Summary
Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.
Abstract
Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.
Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.
O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.
Introduction
Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB1,2,3,4. No entanto, tem sido extensivamente documentado que não há correlação entre a ausência de FIB e a presença de patógenos transmitidos por água viral, como rotavírus (RoV), norovírus (NoV) ou HEV5,6. Assim, o uso dos critérios de qualidade da água baseados em FIB pode resultar em uma subestimação dos riscos associados à presença de patógenos virais transmitidas por águas. A vigilância de vírus indicativos, tais como adenovírus humanos (hadv), ou patógenos específicos seria útil na definição da exposição a patógenos virais e identificando a fonte potencial de infecção humana7,8, 9,10 e na validação da eficácia das medidas sanitárias11.
Até agora, a detecção de vírus nesses cenários dependia de pessoal qualificado e logística complexa. VirWaTest (virwatest.org) destina-se ao desenvolvimento de um método simples, acessível e portátil para a concentração e subsequente detecção de vírus de amostras de água no ponto de uso.
A concentração de vírus é baseada no princípio da floculação orgânica de amostras de água de 10 L, pelas quais os vírus são recuperados em volumes menores12,13. Os flocos são recolhidos e adicionados a um tampão que lise os vírus e impede que os ácidos nucleicos da degradação quando armazenados na temperatura ambiente por não mais de 2 semanas.
O método da extração do ácido nucleico é baseado no uso de partículas magnéticas a que os ácidos nucleicos começ adsorbed. Eles podem ser transferidos de um tampão de lavagem para outro e, finalmente, para o tampão de eluição usando uma pipeta magnética à qual as partículas se unem. As suspensões de ácidos nucleicos virais obtidas podem ser enviadas para um laboratório de referência, onde a detecção pode ser realizada usando métodos moleculares baseados em PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes são testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. Alternativamente, com a disponibilidade mínima do equipamento, os testes de PCR podem ser executados no ponto de uso. Todo o processo é projetado para ser realizado independentemente de uma fonte de alimentação (Figura 1).
Um ensaio quantitativo de PCR para detectar HAdV, excretado por humanos e encontrado em amostras de águas residuais em altas concentrações, foi adaptado para ser executado no ponto de uso. HAdV são usados como indicadores virais fecais humanos. Um PCR para a quantificação do bacteriófago de MS2 foi adaptado igualmente desde que MS2 é usado em VirWaTest como o controle do processo. O método pode ser personalizado para a detecção de qualquer vírus de interesse.
Após o desenvolvimento, o método VirWaTest tem sido aplicado pelos usuários em duas configurações diferentes na República da África Central (RCA) e no Equador, fornecendo feedback sobre a aplicação do protocolo em situações reais.
A nosso conhecimento, este é o primeiro procedimento que permite a concentração e a deteção dos vírus no ponto de uso, independente de toda a fonte de alimentação, equipamento grande, e condições de congelação/refrigerando. Recomenda-se a coleta de duas repetições de cada amostra de água, a fim de obter resultados robustos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação e embalagem
Nota: os materiais/equipamentos a serem embalados estão listados na tabela 1. Use luvas para manusear os reagentes necessários para o controle do processo, os reagentes de concentração, os reagentes de extração de ácido nucleico e os reagentes de detecção. Use óculos protetores para manusear os reagentes necessários para a extração de ácido nucleico.
- Controle de processo
- Prepare a cultura de ações do bacteriófago de MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contendo 1 x 1010 pfu/ml em laboratório seguindo o procedimento ISO 10705-1:199514.
- Em seguida, alíquota 10 μL da suspensão por tubo contendo 1 x 108 Pfu em tubos de 10 ml e deixe a água evalhar a 37 ° c. Use um tubo por amostra de água.
- Além disso, prepare um tubo contendo 10 mL de água destilada estéril por amostra coletada.
- Reagentes de concentração
- Para a solução de leite desnatado pré-floculada (PSM), use as seguintes quantidades para concentrar amostras de água de 5 10 L.
- Prepare um tubo de plástico contendo 5 g de leite desnatado.
- Prepare um saco de plástico com zíper contendo 16,66 g de sais marinhos.
- Prepare uma garrafa plástica contendo 500 mL de água destilada.
- Prepare os reagentes necessários para o ajuste do pH. Use as seguintes quantidades para ajustar o pH do PSM e de amostras de água de 5 10 L.
- Adicionar 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a um tubo de plástico de 10 mL.
PRECAUÇÃO: o ácido cítrico provoca irritação grave quando entra em contacto com os olhos. Se isto ocorrer, lave o olho cautelosamente com água durante vários minutos. Se a irritação persistir, procure aconselhamento médico. - Colocar 2 g de hidróxido de sódio num tubo plástico de 10 mL.
PRECAUÇÃO: o hidróxido de sódio pode provocar queimaduras cutâneas graves e danos oculares. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com os olhos, enxaguar com cautela com água por vários minutos. Em seguida, procure aconselhamento médico. - Coloque 25 mL de água destilada estéril em um recipiente de plástico.
- Colocar 50 mL de água destilada estéril num recipiente de plástico.
- Adicionar 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a um tubo de plástico de 10 mL.
- Prepare a saqueta de condicionamento da amostra utilizada para a floculação, a solução conservante utilizada para preservar os ácidos nucleicos e a saqueta neutralizadora para neutralizar a água e os materiais descartados. Use as seguintes quantidades para cada amostra de água de 10 L a ser testada.
- Coloque 15 g de sais marinhos e 8 g de ácido cítrico 1-hidrata em um saco de plástico com zíper para a saqueta de condicionamento.
- Adicionar 2 mL de tampão de lise (tabela de materiais) e 0,3 ml de agente de preservação de ácidos nucleicos (tabela de materiais) a um tubo de 5 ml.
PRECAUÇÃO: o tampão de Lise contém tiocianato de guanidina e Triton X-100. Contato com ácido liberta gás tóxico, e é prejudicial se ingerido, inalado, ou entra em contato com a pele. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com a pele, lave com muita água. Em seguida, procure aconselhamento médico. O agente de preservação do ácido nucleico causa a irritação da pele e do olho e é prejudicial se engolido. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante por vários minutos. Em qualquer caso, especialmente se ingerido e sentindo-se mal, procurar aconselhamento médico. - Põr 40 g do pó detergente em quatro sacos plásticos do zipper.
PRECAUÇÃO: o detergente em pó provoca irritação ocular. Se vier em contacto com os olhos, enxague com água abundante durante vários minutos. Se a irritação persistir ou se engolida, procure aconselhamento médico.
- Para a solução de leite desnatado pré-floculada (PSM), use as seguintes quantidades para concentrar amostras de água de 5 10 L.
- Reagentes de extração de ácido nucleico
- Coloque 50 μL de partículas magnéticas (tabela de materiais) e 1 ml de etanol 96% em um tubo de 5 ml que constituem o tampão de ligação.
PRECAUÇÃO: o tampão de partículas magnéticas contém azida sódica, que forma um gás tóxico quando entra em contacto com ácidos ou íons metálicos pesados e é tóxico se ingerido ou quando entra em contacto com a pele. Se ingerido ou em contacto com a pele, enxague a boca ou a pele com água abundante e procure aconselhamento médico. O etanol é um líquido altamente inflamável e vapor e provoca irritação ocular grave. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faíscas, e qualquer outra fonte de ignição. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Em caso de ingestão de grandes quantidades de água e/ou se inalado, ir para fora para o ar fresco. Em qualquer caso, procure aconselhamento médico. - Adicionar 500 μl, 600 μL, e 200 μL de tampões de lavagem 1, 2, e 3, respectivamente (tabela de materiais), a três tubos de 2 ml.
Cuidado: os tampões de lavagem contêm o tiocianato do guanidina e o cloreto do guanidina, que são prejudiciais se inalados ou engolidos e irrigar a pele e os olhos. Contato com ácidos libera gás muito tóxico. Se eles entram em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Se ingerido, lave a boca com água abundante. Não induzir o vômito. Procure sempre aconselhamento médico. - Adicionar 120 μL de tampão de eluição (tabela de materiais) a um tubo de 0,5 ml.
- Coloque 50 μL de partículas magnéticas (tabela de materiais) e 1 ml de etanol 96% em um tubo de 5 ml que constituem o tampão de ligação.
- Reagentes de detecção de HAdV e MS2
Nota: duas reações diferentes da extração do ácido nucleico podem ser analisadas simultaneamente em cada ensaio do PCR se um termociclador 8-well é usado. Para todos os ensaios de PCR, prepare a água da biologia molecular alicitado em 1,5 tubos de mL.-
Detecção de HAdV
- Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente do AdF de 22,5 μM, 10 μL de primer reverso de 22,5 μM AdR e 5 μL de sonda AdP de 11,25 μM (tabela 2).
- Adicionar 2,5 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.
- Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.
- Prepare uma diluição em série de suspensões de DNA contendo a sequência de nucleotídeo da região HAdV amplificada. Ar-seco 1 μL de suspensões contendo 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/ml em tubos 6-8.
Nota: Mantenha os tubos contendo os primers, a sonda e as suspensões secas ao ar protegidas da luz.
-
Detecção de MS2
- Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente Pecson-2F de 25 μM, 10 μL de primer reverso Pecson-2R de 25 μM e 2,5 μL de sonda PecP-2 de 25 μM (tabela 2).
- Adicionar 2,25 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.
- Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.
- Prossiga como na etapa 1.4.1.4 mas use uma suspensão padrão projetada para o MS2 preferivelmente.
-
Detecção de HAdV
2. concentração viral
Nota: use luvas em todos os momentos durante a coleta de amostras, preparação de reagentes, floculação, coleta de flocos e procedimentos de descarte de resíduos. Use óculos de proteção durante o procedimento de preparação do reagente.
- Coleta de amostra
- Colete uma amostra de água de 10 L em um balde de fundo plano com uma tampa. Colete um mínimo de duas repetições para cada amostra.
Nota: é importante usar baldes claros para visualizar o pellet. Se a amostra de água contiver material suspenso (por exemplo, areia, algas), deixe-o sedimento e, em seguida, colete o sobrenadante de água em um novo balde. - Registre o volume coletado, bem como a data de localização e coleta, para cada amostra de água.
- Põr um agitador magnético conectado a uma bateria um apoio da cubeta e coloc a cubeta que contem a amostra da água em seu apoio.
Observação: Procure uma superfície plana em um local fresco e mantenha os baldes contendo as amostras de água da luz solar direta.
- Colete uma amostra de água de 10 L em um balde de fundo plano com uma tampa. Colete um mínimo de duas repetições para cada amostra.
- Preparação de reagentes
-
reagentes de ajuste de pH
- Despeje o pó de ácido cítrico e as pelotas de hidróxido de sódio nos vasos contendo 25 e 50 mL de água destilada, respectivamente.
- Agitar suavemente à mão até que o ácido cítrico e o hidróxido de sódio sejam completamente dissolvidos.
Atenção: não deite a água sobre as pastilhas de hidróxido de sódio. Em vez disso, Despeje as pelotas de hidróxido de sódio sobre a água.
-
Leite desnatado preflocculated
- Coloque um saco de stand-up em um agitador magnético e despeje 500 mL de água destilada nele. Deixe cair um ímã de agitação dentro do saco e gire sobre o agitador magnético.
- Despeje o conteúdo de um saquinho de sal marinho e de um tubo de leite desnatado no saco de stand-up e mexa por 5 min em velocidade média para dissolvê-los.
- Adicione 3 mL de ácido cítrico à solução de PSM usando uma pipeta de Pasteur para certificar-se que o pH está entre 3,4 e 3,6. Meça o pH da solução PSM usando tiras indicadoras de pH. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.
- Desligue o agitador magnético e certifique-se de que os flocos estão visíveis. Use uma lanterna para ajudar a visualizar os flocs.
-
reagentes de ajuste de pH
- Floculação
- Deixe cair um ímã de agitação na água, ajuste o agitador magnético na velocidade máxima, e gire-o sobre. Certifique-se de que o íman de agitação começa a girar.
- Adicione 10 mL de água destilada a um tubo de controle de processo. Inverta o tubo algumas vezes para Rehidratar o estoque viral e despeje a solução na água.
- Despeje o conteúdo de um saquinho de condicionamento da amostra na água e mexa por 5 min.
- Meça o pH da amostra de água usando tiras indicadoras de pH. Adicione algumas gotas de ácido cítrico ou hidróxido de sódio para a amostra de água para se certificar de que o pH está entre 3,4 e 3,6. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.
- Adicione 100 mL da solução PSM usando um recipiente de 100 mL.
- Sele a cubeta com a tampa, ajuste o agitador magnético na velocidade mínima, e deixe a agitação da água por 8 h.
- Desligue o agitador magnético e deixe a água ainda por pelo menos 5 h para permitir que os flocos se instalem.
- FLOC coleção
- Construa um sistema desviando compor de um controlador da pipeta, de duas pipetas, e de um tubo plástico, para aspirar o sobrenadante da água para descarregar a água nos flocs.
- Fixe uma pipeta de 10 mL de fita no controlador da pipeta. Em seguida, prenda a ponta da pipeta ao tubo de plástico.
- Retire o filtro de uma pipeta de ponta aberta de 10 mL com uma pinça e prenda a pipeta ao tubo de plástico.
- Coloque um balde vazio no chão.
- Mergulhe a ponta da pipeta de ponta aberta na água. Certifique-se de mantê-lo perto da superfície da água para evitar perturbar os flocs. Aspirar o sobrenadante de água até atingir a pipeta de fita-final.
- Aperte o tubo de plástico na extremidade fixada à pipeta de fita e retire-a da pipeta.
- Coloque o tubo em um balde vazio. Libere a pressão no tubo para deixar o fluxo de água no balde vazio.
- Aperte o tubo de plástico para parar o fluxo de água quando o nível da água está prestes a chegar ao ímã de agitação e mova a pipeta para longe da caçamba.
- Agitar o balde para ressuscita os flocos e despeje-os em um saco plástico stand-up de 500 mL. Permita que os flocos se instalem por mais 1 h.
- Aspirar com cuidado o sobrenadante da água usando uma pipeta de 50 mL e um controlador manual da pipeta, evitando perturbar os flocs.
- Aspirar os flocos usando uma pipeta de 100 mL e transferi-los para um tubo de centrifugação graduado de 50 mL. Anote o volume final do concentrado de amostra e transfira 1 mL do mesmo para um tubo de 5 mL contendo a solução conservante, utilizando uma pipeta Pasteur.
Nota: é importante que o tubo de centrifugação seja graduado para que o volume final da amostra concentrada possa ser medido da forma mais precisa possível e registado. - Realize a extração de ácido nucleico no campo. Alternativamente, armazene a solução conservante contendo os vírus a 20-30 ° c por até 15 dias ou envie-os para um laboratório de referência para posterior análise.
- Construa um sistema desviando compor de um controlador da pipeta, de duas pipetas, e de um tubo plástico, para aspirar o sobrenadante da água para descarregar a água nos flocs.
- Descarte de resíduos e reutilização de materiais
- Adicione o conteúdo de um saquinho de agente neutralizador ao balde que contém a água descartada. Misture a água, e então, deixá-lo ainda por 30 min.
- Elimine a água tratada como resíduo geral.
- Coloque as pipetas e o tubo de plástico no interior da caçamba. Encha o balde com água e despeje o conteúdo de uma saqueta agente neutralizante.
- Lave-os por pelo menos 30 minutos para esterilizá-los e enxágüe-os com água limpa abundante para remover qualquer agente neutralizador remanescente.
3. extração de ácido nucleico
Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de extração de ácido nucleico.
-
Operação de pipeta magnética
- Familiarize-se com a operação da pipeta magnética antes de realizar a extração.
-
Extração de ácido nucleico
- Organize os tubos contendo os reagentes necessários para a extração em um rack, da esquerda para a direita: tampão de ligação, buffers de lavagem e tampão de eluição. Defina o número apropriado de tubos de acordo com o número de amostras ou repetições que estão sendo analisadas.
- Transfira 1 mL de concentrado de amostra para o tubo que contém o tampão de ligação, utilizando uma pipeta Pasteur descartável. Inverta o tubo 8x a 10x para homogeneizar a solução.
- Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min enquanto mistura continuamente, seja usando um orbital movido a energia solar ou manualmente.
- Colete as partículas magnéticas usando a pipeta magnética e uma ponta limpa, que possa ser reutilizada para os três amortecedores de lavagem.
- Liberte as partículas magnéticas no tubo contendo 500 μL de tampão de lavagem 1. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
- Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 600 μL de tampão de lavagem 2. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
- Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 200 μL de tampão de lavagem 3. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
- Solte as partículas magnéticas no tubo que contém o tampão de eluição e descarte a ponta.
- Incubar a solução à temperatura ambiente durante 5 min enquanto mistura continuamente, utilizando o orbital movido a energia solar.
Nota: a mistura das partículas magnéticas no tampão de eluição é uma etapa crucial. Em caso de falta de um orbital, misture continuamente à mão durante o tempo de incubação. - Substitua a ponta na pipeta magnética por uma nova e colete as partículas magnéticas do tampão de eluição. Certifique-se de remover completamente as partículas magnéticas do tampão de eluição, uma vez que podem interferir com os métodos de detecção molecular.
- Descarte a ponta com as partículas anexadas a ela. Prossiga com a análise de PCR, envie o tampão de eluição para um laboratório de referência ou armazene o tampão de eluição em 4 ° c para análise posterior.
4. detecção viral com uma bateria-operado oito-tubo em tempo real termociclador
Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de detecção de ácidos nucleicos. Substitua as luvas para os novos ao realizar um novo experimento de PCR para evitar a contaminação cruzada.
-
PCR quantitativo de HAdV
- Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.
- Adicionar 4 μL de mistura de PCR aos tubos 1-5.
- Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.
- Adicionar 2 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 2 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.
- Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 6, 7 e 8.
- Adicione 4 μL desta mistura aos tubos 6, 7 e 8 e feche-os.
- Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).
- Descarte o tubo de água e mantenha o ácido nucleico extraído no congelador, se possível, ou, se não, em um lugar fresco protegido da luz caso que um segundo teste precisa de ser executado.
- Limpe as micropipetas, a cremalheira, o material de trabalho, e todo o material corretamente com um líquido de limpeza ácido nucleico, e descarte o saco de plástico que contem a ponta, as luvas, e os tubos usados.
Cuidado: o removedor de ácido nucleico é um líquido e um vapor muito inflamáveis. Não respire na névoa de pulverização e evite qualquer contato do líquido com os olhos ou a pele. Caso contrário, enxaguar imediatamente com água abundante e procurar aconselhamento médico. - Colete os resultados e analise os dados obtidos.
-
MS2 PCR quantitativo
- Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.
- Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa em tubos 1-5.
- Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.
- Adicionar 1 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 1 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.
- Adicione 15,5 μL de água sem nuclease aos tubos 5, 6, 7 e 8 e feche-os.
- Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa nos tubos 6, 7 e 8.
- Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).
- Proceda conforme descrito nas etapas 4.1.8 a 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Desenvolvimento de método
Este procedimento foi desenvolvido no laboratório de contaminantes de vírus de água e alimentos com a colaboração de GenIUL e Oxfam Intermón. Compreende de três etapas diferentes. A primeira, a concentração de partículas virais, é uma adaptação de um método de floculação de leite desnatado previamente descrito12,17,18. O método original foi modificado para ser independente de uma fonte de alimentação, mais simples e sem etapas de centrifugação.
A recuperação do método de concentração de VirWaTest foi testada em amostras de água subterrânea de HAdV e de MS2 bacteriófago. A recuperação viral do método de concentração e extração de VirWaTest foi estimada em 3, 1% para 18, 2% para MS2 e 17,52% para 44,22% para HAdV. Essas recuperações foram calculadas a partir dos valores obtidos pela PCR quantitativa durante o desenvolvimento do método, em comparação com as concentrações iniciais de HAdV e MS2 nas amostras de água, após espiá-las com concentrações conhecidas desses estoques virais.
A extração do ácido nucleico magnético de VirWaTest foi comparada a um mini jogo comercial do RNA (por exemplo, QIAamp viral RNA mini jogo), um método coluna-baseado da extração usado no laboratório, testando 33 amostras do rio e das águas subterrâneas cravadas com HAdV e MS2 e concentrou-se por floculação de leite desnatado. Os resultados da comparação mostraram que a recuperação do método de VirWaTest foi maior em 23/33 casos para HAdV, bem como para o MS2 (tabela 4). Um teste de Wilcoxon mostrou valores de pde 0, 5569 para hadv e 0, 2791 para o MS2. A extração do ácido nucleico de VirWaTest fornece recuperações virais significativamente mais elevadas do que o comercial.
Detecção de HAdV em amostras de água ambiental concentradas pelo método VirWaTest
Para testar o método desenvolvido para a concentração viral no campo, a equipe de água, saneamento e higiene (WASH) da Oxfam, localizada em Banghi (RCA) em março de 2017, coletou e concentrou vírus de cinco amostras de água bem.
Também, na área de Pedernales (Equador), que foi afetada por terremotos em 2016 e 2017, seis amostras de água bem foram coletadas por uma equipe da Oxfam WASH em fevereiro de 2017, e seus vírus foram concentrados pelo método de concentração de VirWaTest. Os concentrados virais de ambos os ajustes foram emitidos ao laboratório em Barcelona para a extração do ácido nucleico de VirWaTest e a quantificação viral.
No Equador, foram detectados HAdV que ocorreram naturalmente em seis das seis amostras analisadas, com valores de concentração variando de 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L, enquanto uma das cinco amostras coletadas e concentradas em banghi (RCA) testou positivo para HAdV, na concentração de 3,46 x 102 GC/L (tabela 5).
O MS2, adicionado a todas as amostras testadas como controle interno do processo, foi detectado em todas as amostras testadas, mostrando que o método foi corretamente realizado da concentração à detecção.
Figura 1 : Método Virwatest. Visão geral das etapas do método VirWaTest é composto de. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Materiais | Concentração | Extração de ácido nucleico | Detecção |
| Equipamento | Agitador magnético (2 unidades) Bateria (2 unidades) Conectores de bateria/agitador (2 unidades) Adaptadores de energia (2 unidades) Sustentação da cubeta (2 unidades) Corda (1 unidade) Agitando o ímã (3 unidades) Pinças (1 unidade) Tubulação do silicone (1 unidade) Controlador da pipeta (1 unidade) Marcador (1 unidade) |
Pipeta magnética (1 unidade) Plataforma giratória solar (1 unidade) Cremalheira multi-size do tubo (1 unidade) Temporizador (1 unidade) |
Thermocycler (1 unidade) Bateria (1 unidade) Computador Cremalheira do tubo (1 unidade) 0,5 μL-10 μL de micropipeta (1 unidade) 2 μL-20 μL de micropipeta (1 unidade) |
| Consumíveis e reagentes (para cada 2 amostras de água/repetições) | Balde (3 unidades) Tiras indicadoras de pH Fita-fim 10 mL pipeta (2 unidades) Pipeta de 10 mL de ponta aberta (2 unidades) Fita-final 50 mL pipeta (2 unidades) Fita-final 100 mL pipeta (2 unidades) Pipeta de Pasteur (4 unidades) Saco de plástico stand-up (4 unidades) Recipiente de plástico com 25 mL de água destilada (1 unidade) Recipiente de plástico com 50 mL de água destilada (1 unidade) 100 mL recipiente vazio (1 unidade) Luvas (6 pares) Controle de processo (2 tubos) Tubo com 10 mL de água destilada (2 unidades) Ácido cítrico (1 tubo) Hidróxido de sódio (1 tubo) Leite desnatado (1 tubo) Sachê de ácido cítrico (1 unidade) Água destilada (frasco de 1 500 mL) Condicionamento da amostra (2 saquetas) Solução conservante (2 tubos) Agente de neutralização (4 saquetas) |
Pontas magnéticas da pipeta (2 unidades) Pipeta Pasteur (2 unidades) Buffer de ligação (2 tubos) Tampão de lavagem 1 (2 tubos) Tampão de lavagem 2 (2 tubos) Tampão de lavagem 3 (2 tubos) Tampão de eluição (2 tubos) Luvas (6 pares) |
10 μL de micropipeta Tips (1 caixa) 20 μL de micropipeta Tips (1 caixa) DNA qPCR Mix (1 tubo) RNA qPCR Mix (1 tubo) Enzima reversa da transcriptase (1 tubo) Água molecular da biologia (1 tubo) Tira do tubo de HAdV com primers, sonda e padrão (1 unidade) MS2 tubo strip com primers, sonda e padrão (1 unidade) Removedor de ácido nucleico Luvas (6 pares) |
Tabela 1: conteúdo de VirWaTest. Equipamentos, consumíveis e reagentes que devem ser preparados para a concentração, extração e detecção de vírus em duas amostras de água/repetições.
| Vírus | Primers | GenBank adesão no. | Posição | Sequência (5 ' \u20123 ') | Comprimento | Referência | ||
| Adenovírus humano (HAdV) | Adf | J 01917.1 | 18869 \ u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890 \ u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 bacteriófago (MS2) | Pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| Pecson-2R | 659 \ u2012678 | O TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabela 2: oligonucleotides para experimentos quantitativos de PCR. Primers e sonda projetados para vincular a seqüências de ácidos nucleicos de HAdV e MS2.
| Temperatura | Tempo | Ciclos | Temperatura | Tempo | Ciclos |
| 95 ° c | 12 minutos | 1 | 55 ° c | 15 minutos | 1 |
| 95 ° c | 10 minutos | 1 | |||
| 95 ° c | 15 de s | 40 | 95 ° c | 15 de s | 40 |
| 60 ° c | 1 minuto | 60 ° c | 1 minuto |
Tabela 3: condições térmicas para experimentos quantitativos de PCR. Temperatura, tempo e ciclos utilizados para a amplificação de HAdV e MS2.
| QIAgen | O VirWaTest | QIAgen | O VirWaTest | ||
| Mediana | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Significa | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| valor-p (Wilcoxon) para HAdV: 0, 5569 | |||||
| valor-p (Wilcoxon) para MS2:0, 2791 | |||||
| Vírus testado | Amostras testadas | QIAgen | Teste de VirWa | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabela 4: desenvolvimento de extração de ácido nucleico VirWaTest. Mediana, média e valores de DP obtidos quando comparados os métodos de extração de Qiagen e VirWaTest em 33 amostras de água subterrânea para HAdV e MS2.
| País | Site | Amostra | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, vila 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, vila 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Equador | Furo A | 6 | 7,96 x 101 |
| Poço B do furo | 7 | 1,80 x 102 | |
| Poço C do furo | 8 | 8,88 x 101 | |
| Poço de água A | 9 | 6, 6 x 101 | |
| Poço água B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Poço de água C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabela 5: quantificação de HAdV utilizando o método VirWaTest. Resultados quantitativos de PCR, expressos em GC/litro, para HAdV quantificados em amostras de água coletadas e concentradas da RCA e Equador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10 litros da água, visto que o ultracentlee tradicional não pode tratar os volumes grandes da água.
O método foi modificado para ser praticável no ponto da amostragem sem usar nenhum equipamento elétrico à exceção de um agitador magnético bateria-operado. Algumas outras abordagens baseadas na filtração da água foram adaptadas à concentração de vírus e também podem ser executadas no ponto de uso. No entanto, material suspenso presente em amostras de água muitas vezes obstrui os filtros; assim, o pequeno volume que pode ser concentrado com estes sistemas é uma limitação séria.
Esta é a primeira descrição de um método de concentração de vírus de amostras de água no ponto de uso, independentemente da turbidez da amostra. O método de concentração de VirWaTest permite que diversas amostras sejam processadas simultaneamente se o material apropriado está disponível. Além disso, a floculação do leite desnatado demonstrou ser útil para a concentração de bactérias e parasitas19.
A preparação do material apropriado é crucial para executar o procedimento corretamente. Considerar o número de amostras de água a analisar e preparar os reagentes e materiais antes de passar para o local onde o teste é necessário para a preparação dos reagentes e materiais. Várias amostras podem ser processadas ao mesmo tempo, se a quantidade apropriada de material está disponível.
Antes de iniciar a concentração de uma amostra de água, uma concentração conhecida de um estoque viral será usada para espigar a amostra como controle do processo. Este método utiliza um estoque viral seco que é rehidratado com água destilada antes de ser adicionado à amostra de água no ponto de uso. Isso é útil para descartar resultados falsos negativos no final do procedimento e fornece uma indicação do desempenho do método.
Os concentrados virais obtidos com o VirWaTest podem ser mais testados no campo aplicando os métodos de extração e detecção de ácido nucleico VirWaTest ou, alternativamente, os concentrados podem ser encaminhados para um laboratório de referência à temperatura ambiente. A solução conservante adicionada ao concentrado permite que os vírus permaneçam estáveis por até 2 semanas (resultados não publicados).
A extração do ácido nucleico de VirWaTest é um método partícula-baseado magnético. É fácil e rápido e permite que diversas amostras sejam processadas ao mesmo tempo e mostra a eficiência de recuperação equivalente e mesmo melhor do que os métodos usados atualmente para extrações do ácido nucleico viral. Os ácidos nucleicos podem ser enviados para laboratórios de referência à temperatura ambiente ou, se os usuários estão confiantes na realização de detecção molecular, um ensaio quantitativo de PCR pode ser realizado no ponto de uso da amostra de água original.
Também, se uma facilidade pequena do laboratório está disponível, o protocolo da concentração de VirWaTest pode ser acoplado aos jogos padrão do ácido nucleico da extração que dependem de um centrifugador e de métodos PCR-baseados padrão que exigem um congelador de manter os reagentes mas que usam termociclones padrão, que são menos dispendiosos do que os operados a pilhas.
No entanto, uma vez que uma fonte de alimentação às vezes não está disponível, nós otimizamos os ensaios de detecção para bacteriófagos MS2 como controle de processo e HAdV como um indicador fecal viral, e a metodologia pode ser personalizada para qualquer outro vírus de interesse, como hepatite vírus, RoV, NoV, ou outros, para ser executado no campo sem a necessidade de um congelador para a manutenção dos reagentes, nem termocicsários convencionais, mas apenas uma bateria-operado um. Vários termocyclers operados por bateria estão disponíveis comercialmente. Alternativamente, se uma fonte de alimentação está disponível, o outro equipamento convencional do qPCR pode ser usado. Se um termociclador do oito-tubo é usado, até duas extrações do ácido nucleico (duas amostras diferentes ou duas repetições da mesma amostra) podem ser testadas no mesmo ensaio do PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes serão testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. A adaptação é baseada na preparação prévia de tubos de PCR por primers de secagem de ar, sondas e suspensões padrão. Existem várias soluções de qPCR comerciais liofilizadas que podem ser usadas aplicando o mesmo procedimento descrito aqui. Nós descrevemos uma possibilidade que nós consideramos ser fácil de executar.
Os ensaios de comparação realizados durante o desenvolvimento do método mostraram que os métodos de concentração, extração e detecção de VirWaTest são eficientes para a quantificação de vírus em amostras de água.
O limite de detecção (LOD) do procedimento descrito é variável, uma vez que o volume coletado após a concentração é variável. Além disso, o LOD pode ser ligeiramente diferente para diferentes vírus. Se um volume de aproximadamente 10 L é coletado, o LOD para HAdV seria em torno de 1 x 102 viral GC/L. Assim, as concentrações relativamente pequenas de HAdV podem ser detectadas pelo método de VirWaTest. Em Pedernales (Equador), seis das seis amostras testadas apresentaram HAdV, em concentrações próximas ao LOD, variando de 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L. Em Banghi (RCA), HAdV foram detectados em uma das cinco amostras analisadas, em uma concentração de 3,46 x 102 GC/L. A presença de HAdV, bem como a presença de MS2 como processo de controle nas amostras testadas, mostra que o método é útil para a recuperação de partículas virais a partir de amostras de água, mesmo quando realizadas por usuários não experientes.
O feedback obtido até agora indica que a concentração viral é um procedimento fácil de realizar, sem grandes problemas quando aplicado no ponto de uso das amostras, embora sejam necessárias etapas de 8 h e 5 h. É importante notar que essas etapas ocorrem sem qualquer assistência humana. Além disso, um método mais rápido baseado na filtração está sendo desenvolvido como uma alternativa para águas nonturbid. No entanto, a floculação parece ser, até agora, o método único que permite a concentração de amostras apresentando alta turbidez. Os concentrados virais podem então ser enviados a todo o laboratório em torno do mundo na temperatura ambiente, que igualmente facilita testar vírus desde que as áreas de amostragem não têm sempre bons serviços do transporte que fornecem condições refrigerando. Alternativamente, os protocolos da extração e da deteção apresentados aqui permitem o teste para a deteção viral no ponto do uso das amostras.
Tanto quanto sabemos, este é o primeiro método relatado para ser útil para a concentração e teste para a presença de vírus em amostras de água no campo. Devem ser realizados novos esforços para aplicar o procedimento à avaliação da presença de agentes patogénicos virais humanos de interesse em vários outros cenários de crise humanitária. Além disso, o feedback do usuário será necessário para fornecer insights sobre a implementação potencial para tornar o procedimento mais amigável.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O VirWaTest foi um projeto de pesquisa financiado pelo programa de fundos de inovação humanitária (HIF) da ELHRA (aprimorando o aprendizado & pesquisa para assistência humanitária). Os autores reconhecem as equipes de WASH que gentilmente colaboraram neste estudo. A análise de amostras no Equador foi financiada pela Oxfam Ecuador e Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas é um companheiro da Serra-caçador na Universidade de Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
