Summary
Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
Abstract
Virussen die door mensen en dieren worden uitgescheiden, kunnen waterbronnen besmetten en een risico vormen voor de menselijke gezondheid wanneer dit water wordt gebruikt voor het drinken, voedsel irrigatie, wassen, enz. De klassieke fecale bacterie indicator controleert niet altijd op de aanwezigheid van virale pathogenen, dus de opsporing van virale pathogenen en virale indicatoren is relevant om maatregelen van risicobeperking vast te stellen, met name in humanitaire scenario's en in gebieden waar door water overgedragen virale uitbraken frequent zijn.
Op dit moment zijn er verschillende commerciële tests beschikbaar die de kwantificering van fecale indicator bacteriën (FIB) mogelijk maken om te testen op het punt van gebruik. Dergelijke commerciële tests zijn echter niet beschikbaar voor de opsporing van virussen. Voor de opsporing van virussen in milieuwater monsters moet een aantal liters in kleinere volumes worden geconcentreerd. Bovendien vertrouwt de opsporing van virussen eenmaal geconcentreerd op methoden zoals nucleïnezuur extractie en moleculaire detectie (bijv. polymerase-kettingreactie [PCR]-gebaseerde assays) van de virale Genomes.
De hier beschreven methode maakt de concentratie van virussen uit 10 L watermonsters, evenals de extractie van virale nucleïnezuren op het punt van gebruik, met eenvoudige en draagbare apparatuur. Dit maakt het testen van watermonsters op het punt van gebruik voor verschillende virussen mogelijk en is nuttig in humanitaire scenario's, evenals in elke context waarin een uitgerust laboratorium niet beschikbaar is. Als alternatief kan de methode het concentreren van virussen aanwezig zijn in watermonsters en de verzending van het concentraat naar een laboratorium bij kamertemperatuur voor verdere analyse.
Introduction
In de eerste fasen van humanitaire noodsituaties zijn de toegang tot schoon water, sanitaire voorzieningen en hygiëne van cruciaal belang voor het voortbestaan van de betrokkenen. Daarom is het bewaken van de waterkwaliteit een prioriteit om uitbraken van water te voorkomen. Het is bekend dat verontreinigd water vaak de oorsprong van ziekten is, maar het is vaak moeilijk om de bronnen van virale uitbraken zoals het hepatitis E-virus (HEV) te bepalen, zelfs met de beschikbaarheid van conventionele laboratoriummethoden. De controle van de waterkwaliteit is gebaseerd op de kwantificering van FIB1,2,3,4. Er is echter uitgebreid gedocumenteerd dat er geen correlatie is tussen de afwezigheid van FIB en de aanwezigheid van virale watergedragen pathogenen zoals Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) of HEV5,6. Het gebruik van de water kwaliteitscriteria op basis van FIB kan dus leiden tot een onderschatting van de Risico's die verbonden zijn aan de aanwezigheid van watergedragen virale pathogenen. De surveillance van indicator virussen, zoals humane adenovirussen (hadv), of specifieke pathogenen zou nuttig zijn bij het bepalen van de blootstelling aan virale pathogenen en het identificeren van de potentiële bron van menselijke infectie7,8, 9,10 en bij de validering van de werkzaamheid van sanitaire maatregelen11.
Tot nu toe waren de opsporing van virussen in deze scenario's gebaseerd op vakkundig personeel en complexe logistiek. VirWaTest (virwatest.org) is gericht op de ontwikkeling van een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode voor de concentratie en de daaropvolgende opsporing van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
De virusconcentratie is gebaseerd op het principe van biologische flocculatie van 10 L watermonsters, waardoor virussen worden teruggewonnen in kleinere volumes12,13. De vlokken worden verzameld en toegevoegd aan een buffer die de virussen lyseert en voorkomt de nucleïnezuren van afbraak wanneer ze bewaard bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 2 weken.
De nucleïnezuur extractiemethode is gebaseerd op het gebruik van magnetische deeltjes waaraan de nucleïnezuren worden geadsorreven. Ze kunnen worden overgebracht van de ene spoel buffer naar de andere en uiteindelijk in de elutie buffer met behulp van een magnetische pipet waaraan de deeltjes hechten. Viraal nucleïnezuur suspensies verkregen kunnen worden verzonden naar een referentielaboratorium waar de detectie kan worden uitgevoerd met behulp van moleculaire methoden op basis van PCR. Voor elke extractie van nucleïnezuur worden twee verschillende hoeveelheden getest om enzymatische remming uit te voeren, ontstaan door het monster. Als alternatief, met minimale beschikbaarheid van apparatuur, kunnen PCR-tests worden uitgevoerd op het punt van gebruik. Het gehele proces is ontworpen om onafhankelijk van een stroomtoevoer te worden uitgevoerd (Figuur 1).
Een kwantitatieve PCR-test voor het opsporen van HAdV, uitgescheiden door de mens en gevonden in afvalwater monsters in hoge concentraties, is aangepast om te worden uitgevoerd op het punt van gebruik. HAdV worden gebruikt als menselijke fecale virale indicatoren. Een PCR voor de kwantificering van ms2 bacteriofaag is ook aangepast sinds ms2 wordt gebruikt in virwatest als procesbeheersing. De methode kan worden aangepast voor de opsporing van een virus van belang.
Na de ontwikkeling, de VirWaTest methode is toegepast door de gebruikers in twee verschillende instellingen in de Republiek van Centraal-Afrika (RCA) en Ecuador, het verstrekken van feedback over de toepassing van het protocol in reële situaties.
Voor onze kennis is dit de eerste procedure die de concentratie en opsporing van virussen op het punt van gebruik mogelijk maakt, onafhankelijk van elke voeding, grote apparatuur en Vries-/koelingcondities. Het wordt aanbevolen om twee replicaten van elk watermonster te verzamelen om robuuste resultaten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding en verpakking
Opmerking: de te verpakken materialen/apparatuur staat in tabel 1. Gebruik handschoenen om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de procesbeheersing, de concentratie reagentia, de nucleïnezuurextractie reagentia en de detectie reagentia. Draag een beschermende bril om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de extractie van nucleïnezuur.
- Procescontrole
- Bereid ms2 bacteriofaag Stock Culture (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) met 1 x 1010 Pfu/ml in het laboratorium volgens de ISO-procedure 10705-1:199514.
- Vervolgens, aliquot 10 μL van de suspensie per buis met 1 x 108 Pfu in 10 ml buisjes en laat het water verdampen bij 37 °c. Gebruik één buis per watermonster.
- Bereid bovendien één buisje met 10 mL steriel gedestilleerd water per verzameld monster.
- Concentratie reagentia
- Gebruik voor de preflocated magere melkoplossing (PSM) de volgende bedragen om 5 10 L watermonsters te concentreren.
- Maak een plastic buisje met 5 g magere melk.
- Maak een rits plastic zak met 16,66 g zeezouten.
- Maak een plastic flesje met 500 mL gedistilleerd water.
- Bereid de reagentia die nodig zijn voor de pH-aanpassing. Gebruik de volgende bedragen om de pH van de PSM en van 5 10 L watermonsters aan te passen.
- Voeg 5 g citroenzuur 1-hydraat toe aan een plastic buisje van 10 mL.
Let op: citroenzuur veroorzaakt ernstige irritatie wanneer het in aanraking komt met de ogen. Als dit gebeurt, spoel het oog voorzichtig met water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt, een arts raadplegen. - Zet 2 g natriumhydroxide in een plastic buisje van 10 mL.
Let op: natriumhydroxide kan ernstige brandwonden en oogbeschadigingen veroorzaken. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de ogen, voorzichtig afspoelen met water gedurende enkele minuten. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen. - Breng 25 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.
- Plaats 50 mL steriel gedestilleerd water in een plastic bakje.
- Voeg 5 g citroenzuur 1-hydraat toe aan een plastic buisje van 10 mL.
- Bereid het monster conditionerings zakje dat wordt gebruikt voor de flocculatie, de conserverings oplossing die wordt gebruikt om de nucleïnezuren te behouden en het neutraliserende sachet om het afgedankte water en de materialen te neutraliseren. Gebruik de volgende bedragen voor elk 10 L-watermonster dat moet worden getest.
- Zet 15 g zeezouten en 8 g citroenzuur 1-hydraat in een rits plastic zakje voor het conditionerings zakje.
- Voeg 2 mL lysisbuffer (tabel met materialen) en 0,3 ml nucleïnezuur conserveringsmiddel (Inhoudsopgave) toe aan een buisje van 5 ml.
Let op: lysisbuffer bevat guanidine thiocyanaat en Triton X-100. Contact met zuur bevilt giftig gas, en het is schadelijk bij inslikken, geïnhaleerd of in aanraking komt met de huid. Na inslikken de mond spoelen. Geen braken opwekken. Als het in aanraking komt met de huid, wassen met veel water. Vervolgens, deskundig medisch advies inwinnen. Het conserveringsmiddel voor nucleïnezuur veroorzaakt huid-en oogirritatie en is schadelijk bij inslikken. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. In ieder geval, vooral bij inslikken en zich onwel voelen, deskundig medisch advies inwinnen. - Zet 40 g wasmiddel poeder in vier rits plastic zakken.
Let op: poeder reinigingsmiddel veroorzaakt oogirritatie. Als het in aanraking komt met de ogen, spoelen met overvloedig water gedurende enkele minuten. Als de irritatie aanhoudt of bij inslikken, een arts raadplegen.
- Gebruik voor de preflocated magere melkoplossing (PSM) de volgende bedragen om 5 10 L watermonsters te concentreren.
- Reagentia voor nucleïnezuur extractie
- Plaats 50 μL magnetische deeltjes (tabel met materialen) en 1 ml ethanol 96% in een buisje van 5 ml die de bindende buffer vormen.
Let op: de magnetische deeltjes buffer bevat natrium azide, die een giftig gas vormt wanneer het in contact komt met zuren of zware metalen ionen en giftig is bij inname of wanneer het in aanraking komt met de huid. Indien ingenomen of in aanraking met de huid, spoel de mond of de huid met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen. Ethanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp en veroorzaakt ernstige oogirritatie. Verwijderd houden van hitte, hete oppervlakken, vonken en andere ontstekingsbronnen. Als het in aanraking komt met de huid of de ogen, spoel dan af met overvloedig water. In geval van inname van grote hoeveelheden water en/of bij inademing, ga naar buiten in de frisse lucht. In ieder geval, deskundig medisch advies inwinnen. - Voeg respectievelijk 500 μL, 600 μL en 200 μL wasbuffers 1, 2 en 3 (tabel met materialen) toe aan drie buisjes van 2 ml.
Let op: wasbuffers bevatten teruggehydrolyseerd thiocyanaat en teruggehydrolyseerd chloride, die schadelijk zijn bij inademing of inslikken en de huid en ogen irriteren. Contact met zuren vrijkomen zeer giftig gas. Als ze in aanraking komen met de huid of ogen, spoel dan af met overvloedig water. Na inslikken de mond met overvloedig water afspoelen. Geen braken opwekken. Altijd deskundig medisch advies inwinnen. - Voeg 120 μL elutie buffer (tabel met materialen) toe aan een buis van 0,5 ml.
- Plaats 50 μL magnetische deeltjes (tabel met materialen) en 1 ml ethanol 96% in een buisje van 5 ml die de bindende buffer vormen.
- Reagentia voor HAdV en MS2 detectie
Opmerking: twee verschillende nucleïnezuurextractie reacties kunnen gelijktijdig in elke PCR-test worden geanalyseerd als een 8-well Thermocycler wordt gebruikt. Voor alle PCR-assays, bereid moleculaire biologie water aligeciteerd in 1,5 mL buizen.-
HAdV-detectie
- Bereid een mengsel met 10 μL 22,5 μM AdF voorwaarts primer, 10 μL van 22,5 μM AdR reverse primer en 5 μL 11,25 μM AdP-sonde (tabel 2).
- Voeg 2,5 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.
- Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.
- Bereid een seriële verdunning van DNA-suspensies die de nucleotide-sequentie van de versterkte HAdV-regio bevatten. Lucht drogen 1 μL suspensies met 1 x 105, 1 x 107en 1 x 109 GC/ml in buizen 6-8.
Opmerking: Houd de buizen met de primers, sonde en de Luchtgedroogde suspensies beschermd tegen licht.
-
MS2-detectie
- Bereid een mengsel met 10 μL 25 μM pecson-2F voorwaartse primer, 10 μL 25 μM pecson-2R omgekeerde primer en 2,5 μL 25 μM PecP-2 sonde (tabel 2).
- Voeg 2,25 μL van de mix toe aan buizen 1 tot en met 8 van een buis strook. Laat het drogen bij kamertemperatuur, sluit de buizen en houd ze beschermd tegen het licht.
- Snijd de strook die het verdeelt in twee strips: buizen 1-5 en buizen 6-8.
- Ga verder zoals in stap 1.4.1.4 maar gebruik een standaard suspensie ontworpen voor MS2 in plaats daarvan.
-
HAdV-detectie
2. virale concentratie
Opmerking: gebruik handschoenen te allen tijde tijdens de monsterverzameling, reagens voorbereiding, flocculatie, vlokken-inzameling en afvalverwijderings procedures. Draag een beschermende bril tijdens de reagens bereidings procedure.
- Monsterverzameling
- Verzamel een watermonster van 10 L in een vlakke bodem emmer met deksel. Verzamel voor elk monster minimaal twee replicaten.
Opmerking: het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om de pellet te visualiseren. Als het watermonster gesuspendeerd materiaal bevat (bijv. zand, algen), laat het dan sediment en verzamel vervolgens het water supernatant in een nieuwe emmer. - Registreer het verzamelde volume, evenals de locatie en de afhaaldatum, voor elk watermonster.
- Zet een magneetroerder aangesloten op een batterij onder een emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op zijn steun.
Let op: Zoek een vlakke ondergrond op een frisse plek en bewaar de emmers met de watermonsters van direct zonlicht.
- Verzamel een watermonster van 10 L in een vlakke bodem emmer met deksel. Verzamel voor elk monster minimaal twee replicaten.
- Bereiding van reagentia
-
pH-aanpassing reagentia
- Giet het citroenzuur poeder en de natriumhydroxide pellets in de potten met respectievelijk 25 en 50 mL gedistilleerd water.
- Schud voorzichtig met de hand totdat het citroenzuur en het natriumhydroxide volledig zijn opgelost.
Let op: giet het water niet over de natriumhydroxide pellets. Giet in plaats daarvan de natriumhydroxide pellets over het water.
-
Preflocated magere melk
- Plaats een opbergtas op een magneetroerder en giet er 500 mL gedistilleerd water in. Laat een roer magneet in de zak vallen en zet de magneetroerder aan.
- Giet de inhoud van een zeezout zakje en een magere melk buis in de opbergtas en roer gedurende 5 minuten op middelhoog toerental om ze op te lossen.
- Voeg 3 mL citroenzuur toe aan de PSM-oplossing met behulp van een Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Meet de pH van de PSM-oplossing met behulp van pH-indicator stroken. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.
- Schakel de magnetische roerder uit en zorg ervoor dat de vlokken zichtbaar zijn. Gebruik een zaklamp om de flocs te visualiseren.
-
pH-aanpassing reagentia
- Flocculatie
- Laat een roer magneet in het watervallen, stel de magnetische roerder op de maximumsnelheid in en zet hem aan. Zorg ervoor dat de roer magneet begint te draaien.
- Voeg 10 mL gedistilleerd water toe aan een procescontrole buis. Inverteer de buis een paar keer om de virale voorraad te hydrateren en giet de oplossing in het water.
- Giet de inhoud van één monster conditionerings zakje in het water en roer gedurende 5 min.
- Meet de pH van het watermonster met behulp van pH-indicator stroken. Voeg enkele druppels citroenzuur of natriumhydroxide toe aan het watermonster om ervoor te zorgen dat de pH tussen 3,4 en 3,6 ligt. Voeg kleinere hoeveelheden citroenzuur en natriumhydroxide toe naarmate de pH dichter bij 3,5 komt.
- Voeg 100 mL van de PSM-oplossing toe met een 100 mL verpakking.
- Sluit de emmer met het deksel, zet de magnetische roerder op minimale snelheid, en laat het water roeren voor 8 uur.
- Schakel de magnetische roerder uit en laat het water nog minstens 5 uur staan om de vlokken te laten vestigen.
- Floc collectie
- Bouw een sifoning-systeem bestaande uit een pipet controller, twee pipetten en een plastic buis om het water supernatant te zuigen voor het ontladen van het water op de flocs.
- Bevestig een 10 mL tape-end pipet aan de pipet controller. Bevestig de pipetpunt vervolgens aan de plastic buis.
- Verwijder het filter van een 10 mL pipet met open punt met een pincet en bevestig de pipet aan de plastic buis.
- Plaats een lege emmer op de vloer.
- Dompel de punt van de pipet met open punt onder in het water. Zorg ervoor dat u het dicht bij het wateroppervlak houdt om te voorkomen dat de flocs worden verstoord. Zuig het water supernatant tot het de tape-end pipet bereikt.
- Knijp de plastic buis aan het uiteinde vast op de pipet met de tape en maak deze los van de pipet.
- Plaats de buis in een lege emmer. Laat de druk op de buis los om het water in de lege emmer te laten stromen.
- Knijp de plastic buis om de waterstroom te stoppen wanneer het waterniveau op het moment is om de roer magneet te bereiken en beweeg de pipet weg van de emmer.
- Schud de emmer om de vlokken te hervatten en giet ze in een opstaande plastic zak van 500 ml. Laat de vlokken zich 1 uur meer vestigen.
- Zuig de water supernatant voorzichtig op met een pipet van 50 mL en een handmatige pipet controller, waarbij de flocs niet storend worden.
- Aspireren de vlokken met behulp van een 100 ml pipet en breng ze over naar een 50 ml gegradueerde centrifugebuis. Noteer het uiteindelijke volume van het monster concentraat en breng 1 mL ervan over in een buisje van 5 mL met de conserverings oplossing, met behulp van een Pasteur-pipet.
Opmerking: het is belangrijk dat de centrifugebuis is afgestudeerd, zodat het uiteindelijke volume van het geconcentreerde monster zo nauwkeurig mogelijk en geregistreerd kan worden gemeten. - Voer de nucleïnezuur extractie in het veld. U ook de conserverings oplossing met de virussen bewaren bij 20-30 °C gedurende maximaal 15 dagen of deze naar een referentielaboratorium verzenden voor verdere analyse.
- Bouw een sifoning-systeem bestaande uit een pipet controller, twee pipetten en een plastic buis om het water supernatant te zuigen voor het ontladen van het water op de flocs.
- Afvalverwijdering en hergebruik van materiaal
- Voeg de inhoud van een neutraliserend middel zakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water, en laat het nog 30 min.
- Gooi het behandelde water weg als algemeen afval.
- Plaats de pipetten en de plastic buis in de emmer. Vul de emmer met water en giet de inhoud van één neutraliserend middel zakje.
- Was ze minstens 30 minuten om ze te steriliseren en spoel ze met overvloedig schoon water om eventueel overgebleven neutraliserend middel te verwijderen.
3. nucleïnezuur extractie
Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur extractieprocedure.
-
Magnetische pipet bewerking
- Raak vertrouwd met de werking van de magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert.
-
Nucleïnezuur extractie
- Verdeel de buisjes met de reagentia die nodig zijn voor de extractie in een rek van links naar rechts: bindings buffer, wasbuffers en elutie buffer. Stel het juiste aantal buisjes in volgens het aantal monsters of replicaten dat wordt geanalyseerd.
- Breng 1 mL monster concentraat over in de buis met de bindings buffer met behulp van een wegwerp Pasteur-pipet. Inverteer de buis 8x tot 10x om de oplossing te homogeniseren.
- Inbroed de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tijdens het continu mengen, hetzij met behulp van een op zonne-energie aangedreven orbitaal of handmatig.
- Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van de magnetische pipet en een schone tip, die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers.
- Laat de magnetische deeltjes in de buis met 500 μL wasbuffer 1. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
- Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 600 μL wasbuffer 2. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
- Breng de magnetische deeltjes over in de buis met 200 μL wasbuffer 3. Was ze door het zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor 30 s en Verzamel ze.
- Laat de magnetische deeltjes in de buis met de elutie buffer los en gooi de punt weg.
- Inincuberen de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tijdens het continu mengen, met behulp van de orbitale zonne-energie.
Opmerking: het mengen van de magnetische deeltjes in de elutie buffer is een cruciale stap. In geval van gebrek aan een orbitaal, continu mengen met de hand tijdens de incubatietijd. - Vervang de punt op de magnetische pipet door een nieuwe en verzamel de magnetische deeltjes uit de elutie buffer. Zorg ervoor dat u de magnetische deeltjes uit de elutie buffer volledig verwijdert, omdat ze de moleculaire detectiemethoden kunnen verstoren.
- Gooi de punt weg met de daaraan gehechte deeltjes. Ga verder met de PCR-analyse, verzend de elutie buffer naar een referentielaboratorium of bewaar de elutie buffer bij 4 °C voor verdere analyse.
4. virale detectie met een batterij-aangedreven acht-buis real-time Thermo cycler
Opmerking: gebruik handschoenen en draag altijd een beschermende bril tijdens de nucleïnezuur detectieprocedure. Vervang de handschoenen voor nieuwe bij het uitvoeren van een nieuw PCR-experiment om kruisbesmetting te voorkomen.
-
HAdV kwantitatieve PCR
- Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.
- Voeg 4 μL PCR-mix toe aan buizen 1-5.
- Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.
- Voeg 2 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 2 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.
- Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buizen 6, 7 en 8.
- Voeg 4 μL van deze mix toe aan buizen 6, 7 en 8, en sluit ze.
- Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).
- Gooi de waterbuis weg en houd het geëxtraheerde nucleïnezuur in de vriezer, indien mogelijk, of, zo niet, op een verse plek beschermd tegen licht in het geval er een tweede test moet worden uitgevoerd.
- Reinig de micropipetten, het rek, het werk materiaal en alle materiaal goed met een nucleïnezuur reiniger en gooi de plastic zak met de gebruikte tip, handschoenen en buizen weg.
Let op: nucleïnezuur Remover is een zeer licht ontvlambare vloeistof en stoom. Adem de spray nevel niet in en Vermijd contact van de vloeistof met de ogen of de huid. Anders onmiddellijk spoelen met overvloedig water en deskundig medisch advies inwinnen. - Verzamel de resultaten en analyseer de verkregen gegevens.
-
MS2 kwantitatieve PCR
- Voeg 14 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 2, 4 en 5.
- Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan buizen 1-5.
- Voeg 14 μL nucleïnezuur extractie toe van Monster A tot buis 1 en 14 μL van monster B tot buis 3.
- Voeg 1 μL geëxtraheerde nucleïnezuren toe van Monster A tot buis 2 en 1 μL van monster B tot buis 4. Sluit de vijf-buis strip.
- Voeg 15,5 μL Nuclease vrij water toe aan de buisjes 5, 6, 7 en 8 en sluit ze af.
- Voeg 4 μL PCR-mix en 0,5 μL reverse transcriptase-enzym toe aan de buisjes 6, 7 en 8.
- Plaats beide stroken in de thermocycler en selecteer de juiste uitvoering (tabel 3).
- Ga verder zoals beschreven in de stappen 4.1.8 naar 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Methodeontwikkeling
Deze procedure is ontwikkeld in het laboratorium van virussen verontreinigingen van water en voedsel met de samenwerking van GenIUL en Oxfam Intermón. Het bestaat uit drie verschillende stappen. De eerste, de virale DEELTJESCONCENTRATIE, is een aanpassing van een mageremelkflocculatie methode die eerder werd beschreven12,17,18. De oorspronkelijke methode werd aangepast om onafhankelijk te zijn van een voeding, eenvoudiger en zonder centrifugeren stappen.
Het herstel van de VirWaTest-concentratie methode werd getest in HAdV-en MS2-bacteriopragespiked grondwater monsters. Het virale herstel van de VirWaTest-concentratie en extractiemethode werd geschat op 3,01% tot 18,02% voor MS2 en 17,52% tot 44,22% voor HAdV. Deze terugvorderingen werden berekend op basis van de waarden verkregen door kwantitatieve PCR tijdens de ontwikkeling van de methode in vergelijking met de initiële concentraties van HAdV en MS2 in de watermonsters na ze te hebben bespiking met bekende concentraties van deze virale voorraden.
De VirWaTest magnetische nucleïnezuur extractie werd vergeleken met een commerciële RNA Mini Kit (bijv. QIAamp Viral RNA Mini Kit), een kolom gebaseerde extractiemethode gebruikt in het laboratorium, door het testen van 33 rivieren en grondwater monsters spiked met HAdV en MS2 en geconcentreerd door de flocculatie van magere melk. De vergelijkingsresultaten toonden aan dat de VirWaTest methode Recovery hoger was in 23/33 gevallen voor HAdV, evenals voor MS2 (tabel 4). Een Wilcoxon-test toonde p-waarden van 0,0005569 voor hadv en 0,02791 voor ms2. Virwatest nucleïnezuur extractie biedt significant hogere virale terugvorderingen dan de commerciële.
Detectie van HAdV in milieuwater monsters geconcentreerd door de VirWaTest methode
Om de ontwikkelde methode voor virale concentratie in het veld te testen, heeft het Oxfam water, sanitatie en hygiëne (WASH) team, gelegen in Banghi (RCA) in maart 2017, verzamelde en geconcentreerde virussen uit vijf goed water monsters.
Ook op het gebied van Pedernales (Ecuador), dat werd beïnvloed door aardbevingen in 2016 en 2017, werden zes waterput monsters verzameld door een Oxfam WASH team in februari 2017, en de virussen werden geconcentreerd door de VirWaTest concentratie methode. Virale concentraten van beide instellingen werden naar het laboratorium in Barcelona gestuurd voor VirWaTest nucleïnezuurextractie en virale kwantificering.
In Ecuador werden van nature voorkomende HAdV aangetroffen in zes van de zes geanalyseerde monsters, met concentratiewaarden variërend van 3,27 x 101 tot 1,80 x 102 GC/L, terwijl één van de vijf monsters die werden verzameld en geconcentreerd in banghi (RCA) getest positief voor HAdV, bij een concentratie van 3,46 x 102 GC/L (tabel 5).
MS2, toegevoegd aan alle geteste monsters als interne procescontrole, werd gedetecteerd in alle geteste monsters, waaruit blijkt dat de methode correct werd uitgevoerd van concentratie tot detectie.
Figuur 1 : Virwatest methode. Overzicht van de stappen de VirWaTest-methode bestaat uit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Materialen | Concentratie | Nucleïnezuur extractie | Detectie |
| Apparatuur | Magnetische roerder (2 eenheden) Batterij (2 eenheden) Batterij/roerder connectoren (2 units) Stroom adapters (2 eenheden) Bucket ondersteuning (2 eenheden) Touw (1 eenheid) Roer magneet (3 stuks) Pincet (1 eenheid) Silicium slangen (1 eenheid) Pipet controller (1 eenheid) Marker (1 eenheid) |
Magnetische Pipet (1 eenheid) Solar Rotary platform (1 eenheid) Multi-size Tube rack (1 eenheid) Timer (1 eenheid) |
Thermocycler (1 eenheid) Batterij (1 eenheid) Computer Tube rack (1 eenheid) 0,5 μL-10 μL micro Pipet (1 eenheid) 2 μL-20 μL micro Pipet (1 eenheid) |
| Verbruiksgoederen en reagentia (voor elke 2 watermonsters/replicaten) | Emmer (3 stuks) pH-indicator stroken Pipet uiteinde 10 mL (2 eenheden) 10 mL pipet met open punt (2 eenheden) Tape-end 50 mL Pipet (2 eenheden) Tape-end 100 mL Pipet (2 eenheden) Pasteur-Pipet (4 eenheden) Opstaand plastic zakje (4 stuks) Plastic bakje met 25 mL gedistilleerd water (1 eenheid) Plastic container met 50 mL gedistilleerd water (1 eenheid) 100 mL lege verpakking (1 eenheid) Handschoenen (6 paar) Procesbesturing (2 tubes) Buis met 10 mL gedistilleerd water (2 eenheden) Citroenzuur (1 buis) Natrium hydroxide (1 buis) Magere melk (1 tube) Citroenzuur sachet (1 eenheid) Gedistilleerd water (1 500 mL fles) Proef conditionering (2 sachets) Conserverings oplossing (2 tubes) Neutraliserend middel (4 sachets) |
Magnetische pipetpunten (2 eenheden) Pasteur-Pipet (2 eenheden) Binding buffer (2 tubes) Wasbuffer 1 (2 tubes) Wasbuffer 2 (2 tubes) Wasbuffer 3 (2 tubes) Elutie buffer (2 tubes) Handschoenen (6 paar) |
Micro pipetpunten 10 μL (1 doos) Micro pipetpunten van 20 μL (1 doos) DNA qPCR mix (1 tube) RNA qPCR mix (1 tube) Reverse transcriptase enzym (1 buis) Moleculaire biologie water (1 tube) HAdV buis strip met primers, sonde en standaard (1 eenheid) MS2 buis strip met primers, sonde en standaard (1 eenheid) Nucleïnezuur Remover Handschoenen (6 paar) |
Tabel 1: VirWaTest inhoud. Apparatuur, verbruiksartikelen en reagentia die moeten worden voorbereid op de concentratie, extractie en detectie van virussen in twee watermonsters/-replicaten.
| Virus | Inleidingen | GenBank Toetredingsnr. | Positie | Sequentie (5 ' \u20123 ') | Lengte | Verwijzing | ||
| Humaan adenovirus (HAdV) | Adf | J 01917.1 | 18869\u201218887 | Een van de meest te gekke | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | Een van de meest GEKKEN | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 Bacteriophage (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659 \ u2012678 | Een van de meest GEKKEN | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabel 2: oligonucleotiden voor kwantitatieve PCR-experimenten. Primers en sonde ontworpen om te binden aan nucleïnezuur sequenties van HAdV en MS2.
| Temperatuur | Tijd | Cycli | Temperatuur | Tijd | Cycli |
| 95 °C | 12 min. | 1 | 55 °C | 15 min. | 1 |
| 95 °C | 10 min. | 1 | |||
| 95 °C | 15 s | 40 | 95 °C | 15 s | 40 |
| 60 °C | 1 min | 60 °C | 1 min |
Tabel 3: thermische condities voor kwantitatieve PCR-experimenten. Temperatuur, tijd en cycli gebruikt voor HAdV en MS2 amplificatie.
| QIAgen | VirWaTest | QIAgen | VirWaTest | ||
| Mediaan | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Bedoel | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-waarde (Wilcoxon) voor HAdV: 0,0005569 | |||||
| p-waarde (Wilcoxon) voor MS2:0,02791 | |||||
| Virus getest | Geteste monsters | QIAgen | VirWa-test | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabel 4: VirWaTest ontwikkeling van nucleïnezuur extractie. Mediaan, gemiddelde en SD waarden verkregen bij het vergelijken van de Qiagen en VirWaTest extractiemethoden in 33 grondwater monsters voor HAdV en MS2.
| Land | Site | Monster | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, dorp 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, dorp 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Boorgat A | 6 | 7,96 x 101 |
| Boorgat B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Boorgat C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Goed water een | 9 | 6,06 x 101 | |
| Well water B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Well water C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabel 5: kwantificering van HAdV met behulp van de VirWaTest methode. Kwantitatieve PCR-resultaten, uitgedrukt in GC/liter, voor HAdV gekwantificeerd in watermonsters verzameld en geconcentreerd uit RCA en Ecuador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De VirWaTest methode maakt de concentratie van virussen en nucleïnezuur extractie van watermonsters op het punt van gebruik door niet-ervaren gebruikers. Het is een betaalbaar, snel en eenvoudig protocol. De concentratie is gebaseerd op het principe van organische flocculatie met behulp van magere melk, waarbij de lage pH-en hoge geleidbaarheids condities het gebruik van magere melkeiwitten in vlokken tot de virussen maken. Wanneer de vlokken sediment, het is gemakkelijk om ze te verzamelen, waardoor het mogelijk om te concentreren 10 L water, terwijl traditionele ultracentrifugatie kan niet omgaan met grote water volumes.
De methode is gewijzigd om op het punt van bemonstering te worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van elektrische apparatuur, met uitzondering van een op batterijen bediende magnetische roerder. Sommige andere benaderingen op basis van waterfiltratie zijn aangepast aan de concentratie van virussen en kunnen ook op het punt van gebruik worden uitgevoerd. Echter, geschorst materiaal aanwezig in watermonsters vaak verstopt de filters; het kleine volume dat met deze systemen kan worden geconcentreerd, is dus een ernstige beperking.
Dit is de eerste beschrijving van een methode om virussen te concentreren op watermonsters op het punt van gebruik, ongeacht de troebelheid van het monster. De VirWaTest-concentratie methode maakt het mogelijk verschillende monsters tegelijkertijd te verwerken als het geschikte materiaal beschikbaar is. Bovendien is gebleken dat de flocculatie van magere melk nuttig is voor bacteriën en parasietconcentraties19.
De voorbereiding van het juiste materiaal is van cruciaal belang voor het correct uitvoeren van de procedure. Houd rekening met het aantal te analyseren watermonsters en bereid de reagentia en het materiaal voor alvorens naar de plaats te gaan waar de test nodig is voor de bereiding van de reagentia en het materiaal. Verschillende monsters kunnen tegelijkertijd worden verwerkt als de juiste hoeveelheid materiaal beschikbaar is.
Voordat de concentratie van een watermonster wordt gestart, wordt een bekende concentratie van een virale voorraad gebruikt om het monster als procescontrole te prikken. Deze methode maakt gebruik van een gedroogde virale kolf die wordt gerehydrateerd met gedistilleerd water voordat het wordt toegevoegd aan het watermonster op het punt van gebruik. Dit is handig om vals-negatieve resultaten aan het einde van de procedure uit te buiten en geeft een indicatie van de prestaties van de methode.
Virale concentraten verkregen met de VirWaTest kunnen verder worden getest in het veld waarin de VirWaTest nucleïnezuurextractie-en detectiemethoden worden toegepast of, als alternatief, kunnen concentraten worden verzonden naar een referentielaboratorium bij kamertemperatuur. De conserverings oplossing die aan het concentraat wordt toegevoegd, zorgt ervoor dat virussen gedurende maximaal 2 weken stabiel blijven (niet-gepubliceerde resultaten).
VirWaTest nucleïnezuur extractie is een magnetische deeltjes gebaseerde methode. Het is gemakkelijk en snel en maakt het mogelijk om verschillende monsters tegelijkertijd te verwerken en vertoont een gelijkwaardige en zelfs betere herstel efficiëntie dan methoden die momenteel worden gebruikt voor het gebruik van virale nucleïnezuur extracties. De nucleïnezuren kunnen bij kamertemperatuur naar referentielaboratoria worden gestuurd of, als gebruikers vertrouwen hebben in het uitvoeren van moleculaire detectie, kan een kwantitatieve PCR-test worden uitgevoerd op het punt van gebruik van het oorspronkelijke watermonster.
Als er een kleine laboratorium faciliteit beschikbaar is, kan het VirWaTest-concentratie protocol worden gekoppeld aan standaard nucleïnezuurextractie kits die afhankelijk zijn van een centrifuge en standaard PCR-gebaseerde methoden die een vriezer vereisen om de reagentia te onderhouden, maar die gebruikmaken standaard thermocyclers, die minder duur zijn dan batterij-aangedreven.
Echter, omdat een stroomvoorziening soms niet beschikbaar is, hebben we geoptimaliseerde detectie testen voor ms2 bacteriofagen als procesbeheersing en hadv als een virale fecale indicator, en de methodologie kan worden aangepast voor elk ander virus van belang, zoals hepatitis virussen, RoV, NoV, of anderen, om te worden uitgevoerd in het veld zonder een vriezer voor het onderhoud van de reagentia, noch conventionele thermocyclers, maar alleen een batterij bediend. Verschillende thermocyclers met batterij bediening zijn commercieel verkrijgbaar. Als er ook een stroomvoorziening beschikbaar is, kunnen andere conventionele qPCR-apparatuur worden gebruikt. Als er een Thermocycler van acht buizen wordt gebruikt, kunnen maximaal twee extracties van nucleïnezuur (twee verschillende monsters of twee replicaten uit hetzelfde monster) in dezelfde PCR-test worden getest. Voor elke extractie van nucleïnezuur zullen twee verschillende hoeveelheden worden getest om enzymatische remming uit te voeren die afkomstig is van het monster. De aanpassing is gebaseerd op de eerdere bereiding van PCR-buizen door luchtdrogende primers, sondes en standaard suspensies. Er bestaan verschillende gelyofiliseerde commerciële qPCR-oplossingen die kunnen worden gebruikt door dezelfde procedure toe te passen als hier beschreven. We hebben een mogelijkheid beschreven die we als eenvoudig uit te voeren beschouwen.
Vergelijkings tests die zijn uitgevoerd tijdens de ontwikkeling van de methode toonden aan dat de VirWaTest-methoden voor concentratie, extractie en detectie efficiënt zijn voor het kwantificeren van virussen in watermonsters.
De aantoonbaarheidsgrens (LOD) van de beschreven procedure is variabel, aangezien het volume dat na de concentratie wordt verzameld, variabel is. Ook kan de LOD iets anders zijn voor verschillende virussen. Als een volume van ongeveer 10 L wordt opgevangen, zou de LOD voor HAdV ongeveer 1 x 102 virale GC/L zijn. Dus, relatief kleine concentraties van HAdV kan worden gedetecteerd door de VirWaTest methode. In Pedernales (Ecuador), zes van de zes monsters getest gepresenteerd HAdV, in concentraties dicht bij de LOD, variërend van 3,27 x 101 tot 1,80 x 102 GC/L. In Banghi (RCA) werden HAdV gedetecteerd in één van de vijf geanalyseerde monsters, met een concentratie van 3,46 x 102 GC/L. De aanwezigheid van HAdV, evenals de aanwezigheid van MS2 als het controleproces in de geteste monsters, toont de methode is nuttig voor het herstel van virale deeltjes uit watermonsters, zelfs wanneer uitgevoerd door niet-ervaren gebruikers.
Feedback verkregen tot nu geeft aan dat virale concentratie een eenvoudige procedure is om uit te voeren, zonder grote problemen wanneer toegepast op het punt van gebruik van de monsters, hoewel 8 h en 5 h stappen zijn vereist. Het is belangrijk op te merken dat deze stappen optreden zonder menselijke hulp. Bovendien wordt een snellere methode op basis van filtratie ontwikkeld als alternatief voor nonturbide wateren. Echter, flocculatie lijkt te zijn, tot nu toe, de unieke methode die de concentratie van monsters die hoge troebelheid presenteert. Virale concentraten kunnen vervolgens worden verzonden naar een laboratorium over de hele wereld bij kamertemperatuur, wat het ook gemakkelijker maakt om virussen te testen, omdat bemonsterings gebieden niet altijd goede vervoersdiensten bieden die koel condities verzorgen. Als alternatief kunnen de hier gepresenteerde extractie-en detectie protocollen testen op virale detectie op het punt van gebruik van de monsters.
Voor zover we weten, dit is de eerste methode die wordt gemeld nuttig zijn voor de concentratie en testen op de aanwezigheid van virussen in watermonsters in het veld. Er moeten verdere inspanningen worden geleverd om de procedure toe te passen op de evaluatie van de aanwezigheid van humaan virale pathogenen die in verschillende andere humanitaire crisis scenario's van belang zijn. Ook zal de feedback van de gebruiker nodig zijn om inzicht te geven in de mogelijke implementatie om de procedure vriendelijker te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
VirWaTest was een onderzoeksproject gefinancierd door het HIF (humanitair innovatiefonds) programma van ELHRA (het verbeteren van leren & onderzoek voor humanitaire hulp). De auteurs erkennen de WASTEAMS die vriendelijk in deze studie hebben samengewerkt. De analyse van samples in Ecuador werd gefinancierd door Oxfam Ecuador en Dirección de Recheran de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas is een Serra-Hunter Fellow aan de Universiteit van Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
