  10. Filtreer het lysaat door het filter van de porie spuit van 0,45 μm en meng het met de GSH kralen. Inbroed bij 4 °C met schudden gedurende 5 uur. Draai de parels op 2.500 x g gedurende 3 minuten, verwijder en sla het supernatant op als de doorstroming. Was de eiwitten-GSH gebonden kralen 6 keer (5 mL elk) met buffer A met anti-protease cocktail en PMSF.
  11. Na de laatste spoeling, breng de parels samen met 10 mL buffer in een lege chromatografie kolom, voeg 1,5 mL buffer A bevattende 25 mm glutathion, en verzamel de elutie door zwaartekracht in 1,5 ml microbuisjes. Herhaal de elutie procedure 4 keer.
    Opmerking: Glutathion stamoplossing wordt bereid op 200 mM concentratie in 50 mM tris-HCl, pH 7,5
  12. Neem een aliquot van 10 μL van elk van de 4 eluties en voeg 10 μL 2x Laemmli-monster buffer toe. Deze monsters zullen worden gebruikt voor SDS-PAGE en Coomassie Blue-analyse om de aanwezigheid en de zuiverheid van de gezuiverde eiwitten te bepalen.
    Opmerking: Houd na de laatste elutie de parels in buffer bij 4 °C voor recycling en toekomstig gebruik.
  13. Kies de eluteerde fracties die redelijke hoeveelheden gezuiverde eiwitten tonen voor verdere analyse. Maak kleine aliquots van het preparaat. Bewaar de gezuiverde eiwitten in-80 °C. Gewoonlijk zal de eiwitconcentratie variëren van 0,5 μg tot 2 μg per μL en kunnen monsters in deze toestand worden opgeslagen.
  14. Optioneel: Concentreer het monster of verander buffer met een 10K centrifugale filter unit

2. zuivering van het complex BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase

  1. Gebruik pET30a +-his-BAP138 en PDEST-MBP-deubad (ASXL2)35 bacteriële expressie constructies te transformeren BL21 (DE3) RIL bacteriën voor de productie van zijn-BAP1 en MBP-deubad respectievelijk.
  2. Voer twee afzonderlijke starters culturen van 's nachts uit door zijn-BAP1 en MBP-DEUBAD (ASXL2) uit te drukken in 20 ml lb Bouillon van ampicillaire medium met 50 μg/ml chlooramfenicol en het overeenkomstige antibioticum voor elk plasmide, 100 μg/ respectievelijk mL kanamycine of 100 μg/mL ampicillaire. Plaats op Shaker bij 37 °C.
  3. Voer stappen 1.3 – 1.6 uit.
  4. Respendeer de bacteriën pellets in 25 mL ijskoude lysisbuffer B (50 mM tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF en 1/100 anti-protease cocktail). Meng gelijke volumes van de his-BAP1 met de MBP-DEUBAD lysaten en inincuberen op ijs gedurende 15 min. Sonicaat en vervolgens Centrifugeer het lysaat zoals aangegeven in Protocol 1 (stap 9).
    1. Bereid tijdens de centrifugeren 500 μL verpakte ni-NTA agarose kralen (50% slurry) voor door ze driemaal te wassen met buffer B zonder PMSF en anti-protease cocktail.
  5. Na bacteriële lysaat centrifugeren, verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 50 mL. Neem een aliquot van 100 μL als totaal lysaat en voeg 100 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.
  6. Filtreer het lysaat door het filter van de porie spuit van 0,45 μm en meng het met de ni-NTA kralen. Inbroed bij 4 °C met schudden gedurende 5 uur. Draai de parels op 2.500 x g gedurende 3 minuten, verwijder en sla het supernatant op als de doorstroming.
    1. Was de kralen 6 keer (5 mL elk) met buffer B met 20 mm 1,3-diaza-2, 4-cyclopentadiene (imidazol).
      Opmerking: Maak een stamoplossing van 2 M imidazol bij pH 7,3.
  7. Breng na de laatste spoeling de parels met 10 mL buffer in een lege chromatografie kolom, voeg 1 mL buffer B met 200 mm imidazol toe en verzamel de elutie met de zwaartekracht in 1,5 ml microbuisjes met 10 ΜL dtt (500 mm) en 2 ΜL edta (500 mm , pH: 8). Herhaal de elutie procedure 4 keer. Neem 10 μL van elke elutie Fractie en voeg 10 μL 2x Laemmli-monster buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue-analyse. De gewenste fracties in het zwembad.
    Opmerking: Houd de kralen in buffer bij 4 °C voor recycling en toekomstig gebruik.
  8. Verdun het geeleerde complex 3 keer met buffer C (50 mM tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF en 1/100 cocktail van proteaseremmers) voorafgaand aan incubatie met de amylose agarose kralen.
    1. Bereid amylose agarose kralen (500 μL verpakt) door ze 2 keer te wassen met de buffer C zonder toevoeging van PMSF en anti-protease cocktail. Voeg de kralen toe aan de verdunde elutie en inbroed 's nachts bij 4 °C.
  9. Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 3 minuten en houd de stroom door. Was de eiwitten-grenzen kralen met 5 mL buffer C (5 – 6x).
  10. Houd het gezuiverde his-BAP1/MBP-DEUBAD complex op de amylose agarose kralen in buffer D (50 mm Hepes pH 8,0, 50 mm NaCl, 10% glycerol en 1 mm DTT) en bewaar bij-80 °c. Neem 20 μL van de kralen fractie (50% kralen oplossing) en Voeg 20 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.

3. zuivering van de Nucleosomes uit HEK293T cellen

  1. Cultuur HEK293T cellen in compleet Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% pasgeboren kalf serum (NBS), 2 mM L-glutamine, en 1% penicillaire/streptomycine.
  2. Plaat rond 12 x 106 HEK293T cellen in 20 ml complete media per 15 cm kweek schotel één dag voor de transfectie (10 gerechten werden gebruikt). Vóór de transfectie, verander het medium van de cel naar 12 mL serumvrij medium en transfect de cellen met 21 μg pCDNA-Flag-H2A met 63 μl polyethylenimine (PEI) op 1 mg/mL36. Wijzigen in volledig medium 12 uur later.
  3. Drie dagen na transfectie, was de cellen met 15 mL ijskoude PBS (tweemaal) en oogst ze in 3 mL ijskoude PBS met behulp van een celscraper. Centrifugeer bij 2.100 x g gedurende 8 minuten bij 4 °c. Gooi de PBS weg en ga verder naar de lysisstap of Vries de celpellet bij-80 °C.
  4. Respendeer de celpellet in ongeveer 10 volumes buffer E (50 mm tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm pmsf, 1/100 protease inhibitor cocktail en 20 mm N-methylmaleimide (NEM)) en incuberen op ijs gedurende 20 min. toevoegen N-methylmaleimide (NEM) is van cruciaal belang voor de remming van DUBs die samengaan met nucleosomes.
  5. Na centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en regeer de chromatide pellet in 10 volumes buffer E. mix door inversie en centrifuge bij 3.000 x g gedurende 5 minuten.
    1. Herhaal de wasstap nog een keer met behulp van buffer E en twee keer met behulp van buffer F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm CACL2, 0,3 M sucrose, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, en 1/100 protease inhibitor cocktail).
      VOORZICHTIG: pellet zal zweven tijdens het wassen en centrifugeren.
  6. Rebreng de chromatine in 5 mL buffer F en behandel de pellet met micrococcal Nuclease (mnase) (3 U/ml gedurende 10 min bij kamertemperatuur).
    Opmerking: De reactie kan worden geholpen door het mengen met behulp van een Dounce homogenisator.
  7. Neem na incubatie een aliquot van 40 μL van het mengsel voor analyse van nucleosomale DNA-fragmenten. Meng dit aliquot met 40 μL fenol/chloroform en 20 μL 6x DNA-laad buffer, Vortex, spin bij 18.000 x g gedurende 2 minuten en laad het DNA op een 2% agarose gel.
    1. Wanneer het DNA overwegend een 147 BP fragment is dat overeenkomt met mononucleosomes, stop dan de reactie door toevoeging van 5 mM EDTA in de uiteindelijke concentratie.
  8. Na centrifugeren bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c, incuberen de oplosbare chromatide fractie met Anti-Flag hars 's nachts bij 4 °c. Was de kralen met 6x buffer G (50 mm tris-HCl, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 proteaseremmers cocktail).
  9. Breng de parels met 5 mL buffer G over in een lege chromatografie kolom. Elute de met parels gebonden nucleosomes met 200 μg/ml vlag elutie peptide. Gebruik een elutie buffer die bestaat uit buffer G met 200 μg/ml vlag elutie peptiden (Zie tabel met materialen) en 1/5 (vol: vol) 1 M Tris, pH 8,0. Elute de nucleosomes 3x met 260 μL vlag elutie buffer (2 h elke elutie).
  10. Test de 3 eluties door een aliquot voor fenol-chloroform extractie te nemen en het DNA in een 2% agarose gel te laden. Neem 10 μL van elke elutie Fractie en voeg 10 μL Laemmli sample buffer 2x toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue Analysis en laad elke elutie voor de opsporing van de Western Blot van alomtegenwoordige H2A. Bewaar de elutie op-80 °C. In het algemeen levert zuivering van menselijke cellen minder eiwitten op dan die van bacteriën, met concentraties variërend van 0,1 tot 0,5 μg/μL.

4. nucleosome Ubiquitinatie assay met behulp van BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligase complex

  1. Centrifuge de nucleosomes door middel van 10K porie 0,5 mL centrifugale filters om het substraat van de elutie buffer te veranderen in de reactie buffer H (25 mm tris, pH 7,5; 10 mm MgCl2en 5 mm ATP). Als alternatief kunnen in de handel verkrijgbare nucleosomes worden gebruikt voor de test.
    Opmerking: Veranderende substraat suspensie oplossing voor reactiebuffer zorgt voor reproduceerbaarheid en voorkomt potentiële E3 ligase remming door verbindingen aanwezig in de vlag elutie mengsel.
  2. Incuberen 1 μg van de nucleosomes in 40 μL totaal volume van de buffer H. Voeg UB activerende enzym (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) en E2 UB-conjugerende enzymen (672 ng) en 1 μg BMI1/RING1B E3 ubiquitine ligase complex toe. Inincuberen de reactie voor 3 uur bij 37 °C met occasioneel schudden.
    Opmerking: Meerdere besturingselementen kunnen parallel worden uitgevoerd, inclusief weglaten, E1, E2, E3, ATP en ubiquitin. Dit zorgt voor de specificiteit van de ubiquitinatie reactie.
  3. Stop de reactie door 40 μL van 2x laemmli sample buffer toe te voegen en Histon H2A K119 Ubiquitination te analyseren door SDS-page en Western blotting, volgens standaardprocedures. Gebruik anti-H2A of anti-H2A K119ub antilichamen (Zie tabel met materialen).

5. in vitro Nucleosomale H2A DUB assay met behulp van BAP1/DEUBAD

  1. Gebruik de gezuiverde nucleosomes voor de in vitro deubiquitinatie test. Respendeer 100 – 500 ng van nucleosomes in 40 μL buffer I (50 mm tris-HCl, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL en 1 mm DTT). Voeg 1 μg BAP1 bacteriën toe-gezuiverd zijn-BAP1 en MBP-DEUBAD. Voer de deubiquitinatie-reactie gedurende 3 uur bij 37 °C af met occasioneel schudden.
  2. Stop de in-vitro reactie door 40 μL van 2x Laemmli-buffer toe te voegen en te analyseren door immunoblotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GST-BMI1 en RING1B eiwitten zijn goed geproduceerd in bacteriën en kunnen gemakkelijk worden geëxtraheerd in de oplosbare fractie. Afbeelding 1a toont een Coomassie blauwe kleuring voor een typische zuivering van het gst-BMI1-RING1B complex. De GST-BMI1-en RING1B-bands migreren naar het verwachte molecuulgewicht, respectievelijk ~ 45 kDa en ~ 13 kDa. Met name de E3 ligase complex is zeer homogeen met zeer lage niveaus van bacteriën eiwitten contaminanten en/of afbraakproducten. Bovendien is de stoichiometrie van het gezuiverde complex optimaal, net als bij een molaire verhouding van 1:1, de band intensiteit van GST-RING1B-eiwit naar verwachting twee tot drie keer sterker is dan die van BMI1. Evenzo resulteerde de zuivering van his-BAP1/MBP-DEUBAD complex ook in relatief zeer homogene preparaten met bands op ~ 90 kDa en ~ 55 kDa, respectievelijk (Figuur 1b). De tandem affiniteit zuivering van BAP1 en DEUBAD, door middel van nikkel-agarose en amylose-agarose respectievelijk zorgt voor en adequate Stoichiometrie en het verwijderen van vrije BAP1 uit het gezuiverde complex. Aan de andere kant is de gezuiverde nucleosomale breuk in wezen samengesteld door 147bp-band die de aanwezigheid van sterk verrijkte mononucleosomale breuk aangeeft (figuur 1c). Coomassie blauwe kleuring van deze gezuiverde nucleosomes toont een typisch band patroon van de vier Histon-subeenheden met stoichiometrische bedragen (figuur 1d). In de handel verkrijgbare recombinant mononucleosomes vertonen ook vergelijkbare eiwit-en DNA-patronen wanneer ze worden gemigreerd op SDS-PAGE en agarose gels respectievelijk. Van nota, monoubiquitineerde vormen van H2A en vlag-H2A kunnen gemakkelijk worden onderscheiden op HEK293T-gezuiverde nucleosomes. We gebruikten recombinant nucleosomes samen met E1/E2/Ubiquitin/ATP en observeerde dat Ubiquitination van Histon H2A met het BMI1-RING1B-complex een tijdafhankelijke toename van de alomtegenwoordige vorm van het eiwit vertoont, terwijl de niveaus van de niet-gemodificeerde vorm gelijktijdig verlaagd. De alomtegenwoordige reactie is totaal, omdat vrijwel alle H2A eiwitten worden getransformeerd tot H2A K119ub (Figuur 1e). Aan de andere kant werd deubiquitinatie test uitgevoerd op inheemse nucleosomes. Na incubatie van deze nucleosomes met BAP1/DEUBAD, observeerden we een tijdafhankelijke reductie van H2A K119ub signaal (Figuur 1f). Houd er rekening mee dat twee bands van ubiquitineerde H2A waargenomen met anti-H2A K119ub corresponderen met getransfundeerde vlag-H2A en endogene H2A migreren op respectievelijk ~ 30 kDa en ~ 25 kDa bands.

Figure 1
Figuur 1: zuivering, alomtegenwoordige en deubiquitatie. A) zuivering van gst-RING1B-BMI1-eiwitten en analyse met behulp van Coomassie Blue-kleuring. GST-RING1B-BMI1 werden geproduceerd in bacteriën en gezuiverd met behulp van GST Affinity kralen. Om zuivering zuiverheid en eiwitten grootte te bevestigen, werden eluties geladen op 15% SDS-PAGE gel en gekleurd met Coomassie Blue. Verschillende hoeveelheid BSA worden gebruikt om de eiwit hoeveelheid te bepalen. De bevlekte gel werd gescand om de figuur te genereren. B) zuivering van het complex MBP-deubad/his-BAP1. MBP-DEUBAD en HIS-BAP1 werden afzonderlijk geproduceerd in bacteriën. Na lysis werden MBP-DEUBAD en zijn-BAP1 gemengd en gezuiverd met behulp van nikkel en maltose kralen. Het gezuiverde complex werd op 8% SDS-PAGE gel geladen en gekleurd met Coomassie Blue. C) zuivering van mononucleosome na behandeling met MNase. Chromatin van HEK293T uitdrukken pcDNA. 3 Flag-H2A werd geëxtraheerd en behandeld met MNase voor het genereren en zuiveren van mononucleosomes. Om de aanmaak van mononucleosome te bevestigen, werd een fractie van chromatine genomen voor fenol chloroform extractie en detectie onder UV-licht. Het laden op 2% agarose gel onthult een typisch 147 base-pair DNA-fragment dat indicatief is voor mononucleosome. D) gezuiverde mononucleosomes werden gebruikt voor de kleuring van Coomassie Blue. E) in vitro ubiquitisatie van nucleosomes. Recombinant nucleosomes werden geïnventariseerd bij 37 °C met de bacteriële gezuiverde E3 ubiquitine ligase dimer, GST-RING1B/BMI1 en E1/E2/ATP/ubiquitine, voor de aangegeven tijden. H2A monoubiquitination (H2A K119ub) werd geanalyseerd door Western blotting. F) deubiquitatie test van H2A K119ub met gebruikmaking van het complex BAP1/deubad deubiquitinase. In vitro deubiquitinisatie assays werden uitgevoerd met behulp van bacteriën gezuiverd zijn-BAP1/MBP-DEUBAD en zoogdieren gezuiverde nucleosomes. Reacties werden gedaan voor de aangeprezen tijden en geanalyseerd door Western blotting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: controle en overzicht van het protocol. A) de gezuiverde ZOOGDIER BAP1 of de katalytische dode Mutant (C91S) en de door bacteriën gezuiverde recombinant BAP1 werden gebruikt voor de H2A deubiquitatie op nucleosomes. Nucleosomes geïnineerd met buffer alleen of met eluties verkregen uit de mock zuivering werden ook opgenomen als controles. B) BAP1 niet deubiquitinaat H2A K13/K15 waarvan de Ubiquitination wordt gemedieerd door RNF168 E3 ligase. HEK293T cellen werden samen met H2A H2A K13R/K15R of K118R K119R/RNF168 uitgevoerd om alomtegenwoordige K13/K15 residuen te garanderen. De gezuiverde nucleosomes werden gebruikt voor deubiquitatie door de BAP1 complexen. De reactie werd gestopt op verschillende tijdstippen en onderworpen aan immunoblotting. C) zuivering van niet-alomtegenwoordige en monoubiquitineerde deubad in complex met BAP1 uit zoogdiercellen. Het gezuiverde complex werd gebruikt voor deubiquitinatie test op nucleosomale H2A K119ub. Reacties werden gedaan voor de aangegeven tijdpunten en geanalyseerd door Western blotting. D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T cellen werden samen met K118R en K119R constructies samen met H2A of H2A mutanten (H2A K118R, K119R, K13R/K15R of BAP1/ASXL2). Twee dagen na transfectie werden cellen geoogst voor immunoblotting met behulp van de aangegeven antilichamen. E) Schematische weergave van de experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende voordelen van het opzetten van robuuste in vitro Ubiquitination en deubiquitinisatie assays voor eiwitten van belang. Deze testen kunnen worden gebruikt om: (i) optimale omstandigheden vast te stellen en minimale vereiste voor deze reacties te definiëren, (II) enzymatische kinetische en biochemische constanten te bepalen, (III) de rollen te definiëren van cofactoren of remmers die deze reacties kunnen beïnvloeden, (IV) Identificeer interactie-interfaces, (v) test de impact van kunstmatige of ziektebijbehorend mutaties en (VI) vaststelling van testvoorwaarden die verder kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen van tests met een hoge doorvoer van chemische screening. Hier illustreren we deze assays door te beschrijven hoe we BMI1/RING1B-gemedieerde H2A Ubiquitination en BAP1/ASXL-gemedieerde H2A deubiquitatie op nucleosomale substraten uitvoeren.

De Ubiquitination van Histon H2A kan in vitro worden gerecapitculeerd met behulp van minimale componenten, omdat bijna volledige alomtegenwoordige H2A kan worden waargenomen met behulp van BMI1-RING1B complex. Van noot, deze reactie wordt uitgevoerd op recombinant nucleosomes. Deze hebben het voordeel dat ze vrij zijn van andere histonen post-translationele modificaties die voorkomen in zoogdiercellen. Niettemin, de ubiquitinatie reactie kan ook efficiënt worden uitgevoerd op inheemse nucleosomes. Als de ubiquitinatie reactie zwak is, kan de verhouding van enzymen versus substraten worden verhoogd om optimale ubiquitine ligatie te observeren. Opmerking, als deubiquitinisatie reacties of interactie testen moeten worden uitgevoerd na substraat Ubiquitination, dan kan Ubiquitination direct worden uitgevoerd op kralen gebonden substraten. Het alomtegenwoordige substraat kan worden teruggewonnen door pull-down en het supernatant dat de componenten van de ubiquitinatie reactie bevat, kan worden weggegooid. Echter, wanneer enzymatische kenmerken moeten worden vastgesteld, enzymen moeten worden eluleerd en de stoichiometrie van componenten geëvalueerd door grootte uitsluitings chromatografie.

De deubiquitinatie reactie vereist minder componenten dan de ubiquitinatie reactie. De zuivering van het DEUBAD alleen leidt echter over het algemeen tot eiwit precipitatie. Belangrijk is dat wanneer de DEUBAD wordt gezuiverd met BAP1, dit de oplosbaarheid aanzienlijk verhoogt. We stellen voor om deubiquitinisatie testen uit te voeren met verschillende hoeveelheden van het substraat en enzym complex. De deubiquitinisatie reactie kan worden geremd door overmatige hoeveelheden chromatine, wat waarschijnlijk kan worden verklaard door verhoogde concentraties van remmers geassocieerd met nucleosomes. We hebben ook deubiquitination waargenomen met een overmaat aan gratis BAP1. Zo moeten verschillende controles worden opgenomen, zoals incuberende nucleosomes met alleen BAP1 (Figuur 2a). Het is ook belangrijk op te merken dat sommige DUBs kunnen samengaan met chromatine, en hoewel we chromatine met NEM behandelen, kunnen DUBs gedeeltelijk opnieuw worden geactiveerd na toevoeging van DTT, wat het katalytische cysteïne vermindert. Bovendien, Metalloproteinase DUBs kan ook aanwezig zijn, en deze enzymen zijn ongevoelig voor NEM en zijn dus niet geremd. Daarom moeten aanvullende controles worden opgenomen, bestaande uit alleen nucleosomes zonder toevoeging van enzymen en DUB katalytische dode Mutant (Figuur 2a). Van noot, de specificiteit van BAP1 DUB activiteit naar H2A K119ub is goed gedocumenteerd en werd gevalideerd in onze assay voorwaarden. We gezuiverd uit HEK293T cellen nucleosomes uitdrukken ofwel H2A K118/K119R of H2A K13/K15R. Expressie van RNF168 leidt tot een belangrijke alomtegenwoordige op K13/K15. BAP1 DUB activiteit wordt alleen waargenomen op nucleosome met H2A K13/K15R overeenkomend met H2A K119ub (Figuur 2b). Een andere overweging is dat post-translationele modificaties die kritisch kunnen zijn voor enzymatische activiteit, waarschijnlijk niet aanwezig zijn in bacteriële eiwitten. Dus in vitro reacties met behulp van componenten gezuiverd van zoogdiercellen kunnen ook worden beschouwd als35. Zo bevordert de monoubiquitatie van DEUBAD, een proces waargenomen bij hogere eukaryoten, de deubiquitinase-activiteit van BAP135 (figuur 2c) sterk. Zo zou ook de zuivering van componenten uit zoogdiercellen overwogen kunnen worden. In aanvulling op in vitro reacties, is het mogelijk om te controleren BAP1 DUB activiteit direct in cellen na transfectie. Bijvoorbeeld, transfectie van HEK293T cellen met H2A construct kan een duidelijk signaal van H2A K119ub geven vanwege de overvloed in cellen. In deze omstandigheden, het grootste deel van de Ubiquitination gebeurt op K118/K119 residuen, als mutatie van deze sites naar arginine leiden tot volledige afwezigheid van H2A Ubiquitination (figuur 2D). Co-uitdrukken BAP1 en ASXL2 samen met H2A maakt het mogelijk om te concluderen op de BAP1 DUB activiteit in cellen. Echter, meerdere punten moeten worden beschouwd als overexpressie kan leiden tot foutieve resultaten. Dus, deze experimenten moeten worden geoptimaliseerd en goed gecontroleerd.

Samengevat, de hier beschreven protocollen, samengevat in figuur 2e, zijn eenvoudig, vereisen geen gespecialiseerde infrastructuur of experimentele opzet, en kunnen worden opgeschaald om aanzienlijke hoeveelheden gemodificeerde nucleosomes te produceren voor meerdere toepassingen downstream met inbegrip van enzymatische assays, massaspectrometrie en eiwit-eiwit interactie testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

We danken Diana Adjaoud voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoeksraad van Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) en Genome Canada (2016-2019) tot E.B.A. E.B.A. is een senior geleerde van het Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L. M en N.S.K. hebben een doctoraats beurs van de FRQ-S. H. B had een doctoraats beurs van het ministerie van hoger onderwijs en van wetenschappelijk onderzoek van Tunesië en de Cole Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Tags

Biochemie uitgave 149 alomtegenwoordige deubiquitination E3 ubiquitine ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB chromatin BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O.,… More

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter