Summary
في هذه المقالة ، نقدم طريقتين التكميلية لقياس معدلات محدده من الخطا متعديه والغرابة في النموذج المتفطره ، المتفطره سميغاتيس، وذلك باستخدام نظم مراسل الربح من وظيفة. ويمكن استخدام الأساليب لقياس معدلات الخطا الدقيقة في معدلات الخطا المنخفضة أو النسبية في اعداد الانتاجيه العالية.
Abstract
ترجمه الجينات إلى البروتينات عرضه للأخطاء. وعلي الرغم من ان متوسط معدل الخطا الانتقالي في النظم النموذجية يقدر ب 1/10000 لكل codon ، فان معدلات الخطا الفعلية تتباين علي نطاق واسع ، تبعا للأنواع والبيئة والمخطوطات التي يجري دراستها. لقد أظهرنا سابقا ان المتفطره استخدام مسار خطوتين لتوليد أمينواسيلاتيد الجلوتامين و اسباراجين tRNAs وان هذا يرتبط علي وجه التحديد مع معدلات الخطا عاليه نسبيا بسبب تشكيل معدلات الغرابة من قبل عنصر أساسيه من الطريق, [اميموترنستاز] [غكاب]. قمنا بتعديل نظام Renilla-المزدوج الluciferase المستخدمة سابقا التي كانت تستخدم لقياس معدلات التعرج في القولونية اساسيكيا لاستخدامها في المتفطره لقياس معدلات miغرابه محدده من الغلوتامات في الجلوتامين المخطوطات والاسبارتات لاسباراجين كونات. وعلي الرغم من ان هذا النظام الصحفي كان مناسبا للتقدير الدقيق لمعدلات الأخطاء المحددة ، فان عدم الحساسية والمتطلبات اللازمة لإجراءات التلاعب المفرطة جعلته غير مناسب للتطبيقات عاليه الانتاجيه. ولذلك ، قمنا بتطوير نظام المراسل الثاني لكسب الوظائف ، وذلك باستخدام nluc لوسيفيراز والبروتين الفلوري الأخضر (gfp) ، وهو أكثر قابليه للإعدادات المتوسطة/العالية الانتاجيه. استخدمنا هذا النظام لتحديد kasugamycin كجزيء صغير التي يمكن ان تقلل من المتفطرات ميسترسليشن. وعلي الرغم من ان الصحفيين الذين وصفناهم هنا قد استخدموا لقياس أنواع معينه من المتفطرات ، فقد يتم تعديلها لقياس أنواع أخرى من الغرابة في عدد من الانظمه النموذجية.
Introduction
تدفق المعلومات في البيولوجيا الجزيئية يتطلب ترجمه المعلومات الوراثية إلى البروتينات الوظيفية. وكما هو الفضل في جميع النظم البيولوجية ، تنطوي الترجمة الجينية أيضا علي أخطاء قابله للقياس. وعاده ما تقتبس تقديرات معدلات الخطا في الترجمة بما يقارب 1/10000 لكل كودون (استعرضها السيد ريباس دي بوبلا وآخرون.1). ومع ذلك ، تختلف معدلات الخطا علي نطاق واسع ، من اقل من 10-5 إلى أكثر من 0.05/codon1،2،3،4،5. مجموعه واسعه من معدلات الخطا ، والتي تغطي أكثر من ثلاثه أوامر من الحجم ، ويرجع ذلك إلى حقيقة ان الأخطاء يمكن ان تنشا من خطوات متعددة في مسار الترجمة: من الأخطاء العشوائية ، الأمينواسيلاتيون ، أو الإجهاد المستحث في6، 7 , 8 , 9 , 10، misacylation الفسيولوجية من أسباراجينيل-و غلوامينريل-trnas5، أو ريبوسمال فك الأخطاء2،3،11. معدلات الخطا عاليه للقياس ، والتي تمثل أكثر من 0.01/codon ، واقترح ان الأخطاء الانتقالية قد تؤدي وظائف فسيولوجية1،12 والتي قد تكون سوء ترجمه السياق المحدد13.
لقد أظهرنا نحن وغيرنا ان الأخطاء التي تحدث بشكل طبيعي في الترجمة الجينية قد تكون متكيفة ، خاصه اثناء الإجهاد البيئي1،5،12،14،15،16 و17و18. في المتفطره ، الأخطاء الناتجة عن الخطوتين غير المباشرة الجلوتامين/اسباراجين trna أمينواسيلاتيون المسار19،20 يؤدي إلى زيادة التسامح بشكل ملحوظ لأول سطر المضادات الحيوية ريفاميسين 5. ولذلك ، تكهننا بان تناقص المتفطرات ميسترسليشن مع جزيء صغير قد يقوي القتل من قبل ريفاميسين. قمنا بفحصها وتحديدها بشكل طبيعي امينونوغليكوزيد كاسيوجاممايسين كمركب يمكن ان يقلل المتفطرات ميسترسليشن ، التحفيز ريفاميسين-بوساطة قتل من المتفطره في المختبر وفي21المجري ، والحد من ظهور مقاومه ريفاميسين21، التي تهدد السيطرة العالمية علي مرض السل22 -الممرض الأكثر فتكا في العالم.
ان يدرس خطا متعديه, طرق للقياس من [ميسترسلايشن] ينبغي كنت استعملت. هناك طرق متعددة التي تم تطويرها لقياس الغرابة ، لكل منها مزايا وعيوب. ولفتره وجيزة ، فان الدقة في الأساليب القائمة علي الطيف الكتلي لها العديد من المزايا ، واهمها انه مع خوارزميات أحدث للكشف عن أنواع متعددة من الخطا متعديه ، يمكن قياس غير متحيز نسبيا من الغرابة أنجز18. ومع ذلك ، فان الطيف الكتلي ليس مناسبا جدا لقياس احداث التشوات التي تحدث بالذعر-بالبالضبط نوع الميل الذي يحدث في المتفطره بسبب الخطا المعرض لمسار tRNA أمينواسيلاتيون غير المباشر. ويرجع ذلك إلى التشوه غير الانزيمي العالي التردد الذي يحدث في معالجه العينات لقياس الطيف الطيفي23، مما يؤدي إلى وجود اشاره خلفيه عاليه للغاية. ولذلك ، وللكشف عن الأخطاء في هذا المسار ، فان المراسلين الوراثيين لكسب الوظائف يقدمون مزايا متميزة. وعلي وجه التحديد ، يمكن ان يكون للصحفيين المناسبين لكسب الوظائف معدلات خلفيه منخفضه للغاية ، مما يسمح بقياس معدلات الخطا المنخفضة جدا11.
منذ اجراء التجارب مع المتفطره السلمية المسببة للامراض يتطلب المرافق المتخصصة والاحتياطات الاضافيه ، ونحن أداء معظم التجارب في المتفطره غير المسببة للامراض م. سميمجاتيس ، وقد أظهرت في وقت سابق ان النتائج بين النوعين قابله للمقارنة علي نطاق واسع5,21. لقياس معدلات التعرجات في المتفطره المتولدة عن مسار tRNA أمينواسيلاتيون غير المباشرة ، قمنا بتعديل نظام Renilla-اليراع المزدوج-luciferase الذي تم تطويره سابقا لقياس أخطاء فك التشفير في كولاي 11 للاستخدام في المتفطره. أجرينا ثلاثه تعديلات محدده: المراسل الأصلي لم يعبر بكفاءة في المتفطره ، التالي ، كان التسلسل codon-الأمثل ، والأحماض الامينيه C-المحطة الثلاثة من luciferase اليراع ، سيرين-يسين-ليوسين ، الذي تم المشروح كاشاره اتجار في بعض النظم24، تم تعديله إلى ايسولوسين-الأنين-فالين25. وكان المراسل الأصلي بقايا ليسين الحرجة في المتحولة لوسيفيراز اليراع. بدلا من ذلك ، ونحن تحور اما اسبارتات المحفوظة بشكل حرج (D120) أو الغلوتامات (E144) بقايا في لوسيفيراز renilla إلى اسباراجين و الجلوتامين ، علي التوالي25 (الشكل 1). وقد تم استنساخ المراسل في السلسلة العنكبوتية الانبوبيه الانبوبيه-التيور (انظر جدول المواد). وقد تم الحفاظ علي البقايا الوظيفية للصحفيين في الانزيمات/البروتينات الفلورية التي تجعلهم غير وظيفيين11،26. الأخطاء الانتقالية (أو نظريا ، القابلة للتحويل) التي تجمع المتغير الوظيفي للبروتين ستؤدي إلى نشاط انزيم يمكن قياسه في مجموعه فرعيه من البروتينات المترجمة. ولتصحيح التباين في وفره البروتين ، يتم التعبير عن المراسل المتحول ببروتين وظيفي يعمل كمعيار ويسمح بالتحديد الكمي الدقيق لمكسب الوظيفة11. في حين سمح مراسل renilla-اليراع المزدوج luciferase لقياس دقيق لمعدلات المتفطرات miغرابه محدده5،25 (الشكل 2 والقسم 1 من البروتوكول) ، ونحن بسرعة أدركت انها ليست مناسبه للفحص متوسطه/عاليه الانتاجيه من الجزيئات التي من شانها ان تغير معدل الغرابة. ويرجع ذلك أساسا إلى سببين ، هما ، ا) الافتقار النسبي للقوه من renilla لوسيفيراز يعني ان الحد الأدنى من 1 مل من الثقافة المتفطرات/عينه كان مطلوبا لقياس معدلات الغرابة ، و ب) شرط لتحلل الخلايا قبل لقياس نشاط الانزيم المطلوب الإفراط في المناولة اليدوية: الخلايا المتفطرات لها جدار الخلية سميكه ومتعددة الطبقات والمغلف الذي هو مقاومه نسبيا لتحلل. ولذلك ، فاننا نتطلع إلى تطوير نظام مراسلات جديده لاكتساب الوظائف التي يمكن استخدامها مع كميات صغيره (علي سبيل المثال ، في نظام لوحه 96-بئر) ولا تتطلب تحلل الخلية للقياسات. استخدمنا القوية جدا nluc لوسيفيراز وحددت بقايا اسبارتات الحرجة التي ، عندما تحور لاسباراجين ، أسفرت عن فقدان 2 سجلات وظيفة (الشكل 1). وعلاوة علي ذلك ، فان صغر حجم nluc يسمح لها ان يكون لها علامة اشاره إفراز N-الطرفية-من 85a مستضد ، وهو مستضد الرئيسية يفرز في المتفطره27 -التي من شانها ان تسمح nluc ان يفرز في الثقافة ماده طافي والتفاف علي شرط تحلل الخلية. وقد تم التعبير عن البروتين المرجعي ، GFP ، من نفس مروج Nluc المتحول ، ولكن من ناقل متكامل (انظر جدول المواد) ، ويمكن قياسه في الخلايا السليمة21 (الشكل 3). وعلي الرغم من هذه المزايا ، فان مراسل Nluc/GFP (القسم 2 من البروتوكول) لديه أيضا مساوئ: ان الانخفاض المتواضع نسبيا في نشاط نلوك (100 اضعاف) مع طفرة D140N لن يسمح بقياس معدلات التحويل المنخفضة للغاية ، جعل المراسل أكثر ملاءمة كاداه فحص من القياسات الدقيقة للخطا الانتقالي. وعلاوة علي ذلك, Nluc ليس لديه بقايا الغلوتامات الحرجة; ولذلك ، يمكن قياس معدلات الخطا اسباراجين-إلى-اسبارتات فقط. وينبغي ان تسمح المبادئ العامة الموصوفة في هذا العمل للباحثين اما باستخدام هؤلاء الصحفيين كما فعلنا أو بتعديل المراسلين حسب الاقتضاء لاجراء قياس دقيق و/أو سهل لمعدلات الخطا الانتقالية المحددة الأخرى في نظامهم النموذجي اختيار.
Protocol
1. Renilla--اليراع المزدوج--luciferase مراسل
ملاحظه: للحصول علي تمثيل مرئي لهذه الطريقة ، راجع الشكل 2.
- تطعيم المتفطرات مراسل سلالات من-80 درجه مئوية الأسهم مع 2 مل من 7H9 المتوسطة. البرية من نوع المزدوجة luciferase ، وكذلك تحور رينيلا (مراسل) سلالات ، يحتاج إلى استخدامها للسماح لحساب معدلات التعرج (انظر الخطوة 1.7). يهز في 37 درجه مئوية لمده 1 إلى 2 أيام حتى OD600 تصل إلى مرحله ثابته (od > 3).
- Aliquot وتمييع لOD600nm حول 0.1-0.5. للتجارب النموذجية ، استخدم ثلاث ثقافات بيولوجية مستقله. انهيدروتراكلين (ATC) ، وهو محفز التناظرية الاختزال من التعبير مراسل (والتي تسيطر عليها المروجين المحفزين) إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام/مل.
- لقياس اثار kasugamycin علي معدلات التعرج21، أضافه جرعات مختلفه من kasugamycin إلى الثقافة (انظر الشكل 4 للجرعات المشار اليها) في نفس الوقت (في جرعات اختبارها ، kasugamycin لا يوجد لديه نشاط مضاد للميكروبات). لاحظ انه من المهم تضمين عنصر تحكم غير مستحث واحد علي الأقل لكل مراسل. ثقافة-يحث ثقافات ل 4-6 [ه] في 37 [ك] مع يهز.
- نقل الثقافات البكتيرية إلى أنبوب 2 مل ، وأجهزه الطرد المركزي في 3,220 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة إلى بيليه أسفل البكتيريا. تجاهل الخارقة.
- تعطيل البكتيريا عن طريق أضافه 40 μL من 1x السلبي تحلل العازلة (المقدمة من قبل مجموعه مزدوجة luciferase) ، والتي تم تخفيف (1:1) في الماء المقطر المزدوج. نقل محلله البكتيرية المعاد تعليقها إلى لوحه بيضاء 96-بئر ، واحده جيدا لكل عينه ، ويهز في درجه حرارة الغرفة لمده 20 دقيقه.
تحذير: لا أكثر من احتضان البكتيريا في تحلل العازلة (لأكثر من 30 دقيقه). - أضافه 80 μL من الركيزة اليراع لكل بئر ، يهز لمده 15 ثانيه ، وقياس التلالؤ بواسطة الاناره مع 1,000 ms كوقت التكامل. استخدم اما حاقن اليه أو ماصه متعددة القناات لتجنب أخطاء التنضيد.
- أضافه 80 μL من الركيزة Renilla لكل بئر ، يهز ل 15 ثانيه ، وقياس التلالؤ بواسطة الاناره مع ms 1,000 كما وقت التكامل.
- طرح الخلفية التلالؤ-تقاس باستخدام اما نوع البرية m. سميغاتيس (اي لا تحتوي علي الصحفيين) أو غير المستحثة المراسل محلله-من القيم المقاسه. استخدم القيم المصححة لحساب معدلات الترجمة لكل شرط باستخدام المعادلة التالية11،25، حيث يشير DN إلى النشاط في سلاله المراسل المتحول:
2. مراسل nluc/GFP
ملاحظه: للحصول علي تمثيل مرئي لهذه الطريقة ، راجع الشكل 3.
- تلقيح سلاله المراسل البكتيرية من-80 درجه مئوية الأسهم مع 2 مل من 7H9 المتوسطة. يهز في 37 درجه مئوية لمده 1 إلى 2 أيام حتى OD600 تصل إلى مرحله ثابته (od > 3).
- الثقافة الفرعية إلى 50 مل من 7H9 المتوسطة وتنمو حتى OD600 تصل إلى مرحله ثابته في وقت متاخر (> 4).
- قبل نقل البكتيريا إلى لوحه 96 ، أضافه ATC في تركيز نهائي من 50 ng/mL وتخلط جيدا. الاستقراء من الثقافة السائبة يضمن ان جميع الآبار تحتوي علي نفس القدر من المحفز وانه يتم مزامنة التعريفي للمراسل. Aliquot البكتيريا إلى واضحة ، جولة القاع 96 لوحه البئر ، مع 100 μL من حجم في كل بئر.
- لفحص الجزيئات الصغيرة التي تؤثر علي معدلات التعرجات ، أضف المركب عند التركيز المشار اليه لتحديد الآبار. لأغراض هذا البروتوكول ، استخدم kasugamycin (بالجرعات المشار اليها في الشكل 5) كمثال توضيحي. أضافه جرعات مختلفه من kasugamycin لتحديد الآبار (يجب ان تحتوي كل مجموعه تجريبية علي الأقل اثنين من البيولوجية والنسخ المتماثلة).
- يهز ويحفز العينات في 37 درجه مئوية ل 16-20 h.
ملاحظه: فمن الضروري لختم لوحه مع الفيلم. أيضا ، جميع الآبار حافه تحتاج إلى ان تملا مع ما لا يقل عن 200 μL من المياه المعقمة للحد من التبخر من ابار الاختبار. - خذ 80 μL من كل بئر ، وذلك باستخدام ماصه متعددة القناات ، ونقل العينات إلى لوحه سوداء 96-بئر (الذي يزيد من قياس اشاره مضان). قياس اشاره GFP بمقياس الاضاءه مع 20 مللي ثانيه كوقت التكامل.
- بعد قياس اشاره gfp ، الطرد المركزي لوحه في 3,220 x g ل 10 دقيقه نقل 50 μl من ماده طافي إلى لوحه بيضاء القاع 96 بئر (الذي يزيد من قياس اشاره التلالؤ) ، أضافه 50 μl من الركيزة nluc لكل بئر ، ومزجها بشكل جيد ، وقياس التلالؤ بواسطة الاناره مع 1,000 مللي ثانيه كوقت التكامل.
- تحديد نسبه Nluc/GFP عن طريق تقسيم القيم التلالؤ Nluc المصححة من قبل فلوري GFP: هذا التدبير (في وحدات التعسفي) هو مقياس نسبي من اسبارتات لاسباراجين ميسترسليشن.
Representative Results
ويرد في الشكل 1 رسمكاريكاتوري يوضح المخطط العام لنظامي المراسلين المستخدمين في هذا العمل. ويرد عرض عام للباب 1 من البروتوكول في الشكل 2 ولمحه عامه عن الباب 2 في الشكل 3. ويظهر تاثير kasugamycin علي المتفطرات ميسترسليشن في الشكل 4، كما يقاس من قبل نظام مراسل renilla-اليراع. ولإظهار خصوصية عمل كاسوغاممايسين ، تم التعبير عن المراسل أيضا في سلاله م. سميغاتيس التي تم فيها حذف ksga (∆ ksga). KsgA هو ريرنا ثنائي ميثيل ترانسفيراز ، و ksga-سلالات المحذوفة هي مقاومه نسبيا ل kasugamycin. وتم أيضا قياس عمل كاسوغاممايسين بشان الترجمة الخاطئة باستخدام مراسل Nluc/GFP ، كما هو مبين في الشكل 5.
الشكل 1 الرسوم الكاريكاتورية التي توضح النظامين الصحفيين لكسب الوظائف. (ا) يتكون نظام مراسل رينيلا-اليراع من اثنين من الانزيمات لوسيفيراز التي تم التعبير عنها كبروتين الانصهار وتحت سيطرة المروج المحفز. التعبير عن النوع البري الانزيم المزدوج النتائج في النشاط القابل للقياس عاليه من كل من Renilla واللوسياسيس (اعلي). طفرة من بقايا اسبارتات الحرجة ، D120 ، في renilla إلى اسباراجين يجعل انزيم renilla (D120N) غير نشط ، ولكن لا يزال لوسيفيراز اليراع نشطه. ميسترسليشن من اسباراجين إلى اسبارتات (في هذه الحالة ، من misacylated الفسيولوجية Asp -trna الأمان trna5،21) النتائج في نسبه صغيره من البروتينات renilla المترجمة تكتسب النشاط ، والتي يمكن قياسها. المقارنة بين النشاط Renilla/اليراع من المراسل تحور مقارنه مع النوع البرية الانزيم المزدوج يسمح لحساب اسباراجين إلى معدل التعرجات اسبارتات. (ب) يعمل نظام المراسلين التابع لشبكه NLUC/gfp علي مبدا مماثل. الجين المتحول Nluc (D140N) لديه اشاره إفراز N-طرفيه مشتقه من 85A مستضد ، وهو البروتين المتفطرات الرئيسي الذي يفرز. ويتم التعبير عن كل من جينات nluc و gfp من المروجين المتطابقين المحفزين ، للسماح باستخدام gfp كمرجع نسبي للتعبير. لاحظ عدم وجود سلاله السيطرة Nluc من النوع البري: ويستخدم هذا المراسل في المقام الأول في الفرز ، حيث قياسات معدلات التعرج النسبية كافيه للشاشة الاساسيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الخطوط العريضة لقياس معدل التعرج باستخدام مراسل رينيلا-اليراع (القسم 1 من البروتوكول). وتزرع الثقافات الطازجة من m. سميغاتيس, تحولت مع البلازميد التعبير عن الصحفيين luciferase مزدوجة. يتم الحث علي تعبير المراسل ، ويتم اختبار المركبات أو الظروف البحثية. بعد 4-6 h من التعبير مراسل ، والثقافات التي يتم التكوير والتفكيك ويتم اختبار لست] للنشاط المزدوج luciferase. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : الخطوط العريضة لقياس معدل الترجمة الخاطئة لمراسل Nluc-GFP (القسم 2 من البروتوكول). ثقافة جديده من m. سميغاتيس، تحولت مع المراسلين NLUC و gfp ، ونميت إلى حجم كاف لجميع لوحات ليتم اختبارها (علي افتراض ~ 10 مل/96 بئر لوحه). مباشره قبل الأنابيب البكتيرية الثقافة في كل بئر ، والحث علي التعبير عن المراسلين مع ATC أضافه إلى الثقافة السائبة. احتضان الآبار عن طريق هز لهم بين عشيه وضحيها. لقياس معدلات ميسترسليشن النسبية ، نقل الثقافات إلى لوحه سوداء (لزيادة حساسية الكشف عن الفلورية) ، وقياس الفلورية GFP ، ومن ثم ، تدور لوحات وصولا إلى بيليه البكتيريا. نقل ماده طافي إلى لوحه بيضاء لقياس النشاط nluc. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : النتيجة التمثيلية لاستخدام مراسل رينيلا-اليراع قياس معدل التعرج في وجود kasugamycin في سلالات مختلفه. معدلات التعرج من اسبارتات لاسباراجين في (ا) البرية م. سميغاتيس و (ب) سلاله حذفت ل ksga (∆ ksga) بعد العلاج مع kasugamycin (ksg) كما تقاس بواسطة المزدوج رينيلا-اليراع مراسل. وعولجت الثقافات مع kasugamycin في الجرعات المشار اليها (في ميكروجرام/ملليلتر) لمده 6 ساعات قبل تحلل الخلية والقياسات. المعدلات [رن/ف] يصحح ([ي-سترس]) دلاله من ال [اسبارتات] ل اسباراجين [مينزسلايشن رت]. حذف Ksga النتائج في ارتفاع معدل الخط القاعدي ، الذي هو أكثر مقاومه للتعديل من قبل kasugamycin. تشير الاشرطه إلى القيم المتوسطة ، مع الانحراف المعياري كخطا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : النتيجة التمثيلية لاستخدام مراسل Nluc-GFP قياس معدل التعرج في وجود kasugamycin. معدلات التعرج النسبية من اسبارتات لاسباراجين في البرية من نوع m. سميغاتيس كما يقاس من قبل مراسل NLUC/gfp ، بعد العلاج مع kasugamycin (ksg) بين عشيه وضحيها (16 ساعة). تشير الاشرطه إلى القيم المتوسطة ، مع الانحراف المعياري كخطا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ويمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لقياس معدلات التعرج في مجموعه واسعه من الكائنات الحية. وهناك عدد من الاعتبارات التي ينبغي مراعاتها عند تكييف البروتوكول مع النظم الأخرى. أولا ، ينبغي النظر في الغرض من القياس. النسبة للقياس الدقيق لمعدلات الترجمة باستخدام الصحفيين الذي يكسبون الوظائف ، فان المطلوب هو (ا) فحص قراءات قويه (علي سبيل المثال ، الوظيفة الانزيميه [في هذه الحالة ، نشاط لوسيفيراز] مع نطاق خطي عريض). أيضا ، ابحث عن (ب) فقدان وظيفة الطفرة في بقايا حرجه من البروتين المراسل الذي ينتج عنه خسارة كبيره جدا من وظيفة ، اقل من المعدل المتوقع من الغرابة. علي سبيل المثال ، إذا كان معدل ميسترسليشن المتوقع ان يقاس هو تقريبا 10-3/codon ، فان فقدان وظيفة الطفرة يجب ان يكون أكبر من 1,000-اضعاف; والا ، فان النطاق الأقل من الاحداث التي لا يمكن الكشف عنها بحساسية. وأخيرا ، ومن أجل القياس الدقيق لمعدلات الوصول إلى البيانات باستخدام الصحفيين الذي يكسبون الوظائف ، (ج) هناك حاجه إلى مراسله مرجعيه قويه-في هذه الحالة ، للمادة 1 من البروتوكول. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تنصهر المراسل المرجعي إلى المراسل الانزيمي المتحول ، ويضمن (لجميع المقاصد والأغراض) انه يتم التعبير عنهما بنسب متساوية. يجب ان تكون قراءات المقياس المرجعي (والمراسل الأساسي) قويه للاضطرابات في البيئات المكشوفة. علي سبيل المثال ، فان فلوري من نوع البرية GFP عرضه للاضطراب بواسطة التغيرات في الأس الهيدروجيني28، مما يجعلها غير مناسبه كمعيار لقياس معدلات الانحراف في المتفطره الفطرية في الضامة ، والتي تقيم في التماثيل التي هي تحت درجه الحموضة 729. من ناحية أخرى ، بالنسبة للتطبيقات مثل الفرز جزيء صغير ، والاعتبارات الأكثر اهميه للشاشة الاوليه سيكون استنساخ القياسات (اي الدقة ، بدلا من الدقة) ، وتقليل المناولة اليدوية ، والصغيرة مجلدات الثقافة. والقياسات الدقيقة لمعدلات التعرجات اقل اهميه ويمكن أداؤها كاختبارات ثانويه. وأخيرا ، تجدر الاشاره إلى ان المراسلين الموصوفة في هذا البروتوكول ، استنادا إلى الوظيفة الانزيميه لانزيمات لوسيفيراز ، سوف تقيس فقط معدلات التعرجات المتوسطة للسكان البكتيرية ولكن لا يمكنها إعطاء معلومات حول عدم تجانس الخلية الواحدة الاختلاف في معدلات التعرج. النظر إلى اهميه التغير في الخلية الواحدة في الأنماط الظاهرية المتكيفة30،31،32، تم تطوير الصحفيين الفلوريين لقياس احداث ميسترسليشن12،33 ، بما في ذلك لقياس الغرابة في المتفطره5.
وبعد النظر في متطلبات قياس الغرابة ، تجدر الاشاره إلى انه لا يمكن للصحفيين الذين يكسبون الوظيفة الجينية مثل الموصوفة في هذا البروتوكول سوي قياس نوع واحد من الغرابة (اي استبدال أحد الأحماض الامينيه لأحد codon) لكل مراسل. لذلك ، لقياس الاحداث المختلفة ، مطلوب مراسلين متعددين. علي سبيل المثال ، لقياس الأخطاء التي قام بها ريبوسمال فك التشفير من المخطوطات شبه المتشابهة من قبل lysyl-trna في موقف واحد ، مطلوب ما لا يقل عن 16مراسلين 2،3،11. وتسمح القياسات الطيفية العالية الدقة والمعلوماتية الحيوية بالتعرف المحتمل للعديد من الأنواع المختلفة للاحداث التي حدثت في الوقت نفسه18؛ ومع ذلك ، تاتي هذه الأساليب أيضا مع المحاذير. وبصفه عامه ، فانها اقل دقه من الصحفيين الذي يكسبون وظيفتهم. وعلاوة علي ذلك ، وكما ذكر سابقا ، فهي اقل ملاءمة للكشف عن أنواع معينه من الغرابة ، وهي تلك التي يمكن الخلط بينها وبين التشوه غير الانزيمي23. وأخيرا ، فان قياس الطيف الكتلي غير مناسب كقراءه للفحص المتوسط أو العالي الانتاجيه.
ولتكييف هؤلاء المراسلين والبروتوكولات لقياس الغرابة في النظم الأخرى ، تشمل الاعتبارات الأخرى تعبيرا قويا عن المراسل في النظام النموذجي المطلوب. حاولنا في البداية استخدام نظام الثنائية luciferase التي وضعتها فاراباوغ والزملاء في نظام المتفطرات لدينا دون تعديلات ولكن لم تنجح ، وذلك بسبب عدم وجود التعبير مراسل. كشفت استكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعه النطاق ان كلا codon-الأمثل وتعديل تسلسل طفيفه للصحفيين كانت مطلوبه للسماح للتعبير قويه25 (وانظر أعلاه). ومن المتصور انه سيلزم إدخال تعديلات مماثله علي المراسلين لاستخدامها في نظم أخرى.
وأخيرا ، ينبغي إيلاء الاعتبار لنوع الحدث الذي يجري قياسه. علي سبيل المثال ، إذا كان هناك حاجه لقياس التوقف-codon readthrough (قمع هراء) ، وفقدان codon التوقف عن وظيفة الطفرة يحتاج إلى إدخالها داخل منطقه غير حرجه من البروتين مراسل الاساسيه34. خلاف ذلك ، فقط محدده هراء قمع الاحداث التي تستعيد البقايا الحرجة (و ، التالي ، وظيفة مراسل) سيتم قياسها من قبل الفحص ، والتي من شانها ان تؤدي إلى التقليل من القيمة الحقيقية لمعدلات الغرابة. وهناك أدله متزايدة علي ان الخطا الانتقالي يلعب دورا متكيفا محتملا في عدد كبير من الكائنات الحية1و12و13و35. ومع ذلك ، فان قياس الاحداث التي لا تزال محصورة في عدد صغير ، وان كان متزايدا من الأنواع النموذجية. التكيف مع الأساليب الحساسة لقياس الغرابة لديه القدرة علي زيادة فهم العلماء لدور خطا الترجمة في علم وظائف الأشخاص والامراض.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بالمنح المقدمة من مؤسسه بيل وميليندا غيتس (OPP1109789) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31570129) ، وأموال بدء التشغيل من كليه الطب في جامعه تسينغهوا إلى ب. ب. هو صندوق ويلكوم ترست محقق (207487/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
| Anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
| Kasugamycin | sigma | K4013 | |
| Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
| Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
| Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
| Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
| Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
| 96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
| Non-commercial reagents (plasmids) | |||
| pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
| pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
| pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
| pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |
References
- Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B.
- Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase. Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).
- Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors. RNA. 20 (1), 9-15 (2014).
- Netzer, N., et al. Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity. Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).
- Su, H. W., et al. The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity. Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).
- Li, L., et al. Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).
- Li, L., et al. Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).
- Ling, J., Soll, D. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).
- Raina, M., et al. Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons. Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Wu, J., Fan, Y., Ling, J. Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase. Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).
- Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA. 13 (1), 87-96 (2007).
- Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions. mBio. 9 (4), (2018).
- Mohler, K., Ibba, M. Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress. Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).
- Bullwinkle, T. J., et al. Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code. Elife. 3, (2014).
- Fan, Y., et al. Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness. Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).
- Fan, Y., et al. Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).
- Schwartz, M. H., Pan, T. Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures. Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).
- Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Curnow, A. W., et al. Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).
- Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).
- Chaudhuri, S., et al. Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation. eLife. 7, (2018).
- Toosky, M., Javid, B. Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis. British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B.
- Miura, S., et al. Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins. European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).
- Javid, B., et al. Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).
- Wong, S. Y., et al. Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).
- Wiker, H. G., Harboe, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6, 28166 (2016).
- Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion. Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).
- Aldridge, B. B., et al. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science. 335 (6064), 100-104 (2012).
- Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity. Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).
- Zhu, J. H., et al. Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription. Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).
- Lant, J. T., et al. Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells. RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4 (4), 479-486 (1998).
- Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
