Summary
Här presenterar vi VirWaTest, som är en enkel, prisvärd och portabel metod för koncentration och detektion av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.
Abstract
Virus som utsöndras av människor och djur kan förora vattenkällor och utgöra en risk för människors hälsa när detta vatten används för att dricka, mat bevattning, tvättning, etc. Den klassiska fekal bakterie indikatorn kontrollerar inte alltid förekomsten av virala patogener, så upptäckten av virala patogener och virus indikatorer är relevant för att vidta åtgärder för att minska riskerna, särskilt i humanitära scenarier och i områden där vattenburna virusutbrott ofta förekommer.
För närvarande finns flera kommersiella tester som möjliggör kvantifiering av fekal indikatorbakterier (FIB) tillgängliga för testning vid användningstillfället. Sådana kommersiella tester är dock inte tillgängliga för detektion av virus. Upptäckten av virus i miljö vatten prover kräver att koncentrera flera liter i mindre volymer. Dessutom, när koncentrerad, upptäckten av virus förlitar sig på metoder såsom nukleinsyra utvinning och molekylär detektion (t. ex., polymeras kedjereaktion [PCR]-baserade analyser) av virala Genomes.
Den metod som beskrivs här tillåter koncentrationen av virus från 10 L vattenprover, samt utvinning av virala nukleinsyror vid tidpunkten för användning, med enkel och portabel utrustning. Detta gör det möjligt att testa vattenprover vid användnings punkten för flera virus och är användbar i humanitära scenarier, samt i alla sammanhang där ett utrustat laboratorium inte finns tillgängligt. Alternativt tillåter metoden att koncentrera virus som finns i vattenprover och frakten av koncentratet till ett laboratorium vid rumstemperatur för vidare analys.
Introduction
Under de första faserna av humanitära nödsituationer är tillgången till rent vatten, sanitet och hygien avgörande för de drabbade. Därför är övervakning av vattenkvaliteten en prioriterad fråga för att förhindra vattenburna utbrott. Det är välkänt att förorenat vatten ofta är ursprunget till sjukdomar, men det är ofta svårt att bestämma källorna till virusutbrott såsom hepatit E-virus (HEV), även med tillgången till konventionella laboratoriemetoder. Kontrollen av vattenkvaliteten baseras på kvantifieringen av FIB1,2,3,4. Det har dock dokumenterats utförligt att det inte finns något samband mellan avsaknaden av FIB och förekomsten av virala vattenburna patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV) eller HEV5,6. Att använda de kriterier för vattenkvalitet som grundar sig på FIB kan således leda till en underskattning av de risker som är förknippade med förekomst av vattenburna virala patogener. Övervakningen av indikator virus, såsom humana adenovirus (hadv), eller specifika patogener skulle vara till hjälp vid fastställandet av exponeringen för virala patogener och identifiera den potentiella källan till infektion7,8, 9,10 och validering av effektiviteten av sanitära åtgärder11.
Fram till nu förlitade sig upptäckten av virus i dessa scenarier på kompetent personal och komplex logistik. VirWaTest (virwatest.org) syftar till att utveckla en enkel, prisvärd och bärbar metod för koncentrationen och efterföljande upptäckt av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.
Virus koncentrationen bygger på principen om organisk floculation av 10 L vattenprover, genom vilka virus återvinns i mindre volymer12,13. De flockar samlas in och läggs till en buffert som lyserar virusen och förhindrar att nukleinsyror från nedbrytning när de förvaras vid rumstemperatur i högst 2 veckor.
Den nukleinsyra extraktionsmetoden är baserad på användningen av magnetiska partiklar som nukleinsyror får adsorberat. De kan överföras från en tvättbuffert till en annan och slutligen in i elutionsbufferten med hjälp av en magnetisk pipett som partiklarna fäster. Virala nukleinsyra suspensioner erhålls kan transporteras till ett referenslaboratorium där upptäckten kan utföras med hjälp av molekylära metoder baserade på PCR. För varje nukleinsyrafutering testas två olika kvantiteter för att utesluta enzymatisk hämning som har sitt ursprung i provet. Alternativt kan PCR-test köras vid användnings punkten med minimal utrustnings tillgänglighet. Hela processen är konstruerad för att utföras oberoende av en strömförsörjning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analys för att påvisa HAdV, som utsöndras av människor och återfinns i vattenprover i höga koncentrationer, har anpassats för att köras vid användnings punkten. HAdV används som humana fekala virala indikatorer. En PCR för quantificationen av MS2 Bakteriofag har också anpassats, sedan MS2 används i virwatest som processaa kontroll. Metoden kan anpassas för detektion av alla virus av intresse.
Efter utvecklingen har den VirWaTest metoden tillämpats av användarna i två olika inställningar i Republiken Centralafrika (RCA) och Ecuador, ge återkoppling om tillämpningen av protokollet i verkliga situationer.
Till vår kännedom, detta är det första förfarandet som gör att koncentrationen och detektion av virus vid tidpunkten för användning, oberoende av någon strömförsörjning, stor utrustning, och frysning/kyla förhållanden. Det rekommenderas att samla in två replikat av varje vattenprov för att få robusta resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning och förpackning
Anm.: de material/den utrustning som ska packas anges i tabell 1. Använd handskar för att hantera de reagenser som krävs för processtyrningen, koncentrationsreagenser, reagens för nukleinsyreextraktion och detekterings reagenser. Använd skyddsglasögon för att hantera de reagens som krävs för nukleinsyrgasextraktion.
- Processtyrning
- Förbered MS2 bakteriofage Stock kultur (American typ kultursamling [ATCC] 15597-B1) som innehåller 1 x 1010 PFU/ml i laboratoriet genom att följa ISO-förfarandet 10705-1:199514.
- Därefter, alikvot 10 μL av suspensionen per tub som innehåller 1 x 108 PFU i 10 ml rör och låt vatten avdunstningen vid 37 ° c. Använd ett rör per vattenprov.
- Bered dessutom ett rör som innehåller 10 mL sterilt destillerat vatten per samlat prov.
- Koncentrationsreagens
- För den preflocokulerade skum mjölks lösningen (PSM), Använd följande mängder för att koncentrera 5 10 L vattenprover.
- Bered ett plaströr som innehåller 5 g skummjölk.
- Förbered en Zipper plastpåse som innehåller 16,66 g havssalter.
- Bered en plastflaska som innehåller 500 mL destillerat vatten.
- Förbered de reagenser som krävs för pH-justering. Använd följande belopp för att justera pH-värdet för PSM och 5 10 L vattenprover.
- Tillsätt 5 g citronsyra 1-hydrat till ett 10 mL plaströr.
FÖRSIKTIGHET: citronsyra orsakar allvarlig irritation när den kommer i kontakt med ögonen. Om detta inträffar, skölj ögat med försiktighet med vatten i flera minuter. Om irritation kvarstår, kontakta läkare. - Sätt 2 g natriumhydroxid i ett 10 mL plaströr.
FÖRSIKTIGHET: natriumhydroxid kan orsaka allvarliga brännskador på hud och ögonskador. Vid förtäring, skölj munnen. Framkalla inte kräkning. Om den kommer i kontakt med ögonen, skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Sedan, kontakta läkare. - Sätt 25 mL sterilt destillerat vatten i en plastbehållare.
- Sätt 50 mL sterilt destillerat vatten i en plastbehållare.
- Tillsätt 5 g citronsyra 1-hydrat till ett 10 mL plaströr.
- Förbered provet konditioneringen påse som används för flocympning, konserveringsmedel lösning som används för att bevara nukleinsyror, och den neutraliserande påsen för att neutralisera det kasserade vattnet och material. Använd följande mängder för varje 10 L vattenprov som ska testas.
- Sätt 15 g havssalt och 8 g citronsyra 1-hydrat i en blixtlås plastpåse för konditioneringspåsen.
- Tillsätt 2 mL lyseringsbuffert (tabell över material) och 0,3 ml av nukleinsyrets konserveringsmedel (tabell över material) till en 5 ml tub.
Varning: Lyseringsbufferten innehåller guanidin tiocyanat och Triton X-100. Kontakt med syra frigör giftig gas, och det är skadligt vid förtäring, inandning, eller kommer i kontakt med huden. Vid förtäring, skölj munnen. Framkalla inte kräkning. Om det kommer i kontakt med huden, tvätta med mycket vatten. Sedan, kontakta läkare. Nukleinsyrliga konserveringsmedel orsakar hud-och ögonirritation och är skadligt vid förtäring. Om det kommer i kontakt med huden eller ögonen, skölj med rikligt med vatten i flera minuter. I alla fall, särskilt om förtäring och sjukdomskänsla, uppsök läkare. - Sätt 40 g tvättmedel pulver i fyra blixtlås plastpåsar.
Varning: pulver rengöringsmedel orsakar ögonirritation. Om det kommer i kontakt med ögonen, skölj med rikligt med vatten i flera minuter. Kontakta läkare om irritation kvarstår eller förtäring.
- För den preflocokulerade skum mjölks lösningen (PSM), Använd följande mängder för att koncentrera 5 10 L vattenprover.
- Reagenser för nukleinsyrgasextraktion
- Sätt 50 μL magnetiska partiklar (tabell över material) och 1 ml etanol 96% i ett 5 ml-rör som utgör Bindningsbufferten.
Varning: den magnetiska partiklar bufferten innehåller natriumazid, som bildar en giftig gas när den kommer i kontakt med syror eller tungmetaller joner och är giftigt vid förtäring eller när det kommer i kontakt med huden. Vid förtäring eller hudkontakt, skölj munnen eller huden med rikligt med vatten och uppsök läkare. Etanol är en mycket brandfarlig vätska och ånga och orsakar allvarlig ögonirritation. Förvaras åtskilt från värme, heta ytor, gnistor och annan antändningskälla. Om det kommer i kontakt med huden eller ögonen, skölj med rikligt med vatten. I händelse av intag av stora mängder vatten och/eller vid inandning, gå ut i den friska luften. I vilket fall som helst, kontakta läkare. - Tillsätt 500 μl, 600 μL och 200 μL av tvättbuffertarna 1, 2 respektive 3 (tabell över material) till tre 2 ml-rör.
FÖRSIKTIGHET: Tvättbuffertar innehåller guanidinium tiocyanat och guanidiniumklorid, som är skadliga vid inandning eller förtäring och irritera huden och ögonen. Kontakt med syror frigör mycket giftig gas. Om de kommer i kontakt med hud eller ögon, skölj med rikligt med vatten. Vid förtäring, skölj munnen med rikligt med vatten. Framkalla inte kräkning. Kontakta alltid läkare. - Tillsätt 120 μL elueringbuffert (tabell över material) till en 0,5 ml tub.
- Sätt 50 μL magnetiska partiklar (tabell över material) och 1 ml etanol 96% i ett 5 ml-rör som utgör Bindningsbufferten.
- Reagenser för HAdV-och MS2-detektion
Anmärkning: två olika nukleinsyrgasutsug reaktioner kan analyseras samtidigt i varje PCR-test om en 8-brunn termocyklern används. För alla PCR-analyser, Förbered molekylärbiologi vatten aliciterat i 1,5 mL rör.-
HAdV-detektering
- Bered en blandning som innehåller 10 μL 22,5 μM AdF framåt primer, 10 μL 22,5 μM AdR omvänd primer och 5 μL 11,25 μM AdP-sond (tabell 2).
- Tillsätt 2,5 μL av blandningen till rören 1 till 8 i en rörremsa. Låt den torka i rumstemperatur, Stäng rören och håll dem skyddade mot ljuset.
- Skär remsan dela den i två remsor: rör 1-5 och rör 6-8.
- Bered en seriell utspädning av DNA-suspensioner som innehåller nukleotidsekvensen i den förstärkta HAdV-regionen. Lufttorka 1 μL suspensioner innehållande 1 x 105, 1 x 107och 1 x 109 GC/ml i rören 6-8.
Anmärkning: förvara rören som innehåller primers, sond och lufttorkad suspension skyddas från ljus.
-
MS2 Detection
- Bered en blandning innehållande 10 μL av 25 μM (pecson-2F) framåtriktad primer, 10 μL 25 μM pecson-2R omvänd primer och 2,5 μL 25 μM PecP-2-sond (tabell 2).
- Tillsätt 2,25 μL av blandningen till rören 1 till 8 i en rörremsa. Låt den torka i rumstemperatur, Stäng rören och håll dem skyddade mot ljuset.
- Skär remsan dela den i två remsor: rör 1-5 och rör 6-8.
- Fortsätt som i steg 1.4.1.4 men Använd en standard suspension avsedd för MS2 istället.
-
HAdV-detektering
2. viral koncentration
Obs: Använd handskar hela tiden under prov insamlingen, REAGENSBEREDNING, flocympning, flockar-uppsamling och avfallshantering. Använd skyddsglasögon under reagensprepareringsproceduren.
- Provsamling
- Samla ett 10 L vattenprov i en platt botten skopa med lock. Samla in minst två replikat för varje prov.
Obs: det är viktigt att använda tydliga skopor för att visualisera pelleten. Om vattenprovet innehåller suspenderat material (t. ex. sand, alger), låt det sediment och, sedan, samla vatten supernatanten i en ny hink. - Registrera den insamlade volymen samt plats-och insamlingsdatum för varje vattenprov.
- Sätt en magnetomrörare ansluten till ett batteri under en skopa stöd och placera skopan som innehåller vattenprovet på dess stöd.
Observera: leta efter en plan yta på en ny plats och förvara Skoporna som innehåller vattenproverna från direkt solljus.
- Samla ett 10 L vattenprov i en platt botten skopa med lock. Samla in minst två replikat för varje prov.
- Beredning av reagenser
-
pH-justering reagenser
- Häll citronsyra pulvret och natriumhydroxidpellets i krukor som innehåller 25 och 50 mL destillerat vatten, respektive.
- Skaka försiktigt för hand tills citronsyran och natriumhydroxid är helt upplöst.
Varning: Häll inte vattnet över natriumhydroxidpellets. Häll i stället natriumhydroxidpellets över vattnet.
-
Preflocokulerade skummjölk
- Placera en stand-up påse på en magnetisk omrörare och häll 500 mL destillerat vatten i den. Släpp en omrörnings magnet inuti påsen och slå på magnetomröraren.
- Häll innehållet i en havssalt påse och en skummjölk röret i stand-up påse och rör om i 5 min vid medelhög hastighet för att lösa upp dem.
- Tillsätt 3 mL citronsyra till PSM-lösningen med en Pasteur-pipett för att se till att pH ligger mellan 3,4 och 3,6. Mät pH-värdet i PSM-lösningen med hjälp av pH-indikatorremsor. Tillsätt mindre mängder citronsyra och natriumhydroxid när pH-värdet närmar sig 3,5.
- Stäng av magnetomröraren och se till att flockar är synliga. Använd en ficklampa för att visualisera flocs.
-
pH-justering reagenser
- Flockning
- Släpp en omrörnings magnet i vattnet, Ställ magnetomröraren med maximal hastighet och slå på den. Se till att omrörnings magneten börjar snurra.
- Tillsätt 10 mL destillerat vatten till ett processtyrnings rör. Invertera röret några gånger för att rehydrera virus beståndet och Häll lösningen i vattnet.
- Häll innehållet i ett prov Konditionerings påse i vattnet och rör om i 5 min.
- Mät pH-värdet i vattenprovet med hjälp av pH-indikatorremsor. Tillsätt några droppar citronsyra eller natriumhydroxid i vattenprovet för att se till att pH ligger mellan 3,4 och 3,6. Tillsätt mindre mängder citronsyra och natriumhydroxid när pH-värdet närmar sig 3,5.
- Tillsätt 100 mL av PSM-lösningen med en 100 mL behållare.
- Försegla skopan med locket, Ställ magnetomröraren med minsta hastighet, och låt vattnet röra om i 8 h.
- Stäng av magnetomröraren och låt vattnet fortfarande i minst 5 h för att låta flockar att bosätta sig.
- Floc Collection
- Bygga ett häverteffekt system som består av en pipett Controller, två pipetter, och ett plaströr, att aspirera vattnet supernatanten för utsläpp av vattnet på flocs.
- Sätt fast en 10 mL av tejppipetten på pipettkontrollen. Fäst sedan spetsen på pipetten till plaströr.
- Ta bort filtret med en 10 mL pipett med pincett och fäst pipetten i plaströr.
- Placera en tom hink på golvet.
- Sänk spetsen på pipetten med öppen spets i vattnet. Se till att hålla den nära vattenytan för att undvika att störa flocs. Aspirera på vattnet supernatanten tills den når tejpen-end pipett.
- Nyp plaströr i änden fäst på tejppipetten och ta loss den från pipetten.
- Placera röret i en tom hink. Frigör trycket på röret för att låta vattnet flöda in i den tomma skopan.
- Nyp plaströr för att stoppa vattenflödet när vattennivån är på väg att nå omrörnings magneten och flytta pipetten bort från skopan.
- Skaka skopan för att Omsuspendera flockar och häll dem i en 500 ml stand-up plastpåse. Låt flockar att nöja sig med 1 h mer.
- Aspirera försiktigt på vatten supernatanten med hjälp av en 50 mL pipett och en manuell pipett Controller, undvika att störa flocs.
- Aspirera flockar med en 100 ml pipett och överför dem till en 50 ml graderad centrifug tub. Anteckna den slutliga volymen av prov koncentratet och överför 1 mL av det till ett 5 mL-rör som innehåller konserveringsmedlet med en Pasteur-pipett.
Anmärkning: det är viktigt att centrifugerröret graderas så att den slutliga volymen av det koncentrerade provet kan mätas så noggrant som möjligt och registreras. - Utföra nukleinsyrgasutvinning i fält. Alternativt kan du förvara den konserverings lösning som innehåller virusen vid 20-30 ° c i upp till 15 dagar eller skicka dem till ett referenslaboratorium för vidare analys.
- Bygga ett häverteffekt system som består av en pipett Controller, två pipetter, och ett plaströr, att aspirera vattnet supernatanten för utsläpp av vattnet på flocs.
- Avfallshantering och återanvändning av material
- Tillsätt innehållet i en påse med neutraliserande medel till skopan som innehåller det kasserade vattnet. Blanda vattnet, och sedan lämna det fortfarande i 30 min.
- Kassera det behandlade vattnet som allmänt avfall.
- Placera pipetterna och plaströr inuti skopan. Fyll skopan med vatten och häll i innehållet i ett neutraliserande medel dospåse.
- Tvätta dem i minst 30 min för att sterilisera dem och skölj dem med rikligt rent vatten för att avlägsna eventuella kvarvarande neutraliserande medel.
3. nukleinsyrgasextraktion
Obs: Använd handskar och bär alltid skyddsglasögon under nukleinsyra extraktionsproceduren.
-
Magnetisk pipett drift
- Bekanta dig med driften av den magnetiska pipetten innan du utför extraktionen.
-
Nukleinsyrgasextraktion
- Ordna rören som innehåller de reagens som krävs för extraktionen i ett rack, från vänster till höger: bindningsbuffert, tvättbuffertar och elutionsbuffert. Ställ in lämpligt antal tuber enligt antalet prover eller replikat som analyseras.
- Överför 1 mL av prov koncentratet till röret som innehåller bindningsbufferten med en engångspipett. Invertera röret 8x till 10X för att homogenisera lösningen.
- Inkubera lösningen i rumstemperatur i 10 minuter under kontinuerlig blandning, antingen med hjälp av en soldriven orbital eller manuellt.
- Samla de magnetiska partiklarna med hjälp av den magnetiska pipetten och en ren spets, som kan återanvändas för de tre tvättbuffertarna.
- Frigör de magnetiska partiklarna i röret som innehåller 500 μL tvättbuffert 1. Tvätta dem genom att försiktigt skaka lösningen med spetsen i 30-talet och samla dem.
- Överför de magnetiska partiklarna till röret som innehåller 600 μL tvättbuffert 2. Tvätta dem genom att försiktigt skaka lösningen med spetsen i 30-talet och samla dem.
- Överför de magnetiska partiklarna till röret som innehåller 200 μL tvättbuffert 3. Tvätta dem genom att försiktigt skaka lösningen med spetsen i 30-talet och samla dem.
- Frigör de magnetiska partiklarna i röret som innehåller elutionsbufferten och kassera spetsen.
- Inkubera lösningen vid rumstemperatur i 5 minuter medan den kontinuerligt blandas, med hjälp av den soldrivna orbital.
Anmärkning: att blanda de magnetiska partiklarna i elutionsbufferten är ett viktigt steg. Om det saknas en omloppsbana, blanda kontinuerligt för hand under inkubationstiden. - Byt ut spetsen på den magnetiska pipetten mot en ny och samla in de magnetiska partiklarna från elutionsbufferten. Se till att helt ta bort de magnetiska partiklarna från elutionsbufferten eftersom de kan störa molekylära detektionsmetoder.
- Kassera spetsen med de partiklar som är fästa vid den. Fortsätt med PCR-analysen, skicka elueringbufferten till ett referenslaboratorium eller förvara elutionsbufferten vid 4 ° c för vidare analys.
4. viral detektion med en batteridriven åtta-rör i realtid termocyklern
Obs: Använd handskar och alltid bära skyddsglasögon under nukleinsyra detekterings proceduren. Byt ut handskarna mot nya när du utför ett nytt PCR-experiment för att undvika korskontaminering.
-
HAdV kvantitativ PCR
- Tillsätt 14 μL nukleasfritt vatten till rören 2, 4 och 5.
- Tillsätt 4 μL PCR-blandning i rören 1-5.
- Tillsätt 14 μL nukleinsyrafutering från prov A till rör 1 och 14 μL från prov B till tub 3.
- Tillsätt 2 μL av de extraherade nukleinsyrorna från prov A till tub 2 och 2 μL från prov B till tub 4. Stäng femrörsremsan.
- Tillsätt 14 μL nukleasfritt vatten till rören 6, 7 och 8.
- Tillsätt 4 μL av denna blandning till rören 6, 7 och 8, och stäng dem.
- Sätt båda remsorna i termocykleren och välj lämplig körning (tabell 3).
- Kassera vatten röret och behåll den extraherade nukleinsyran i frysen, om möjligt, eller, om inte, på en ny plats skyddad från ljus om ett andra test måste utföras.
- Rengör Mikropipetter, racket, arbetsmaterialet och allt material på rätt sätt med en nukleinsyraftrenare, och kassera plastpåsen som innehåller den använda spetsen, handskar och rör.
Varning: nukleinsyra Remover är en mycket brandfarlig vätska och ånga. Andas inte in spraydimman och Undvik kontakt med vätskan med ögonen eller huden. Annars, omedelbart skölj med rikligt med vatten och kontakta läkare. - Samla in resultaten och analysera erhållna data.
-
MS2 kvantitativ PCR
- Tillsätt 14 μL nukleasfritt vatten till rören 2, 4 och 5.
- Tillsätt 4 μL PCR-blandning och 0,5 μL omvänt transkriptasenzym till rören 1-5.
- Tillsätt 14 μL nukleinsyrafutering från prov A till rör 1 och 14 μL från prov B till tub 3.
- Tillsätt 1 μL av de extraherade nukleinsyrorna från prov A till tub 2 och 1 μL från prov B till rör 4. Stäng femrörsremsan.
- Tillsätt 15,5 μL nukleasfritt vatten till rören 5, 6, 7 och 8 och stäng dem.
- Tillsätt 4 μL PCR-blandning och 0,5 μL omvänt transkriptasenzym till rören 6, 7 och 8.
- Sätt båda remsorna i termocykleren och välj lämplig körning (tabell 3).
- Fortsätt enligt beskrivningen i steg 4.1.8 till 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodutveckling
Detta förfarande har utvecklats i laboratoriet av virus föroreningar av vatten och mat med samarbete med GenIUL och Oxfam Intermón. Den består av tre olika steg. Den första, virus partikelkoncentrationen, är en anpassning av en skum mjölks metod som tidigare beskrivits12,17,18. Den ursprungliga metoden ändrades för att vara oberoende av en strömförsörjning, enklare, och utan centrifugering steg.
Återhämtningen av den Virwataste koncentrations metoden testades i HAdV-och MS2-spetsiga grundvatten prov. Viral återhämtning av VirWaTest koncentration och extraktion metod beräknades vara 3,01% till 18,02% för MS2 och 17,52% till 44,22% för HAdV. Dessa återvinningar beräknades utifrån de värden som erhölls genom kvantitativ PCR under utvecklingen av metoden jämfört med de initiala koncentrationerna av HAdV och MS2 i vattenproverna efter att ha spiat dem med kända koncentrationer av dessa virus bestånd.
Den VirWaTest magnetisk nukleinsyra utvinning jämfördes med en kommersiell RNA mini kit (t. ex., QIAamp viral RNA mini kit), en kolumn-baserad extraktion metod som används i laboratoriet, genom att testa 33 flod och grundvatten prover spetsade med HAdV och MS2 och koncentrerade skum mjölks flocympning. Jämförelse resultaten visade att den Virwataste metoden återhämtning var högre i 23/33 fall för HAdV, samt för MS2 (tabell 4). Ett Wilcoxon-test visade p-värden på 0,0005569 för hadv och 0,02791 för MS2. VirWaTest nukleinsyra utvinning ger betydligt högre viral återvinningar än den kommersiella en.
Detektion av HAdV i miljö vattenprover koncentrerade av VirWaTest metoden
För att testa den utvecklade metoden för viral koncentration i fält, den Oxfam vatten, sanitet och hygien (WASH) team, som ligger i Banghi (RCA) i mars 2017, insamlade och koncentrerade virus från fem väl vatten prover.
Även i området Pedernales (Ecuador), som drabbades av jordbävningar i 2016 och 2017, sex väl vatten prover samlades in av en Oxfam tvätt team i februari 2017, och dess virus koncentrerades av VirWaTest koncentrations metod. Viral koncentrat från båda inställningarna skickades till laboratoriet i Barcelona för VirWaTest nukleinsyra utvinning och viral kvantifiering.
I Ecuador upptäcktes naturligt förekommande HAdV i sex av de sex analyserade proverna, med koncentrationsvärden från 3,27 x 101 till 1,80 x 102 GC/L, medan en av de fem prover som samlats in och koncentrerades i banghi (RCA) testade positivt för HAdV, vid en koncentration av 3,46 x 102 GC/L (tabell 5).
MS2, som lagts till alla testade prover som intern processkontroll, upptäcktes i alla prover testas, visar att metoden korrekt utfördes från koncentration till detektion.
Figur 1 : Virwatest metod. Översikt över stegen den VirWaTest metoden består av. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Material | Koncentration | Nukleinsyrgasextraktion | Upptäckt |
| Utrustning | Magnetomrörare (2 enheter) Batteri (2 enheter) Kontakter för batteri/omrörare (2 enheter) Strömadaptrar (2 enheter) Skopstöd (2 enheter) Rep (1 enhet) Omrörare magnet (3 enheter) Pincett (1 enhet) Silikonrör (1 enhet) Pipettkontroll (1 enhet) Markör (1 enhet) |
Magnetisk pipett (1 enhet) Solar roterande plattform (1 enhet) Rör rack med flera storlekar (1 enhet) Timer (1 enhet) |
ThermoCycler (1 enhet) Batteri (1 enhet) Dator Rör rack (1 enhet) 0,5 μL-10 μL mikropipett (1 enhet) 2 μL-20 μL mikropipett (1 enhet) |
| Förbrukningsvaror och reagenser (för varje 2 vattenprover/replikat) | Skopa (3 enheter) pH-indikatorremsor Tape-end 10 mL pipett (2 enheter) 10 mL pipett med öppen spets (2 enheter) Tape-end 50 mL pipett (2 enheter) Tape-end 100 mL pipett (2 enheter) Pastej pipett (4 enheter) Stand-up plastpåse (4 enheter) Plastbehållare med 25 mL destillerat vatten (1 enhet) Plastbehållare med 50 mL destillerat vatten (1 enhet) 100 mL tom behållare (1 enhet) Handskar (6 par) Processtyrning (2 rör) Tub med 10 mL destillerat vatten (2 enheter) Citronsyra (1 tub) Natriumhydroxid (1 rör) Fettfri mjölk (1 tub) Dospåse av citronsyra (1 enhet) Destillerat vatten (1 500 mL flaska) Prov konditionering (2 påsar) Konserverande lösning (2 rör) Neutraliserande medel (4 dospåsar) |
Magnetiska pipettspetsar (2 enheter) Pastej pipett (2 enheter) Bindningsbuffert (2 rör) Tvättbuffert 1 (2 rör) Tvättbuffert 2 (2 rör) Tvättbuffert 3 (2 rör) Elueringbuffert (2 rör) Handskar (6 par) |
10 μL Mikropipettspetsar (1 låda) 20 μL Mikropipettspetsar (1 låda) DNA qPCR mix (1 rör) RNA qPCR mix (1 rör) Omvänt Transkriptasenzym (1 rör) Molekylär biologi vatten (1 tub) HAdV Tubremsa med primers, sond och standard (1 enhet) MS2 Tubremsa med primers, sond och standard (1 enhet) Nukleinsyra Remover Handskar (6 par) |
Tabell 1: VirWaTest innehåll. Utrustning, förbrukningsvaror och reagenser som måste förberedas för koncentrering, extraktion och detektion av virus i två vattenprover/replikat.
| Virus | Grundfärger | Genbank anslutning nr. | Position | Sekvens (5 ' \u20123 ') | Längd | Referens | ||
| Humant adenovirus (HAdV) | Adf | J 01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 Bakteriophage (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659 \ u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabell 2: Oligonukleotides för kvantitativa PCR-experiment. Primers och sond utformad för att binda till nukleinsyrtalsekvenser av HAdV och MS2.
| Temperatur | Tid | Cykler | Temperatur | Tid | Cykler |
| 95 ° c | 12 minuter med | 1 | 55 ° c | 15 min | 1 |
| 95 ° c | 10 min | 1 | |||
| 95 ° c | 15 s | 40 | 95 ° c | 15 s | 40 |
| 60 ° c | 1 min | 60 ° c | 1 min |
Tabell 3: termiska förhållanden för kvantitativa PCR-experiment. Temperatur, tid och cykler som används för HAdV och MS2 amplifiering.
| QIAgen | VirWaTest | QIAgen | VirWaTest | ||
| Median | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Menar | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-värdera (Wilcoxon) för HAdV: 0,0005569 | |||||
| p-värde (Wilcoxon) för MS2:0,02791 | |||||
| Virus testade | Prov som testats | QIAgen | VirWa-test | ||
| HAdVen | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabell 4: VirWaTest utveckling av nukleinsyra utvinning. Median-, medelvärde-och SD-värden som erhålls vid jämförelsen av QIAGEN och VirWaTest extraktionsmetoder i 33 grundvatten prov för HAdV och MS2.
| Land | Webbplats | Prov | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de La SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, by 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, Village 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Borrhål A | 6 | 7,96 x 101 |
| Borehole B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Borrhål C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Well Water A | 9 | 6,06 x 101 | |
| Well Water B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Väl vatten C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabell 5: kvantifiering av HAdV med metoden VirWaTest. Kvantitativa PCR-resultat, uttryckta i GC/liter, för HAdV som kvantifierats i vattenprover som samlats in och koncentrerats från RCA och Ecuador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden VirWaTest möjliggör koncentration av virus och nukleinsyreutvinning från vattenprover vid den tidpunkt då de används av icke-erfarna användare. Det är ett överkomligt, snabbt och enkelt protokoll. Koncentrationen bygger på principen om organisk flocympning med skummjölk, genom vilken lågt pH och hög konduktivitet gör skum mjölks proteiner samlade i flockar virusen adsorberas till. När flockar sediment är det lätt att samla in dem, vilket gör det möjligt att koncentrera 10 L vatten, medan traditionell ultracentrifugering inte kan hantera stora vattenvolymer.
Metoden har modifierats för att vara praktiskt genomförbar vid provtagningspunkten utan att använda någon elektrisk utrustning med undantag för en batteridriven magnetomrörare. Vissa andra metoder baserade på vatten filtrering har anpassats till koncentrationen av virus och kan även utföras vid användnings punkten. Suspenderat material som förekommer i vattenprover täpper dock ofta till filtren. den lilla volym som kan koncentreras till dessa system är alltså en allvarlig begränsning.
Detta är den första beskrivningen av en metod för att koncentrera virus från vattenprover vid användnings punkten, oavsett provets grumlighet. Den Virwataste koncentrations metoden gör det möjligt att bearbeta flera prover samtidigt om lämpligt material finns tillgängligt. Dessutom har skum mjölks fällning visat sig vara användbart för bakterier och parasit koncentration19.
Beredningen av lämpligt material är avgörande för att utföra förfarandet på rätt sätt. Överväg hur många vattenprover som ska analyseras och preparera reagenser och material innan de flyttas till den plats där provet behövs för beredning av reagenser och material. Flera prover kan bearbetas samtidigt om lämplig mängd material finns tillgängligt.
Innan koncentrationen av ett vattenprov påbörjas kommer en känd koncentration av ett virus bestånd att användas för att spetta provet som processtyrning. Denna metod använder ett torkat virus bestånd som är rehydrerad med destillerat vatten innan de tillsätts till vattenprovet vid användnings punkten. Detta är användbart för att utesluta falskt negativa resultat i slutet av förfarandet och ger en indikation om metodens prestanda.
Viral koncentrat som erhålls med VirWaTest kan testas ytterligare inom det område som tillämpar VirWaTest-metoden för utvinning och detektion av nukleinsyra eller, alternativt, koncentrat kan sändas till ett referenslaboratorium vid rumstemperatur. Den konserverings lösning som tillsätts koncentratet gör att virus kan förbli stabila i upp till 2 veckor (opublicerade resultat).
VirWaTest nukleinsyrgasextraktion är en magnetisk partikel-baserad metod. Det är enkelt och snabbt och tillåter flera prover som skall bearbetas samtidigt och visar likvärdiga och ännu bättre återhämtning effektivitet än metoder som för närvarande används för viral nukleinsyra extraktioner. Nukleinsyror kan sändas till referens laboratorier vid rumstemperatur eller, om användarna är övertygade om att utföra molekylär detektion, kan en kvantitativ PCR-analys utföras vid den punkt där det ursprungliga vattenprovet används.
Även om det finns en liten laboratorie anläggning kan det Virwataste koncentrations protokollet kopplas till standard-nukleinsyreextraktionssatser som är beroende av en centrifug och standard-PCR-baserade metoder som kräver en frys för att bibehålla reagenserna, men som använder standard termocyklers, som är billigare än batteridrivna sådana.
Men eftersom ett nätaggregat ibland inte finns, har vi optimerade detektions analyser för MS2 bakteriofages som processtyrning och HAdV som en viral fekal indikator, och metoden kan anpassas för alla andra virus av intresse, såsom hepatit virus, RoV, NoV, eller andra, som skall köras på fältet utan att behöva en frys för underhåll av reagenser, eller konventionella termocyclers men bara en batteridriven en. Flera batteridrivna termocyklers är kommersiellt tillgängliga. Alternativt kan annan konventionell qPCR-utrustning användas om det finns en strömkälla. Om en termocycler med åtta rör används, kan upp till två nukleinsyrgasextraktioner (två olika prover eller två replikat från samma prov) testas i samma PCR-analys. För varje nukleinsyrafutering kommer två olika kvantiteter att testas för att utesluta enzymatisk hämning som har sitt ursprung i provet. Anpassningen är baserad på tidigare beredning av PCR-rör med lufttorkning primers, sonder och standard suspensioner. Flera frystorkade kommersiella qPCR-lösningar finns som kan användas genom att tillämpa samma förfarande som beskrivs här. Vi har beskrivit en möjlighet som vi ansåg vara lätta att utföra.
Jämförelseanalyser som utfördes under utvecklingen av metoden visade att de Virwataste metoderna för koncentration, extraktion och detektion är effektiva för kvantifiering av virus i vattenprover.
Detektionsgränsen (LOD) för den beskrivna proceduren är variabel eftersom volymen som samlas in efter koncentrationen varierar. Dessutom kan LOD vara något annorlunda för olika virus. Om en volym på cirka 10 L samlas in, skulle LOD för HAdV vara runt 1 x 102 viral GC/l. Så, relativt små koncentrationer av HAdV kan upptäckas av VirWaTest metoden. I Pedernales (Ecuador), sex av de sex prover som testats presenterade HAdV, i koncentrationer nära LOD, som sträcker sig från 3,27 x 101 till 1,80 x 102 GC/L. I Banghi (RCA) upptäcktes HAdV i en av de fem analyserade proverna, vid en koncentration av 3,46 x 102 GC/L. Närvaron av HAdV, liksom närvaron av MS2 som kontrollprocessen i de testade proverna, visar att metoden är användbar för återvinning av virala partiklar från vattenprover, även när de utförs av icke-erfarna användare.
Återkoppling som erhållits fram till nu indikerar att viral koncentration är ett enkelt förfarande att utföra, utan några större problem när de appliceras vid tidpunkten för användning av proverna, även om 8 h och 5 h steg krävs. Det är viktigt att notera att dessa steg sker utan mänsklig hjälp. Dessutom utvecklas en snabbare metod baserad på filtrering som ett alternativ för nonturbid vatten. Men, flocympning verkar vara, fram till nu, den unika metod som gör att koncentrationen av prover som uppvisar hög grumlighet. Viral koncentrat kan sedan skickas till alla laboratorier runt om i världen vid rumstemperatur, vilket också gör det lättare att testa virus eftersom provtagnings områden inte alltid har bra transporttjänster som ger kyl förhållanden. Alternativt kan de utvinnings-och detekterings protokoll som presenteras här tillåta testning för viral detektion vid användnings punkten för proverna.
Såvitt vi vet är detta den första metoden som rapporteras vara användbar för koncentrationen och testning för förekomst av virus i vattenprover i fältet. Ytterligare ansträngningar bör göras för att tillämpa förfarandet på utvärderingen av förekomsten av humana virala patogener av intresse i flera andra humanitära krisscenarier. Dessutom kommer användarens feedback vara nödvändigt att ge insikter i den potentiella implementeringen för att göra förfarandet vänligare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
VirWaTest var ett forskningsprojekt finansierat av HIF (humanitärt innovationsfonder) program för ELHRA (förbättra lärandet & forskning för humanitärt bistånd). Författarna erkänner de tvätt team som vänligt samarbetade i denna studie. Analysen av prover i Ecuador finansierades av Oxfam Ecuador och Dirección de Investigaciones de La Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas är en Serra-Hunter Fellow vid universitetet i Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
