Summary
여기에서, 우리는 소 무릎에서 연골 이식의 격리 및 배양을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관절을 표적으로 하는 생물학적 자극 또는 새로운 치료법에 반응하여 조직 변화를 설명하기 위한 쉽고 접근가능한 도구를 제공한다.
Abstract
Ex vivo 배양 시스템은 네이티브 환경에서 조직 및 세포 기능을 연구하는 데 전념하는 광범위한 실험을 다룹니다. 연골은 활액 관절의 적절한 기능에 중요한 독특한 조직이며, 프로테오글리칸과 타입 II 콜라겐이 풍부한 조밀한 세포외 매트릭스(ECM)로 구성됩니다. 연골 세포는 연골 내에 존재하는 유일한 세포 유형이며 광범위하고 상대적으로 숫자가 낮습니다. 변경된 외부 자극 및 세포 신호는 골관절염 (OA) 및 류마치스성 관절염과 같은 질병에 있는 중요한 병리학 적인 특징인 ECM 조성 그리고 열화에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다.
Ex vivo 연골 모델은 1) 연골 조직 회전율의 연골 세포 매개 변경의 프로파일링을 허용하고, 2) 연골 ECM 조성물을 시각화하고, 3) 연골 세포 재배열을 조직에서 직접 재배열할 수 있다. 자극 또는 치료에 대한 응답으로 이러한 변경을 프로파일링은 연골 생물학의 다양한 측면에서 매우 중요하며, 분리 된 연골 세포에서 시험관 내 실험, 또는 실험 조건이있는 살아있는 동물의 복잡한 모델을 보완합니다. 제어하기가 더 어렵습니다.
연골 전지는 제어 가능한 설정에서 연골 ECM에서 조직 리모델링을 평가하기위한 번역 및 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제시한다. 여기에서, 우리는 살아있는 소 연골 이식을 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 소 무릎의 조직을 사용하며, 현지 도축장에서 쉽게 접근 할 수 있습니다. 이식 및 컨디셔닝 된 배양 배지 모두 조직 회전율, ECM 조성 및 연골 세포 기능을 조사하기 위해 분석 될 수 있으며, 따라서 ECM 변조를 프로파일링합니다.
Introduction
연골 세포는 연골 매트릭스를 생성하고 유지합니다. 연골 세포의 생물학을 연구하고 그들과 주변 ECM이 외부 자극에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해서는 그들의 모국 환경에서 심문하는 것이 중요합니다1,2. 연골 조직 회전율을 공부하는 것은 OA와 같은 합동 질병에 있는 근본적인 기계장치의 이해를 증가시키기 위하여 중요합니다, 질병 은 현재 아무 질병 변경 처리도 없습니다. 따라서 더 나은 번역 모델2에대한 상당한 필요성이 있습니다.
세포 및 조직 효과의 생체 내 특성화는 연골세포 단층 배양과 같은 체외 및 생체 내, 수술 유발 OA 모델 또는 자가면역 콜라겐 유도 관절염 모델(CIA)을 보완하는 데 필수적입니다. ). 수많은 연구는 세포가 2D 단층 배양과 3D 구조또는 그들의 기본 조직에서 어떻게 행동하는지의 차이를 강조했다3,4. 2D 층의 많은 세포는 세포 극성과 조직 부착의 차이를 포함하여 부자연스러운 형태를 채택하여 기본 조직 내의 세포에서 시각적 및 기능적 차이를 모두초래합니다 5. 그 차이는 또한 단백질 발현을 변화시킬 수 있는 세포의 기능성에서 명백하며, 이는 심오한 변화된 분화 패턴, 조절 기계 및 세포 기능5,6,7로 이어진다. ,8.
연골 ECM은 주로 매트릭스 프레임 워크를 제공하는 유형 II 콜라겐으로 구성, 그리고 aggrecan, 조직 내에서 유체를 유지하는 데 도움이 프로테오글리칸. 콜라겐 형 IV, VI, IX, X, XII, 피브로넥틴, 연골 올리고메릭 단백질(COMP), 빅리칸, 데코린 및 펄칸과 같은 다른 매트릭스 분자도9.
OA의 병인학은 불분명하게 남아 있는 동안10,11,질병의 개시는 조직 회전율 및 수리 과정의 불균형에 기인하는 것으로 여겨진다12,13. 관절 연골의 저하는 OA의 특징입니다. 주변 조직에 있는 연골 세포 또는 세포는 사이토카인의 그들의 방출을 증가시키고, 매트릭스 금속 단백질성 (MMPs) 및 동맥과 같은 단백질아종의 높은 생산을 자극하여 연골 ECM의 분해를 증가시다. 14.이러한 분해는 신에피토프라고 불리는 작은 독특한 단백질 단편의 방출을 초래하며, 이는 혈청, 소변, 또는 배양 배지15에서정량화될 수 있다. 콜라겐의 형성과 성숙시, 소위 profragments는 또한 풀어 놓입니다; 이들은 매트릭스 생산(16)의측정으로 정량화 될 수있다.
이 프로토콜의 목적은 ECM 조직 회전율에 대한 자극 및 / 또는 약물 치료의 효과를 비교하기 위해 생체 연골 모델을 확립하는 것입니다. 연골 회전율은 ELISA를 사용하여 컨디셔닝 된 배양 배지에서 매트릭스 유래 네오 에피토프 바이오 마커를 직접 측정하여 프로파일링됩니다: AGNx1 (응형 활성 반영), C2M (반사 매트릭스 MMP 활성), 및 ProC2 (반성 형 II 콜라겐 반사) 형성)을 형성합니다. 사실 인정은 또한 개별 적인 이식에 있는 연골 세포의 조직을 구상하는 ECM의 조직학 염색에 의해 확인될 수 있습니다. 기재된 프로토콜은 연골세포 기능 및 연골 ECM 회전율에 대한 신규한 치료법의 효과를 테스트하는데 사용될 수 있다. 많은 연구에서 생물학적 과정 또는 정량적 조직학적 또는 면역 조직화학적 접근법, mRNA, 단백질 발현 또는 프로테오믹스를 사용하여 사이토카인 도전 이식에 대한 개입의 효과를 설명하기 위해 연골 이식을 사용했습니다2 ,17,18. 그러나 이러한 프로토콜은 현재 원고의 범위를 벗어납니다.
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Protocol
1. 조직 격리
- 조직 소싱
- 무균 환경에서 층류 후드 외부의 전체 조직 소싱 섹션을 수행합니다.
- 지역 도살장에서 1.5 세에서 2 세 사이의 송아지에서 신선한 소 경골 무릎 관절 전체를 얻으라.
- 먼저 여분의 살을 제거하고, 콘디일, 반월 상 연골, 힘줄 및 활막막을 발견하여 종아리 무릎을 부드럽게 해부하십시오. 힘줄과 활막을 잘라 관절이 절단 할 수 있도록. 대퇴 골반 을 노출 하는 반 월 상 연 골을 제거 합니다.
- 대퇴골 의 하중 운반 영역에서 3mm 생검 펀처를 사용하여 대퇴 부도덕한 부위로부터 이식을 분리하고 가능한 한 골수 뼈에 평행하게 메스를 절단하여 관절 표면에서 방출합니다. 경골 뼈의 단단한 구조는 이식이 석회화 된 매트릭스를 포함하지 않도록해야합니다. 균일 한 높이의 이식을 위해 노력하십시오.
- 즉시 저장하고 50 mL 튜브 또는 페트리 접시에 DMEM / F12- 글루타 맥스 + 1 % P / S 배양 매체에 이식을 혼합합니다. 다른 암소 무릎에서 이식을 혼합하지 말고 각 연구에 대해 별도로 유지하십시오.
- 조직 배양
- 동식물을 멸균된 96웰 플레이트로 층류 후드로 옮김을 전달한다.
- 배양 배지 또는 PBS에서 3회 이식을 세척하고 실험이 시작될 때까지 잘 당 배양 배지의 200 μL에서 배양한다. 생검 세포 활성과 수동 바이오마커 방출을 동기화하기 위해 1일의 세척 기간을 사용하십시오.
- 배양된 배양은 5%CO2를가진 37°C 인큐베이터에서 10주까지 이식한다. 모든 복제물을 배양 판에 대각선으로 배치하여 증발에 의해 유발되는 변동을 최소화합니다. 상급물의 증발을 더 피하려면 배양 판의 외부 우물에 PBS를 추가하십시오.
2. 소 연골 이식 치료 및 신진 대사 활동의 평가
- 배양 배지 변화 및 치료
- 배양 배지를 층류 후드에서 2-3일마다 변경한다.
- 어떤 처리를 적용하는 경우에, 매체를 바꾸기 전에 이들을 준비하십시오. 배양 배지에서 희석하여 배양 웰에서 원하는 농도로 처리를 준비한다.
- 각 우물에서 상판을 부드럽게 제거하고 새로운 96 웰 플레이트로 옮김하십시오. 조직 회전율 및 단백질 발현의 바이오마커 분석을 위해 -20°C의 밀봉 테이프로 상급자를 보관하십시오.
- 즉시 신선한 배양 배지 또는 치료1개당 200 μL을 추가합니다. 배지 가변 중에 이식이 마르지 않도록 하고 모든 이식이 완전히 새 매체에 잠기도록 하십시오.
- 레자주린 염색
- 세포 생존의 간접 측정으로 매주 한 번 신진 대사 활동을 측정합니다. resazurin 시험은 세포 죽음 또는 세포 변경 때문에 개별 적인 이식에 대 한 이식의 신진 대사 활동 악화 하는 경우 평가 하는 쉬운 방법. 배양 배지에서의 이적은 실험 기간 내내 비교적 안정된 레자주린 판독값을 가진다.
- 10 % resazurin으로 배양 배지의 용액을 만드십시오.
- 2.1.3단계에서 설명한 대로 상급체를 수확한다.
- 37°C에서 또는 상피제자가 보라색으로 변할 때까지 3시간 동안 10% resazurin 용액에 이식합니다. 배경 컨트롤로 이식없이 4 웰을 포함합니다.
- 조절식 및 배경 제어 레사주린 용액을 블랙 마이크로티터 플레이트로 옮기고 540 nm 여기/590 nm 방출에서 형광을 측정합니다.
- 배양 배지 또는 PBS에서 3회 철저히 세척하고 레자주린이 완전히 확산될 수 있도록 5-10분 동안 세척 매체에 박을 담급금합니다. 사용 하는 경우 새로운 배양 매체 또는 치료를 추가 합니다.
3. 종료, 고정 및 샘플 저장
- 배양 기간의 종료
- 2.2단계에서 기재된 바와 같이 대사 활성을 측정한다. 웰당 200 μL의 PBS를 추가합니다.
- 고정 및 보관
- PBS를 제거하고, 잘 당 200 μL의 포름알데히드를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 둡니다.
- 포름알데히드를 폐기하고 웰당 200 μL의 PBS를 첨가한다. 밀봉 테이프로 플레이트를 덮고, 의 화학적 분석을 위해 4 °C에서 저장합니다. 우리는 3 개월 이내에 조직 화학 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
4. 조직 회전율 바이오 마커 (ELISA)
- 간접 경쟁 엘리사
- 스트렙타비딘 플레이트를 특이적 생체분석표적-펩타이드로 코팅하여 20°C에서 30분 동안 분석 완충액(well 당 100 μL)으로 1:100희석하였다.
- 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 시료 상판(잘당 20 μL)을 ProC2의 경우 1:93.3, AGNx1(웰당 100 μL)에 대해 희석된 분석 표적 펩티드에 대해 1차 단일클론 항체와 함께 추가하고 20°C에서 2시간 동안 배양합니다. ProC2에 대한 흔들림과 3 시간 AGNx1에 대한 20 °C에서.
참고: 샘플 부피는 저장된 상급 플레이트에서 직접 채취됩니다. 측정된 농도가 분석 측정 범위를 벗어난 경우, PBS 또는 분석 버퍼에서 v-바닥 희석판에 상판을 희석한다. - 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 1시간 동안 1:100의 분석 버퍼(웰당 100 μL)로 희석된 과산화아제 표지 이차 항체로 배양합니다.
- 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 어둠 속에서 15분 동안 흔들어서 페산화아제 기질(Well 당 100 μL)으로 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 배양합니다.
- 표준 정지 용액, 0.1 M H2SO4 (웰 당 100 μL)로 반응을 종료합니다.
- 표준 실험실 플레이트 리더에서 650 nm에서 기준 흡광도를 사용하여 450 nm 흡광도에서 대색 반응을 판독합니다.
- 상복부에서 연골 조직 회전율의 측정을 위한 직접 경쟁 ELISA
참고: C2M을 정량화합니다.- 20°C에서 30분 동안 특정 생체분석표적-펩타이드를 1:100으로 희석한 분석완충액(웰당 100 μL)으로 스트렙타비딘 플레이트를 코팅한다.
- 세척 버퍼로 5 회 세척하고 분석 표적 펩티드 희석 1:100에 대해 100 μL의 과록시다아제 표지 된 단일 클론 항체와 함께 샘플 상급제를 첨가하십시오 (잘 당 20 μL). 2-8 °C에서 20 시간 동안 배양하고 흔들어 보세요.
참고: 샘플 부피는 저장된 상급 플레이트에서 직접 채취됩니다. 측정된 농도가 분석 측정 범위를 벗어난 경우, PBS 또는 분석 버퍼에서 v-바닥 희석판에 상판을 희석한다. - 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 암흑에서 15분 동안 흔들어 서 과산화아제 기판으로 TMB(웰당 100 μL)로 배양합니다.
- 표준 정지 용액, 0.1 M H2SO4 (웰 당 100 μL)로 반응을 종료합니다.
- 표준 실험실 플레이트 리더에서 650 nm에서 기준 흡광도로 450 nm 의 흡광도에서 대색 반응을 판독합니다.
- 아그앤스1
- AGNx1 네오 에피토프의 방출을 측정하여 침략열화를 정량화한다. 이러한 간접경쟁적인 ELISA 분석은 ADAMTS-4 및 5 절단에 의해 생성된 아그레칸 C-말단 펩티드(NITEGE373)를대상으로 한다. 단일클론 항체는 노출된 NITEGE 에피토프를 가진 모든 단편을 인식합니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 출판되었습니다19.
- ProC2
- 타입 II 콜라겐의 프로프란단의 방출을 측정하여 타입 II 콜라겐 형성을 정량화한다. 이 간접 경쟁 ELISA 분석은 새로 합성된 타입 II 콜라겐의 트리밍 중에 N-프로펩티다제에 의해 생성된 PIIBNP 프로펩티드(QDVRQPG)의 에피토프를 대상으로 합니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 게시되었습니다16.
- C2M
- C2M 네오 에피토프 단편의 방출을 측정하여 타입 II 콜라겐 분해를 정량화한다. 이러한 직접적인 경쟁적인 ELISA는 MMP-크리브 C-말단 펩티드(KPPGRDGAAG1053)를인식한다. 이 분석은 AGNx1 및 ProC2와 다릅니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 게시되었습니다20.
5. 조직학적 분석
- 침투, 임베딩 및 절단
- 고정된 이식(3.2단계 참조)을 개별적으로 레이블이 있는 카세트에 넣습니다. 식별을 보장하기 위해 카세트와 라벨 카세트 에 라벨을 모두 포함하십시오.
- 이식이 들어 있는 카세트를 티슈 프로세서 기계로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 담는다. 그런 다음 일련의 탈수 및 파라핀 침투 단계에서 파라핀으로 이식을 침투시고 파라핀을 침투시고 파라핀을 침투시면 됩니다.
- 온도 조절 없이 90분 동안 96% 에탄올로 탈수합니다. 이 단계를 3번 반복합니다.
- 온도 조절 없이 톨루엔으로 에탄올을 90분 동안 치웁습니다. 이 단계를 2번 반복합니다.
- 60 °C에서 90 분 동안 톨루엔으로 에탄올을 지웁습니다.
- 60 °C에서 파라핀 왁스로 30 분 동안 침투하십시오.
- 60 °C에서 파라핀 왁스로 60 분 동안 침투하십시오.
- 60 °C에서 90 분 동안 파라핀 왁스로 침투하십시오.
- 각 단계에 대해 33~34kPa 미만의 느린 펌프 아웃 및 펌프 인 흐름으로 샘플 챔버에 솔루션을 추가합니다. 최대 진공 -65 ~ -70 kPa의 압력/진공 사이클에서 침투 공정을 실행합니다.
- 침투 후, 카세트가 카세트에서 조심스럽게 제거 될 수 있도록 가열 블록에 카세트를 놓습니다. 침투된 이식액을 개별 파라핀 블록에 부드럽게 내장합니다. 가열 된 집게로, 각 표본 섹션 내에서 다른 연골 층의 시각화를 보장, 절단 표면에 수직 표면 관절 연골과 하위 연골 뼈 측면으로 박동을 배치합니다.
- 마이크로토메에 이식이 내장된 냉각된 파라핀 블록의 5 μm 섹션을 잘라냅니다. 절단 된 부분을 냉수 욕조로 옮니다. 필요한 경우 메스 또는 커버 유리를 사용하여 섹션을 분리 할 수 있습니다.
- 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 조심스럽게 사용하여 섹션을 따뜻한 수조(50°C)로 옮기고 섹션이 펼쳐지도록 합니다. 각 부분을 라벨이 붙은 커버 슬라이드에 올려 놓고 핫 플레이트에 30분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 바구니에 넣고 60 °C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 37 °C에서 밤새 유지하십시오. 이에 따라 밀폐용기에 미끄럼을 4°C로 보관하여 얼룩이 지닫는다.
- 사프라닌 O/패스트 그린 염색 및 시각화
- 슬라이드를 바구니에 얼룩지게 하고 슬라이드를 60°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 0.45mm 필터로 모든 시약을 준비하고 여과하십시오.
- 염색을 준비하기 위해 비커에 여과된 시약을 부어 바구니를 담글 때 용액이 슬라이드를 완전히 덮을 수 있도록 합니다. 사용된 비커는 슬라이드를 덮기 위해 250 mL의 부피가 필요했습니다.
- 바구니를 톨루엔에 10분 2회, 에탄올 99%, 에탄올 2회, 에탄올 96%, 에탄올 2회, 에탄올 70%를 2회 2회 담그어 녹인 슬라이드를 탈파합니다. 그런 다음 슬라이드를 물에 2 분 동안 수화하십시오.
- Weigert의 철 헤마톡실린 용액(pH 1.5)에 바구니를 10분 동안 담그고, 1% HCl에 1회 담그고, 흐르는 수돗물로 약 5분 간 또는 과도한 색이 씻겨나갈 때까지 씻어냅니다.
- 다음으로, 0.05% 빠른 녹색 용액(pH: 5.75)을 5분 동안, 1% CH3COOH에 1회 담그고, 0.1% 사프라닌 O(pH: 6.5)에서 20분 동안 얼룩을 가다.
- 70% 에탄올, 96% 에탄올을 2회, 에탄올 99%를 2회, 2회 2회, 톨루엔 2분 2회에 2회 침지하여 슬라이드를 탈수하고 제거합니다.
- 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 구조학 슬라이드를 덮는 수지 매체로 장착합니다.
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Representative Results
소 전체 깊이 의 이식은 3 주 동안 분리, 배양 및 처리하였다(그림 1). 배양 배지는 일주일에 3회 치료를 추가하여 변경하였다. 1회 주간, 대사 활성은 레자주린 분석에 의해 측정되었다. ECM 회전율의 바이오마커는 배양플레이트로부터 수확한 상복부에서 주 3회 측정하였다. 이식은 치료를 위해 4그룹으로 나누어졌다: 1) 온코스테틴 M 및 TNFα (O+T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) 성장 인자-1 같은 인슐린 (IGF-1); 및 4) 치료없이 제어 (w / O).
신진 대사 활동.
4개 그룹 모두에 대해, 대사 활성은 3주 동안 비교적 안정적이였다(도2A). IGF-1에 대 한 경향이 있었다 약간 w/o 그룹 위에 신진 대사 활동을 증가 하 고 그것을 줄이기 위해 O +T 그룹에 대 한. resazurin 분석실험은 각 이식에서 연골세포의 활성을 용이하게 평가하고 실험으로부터 이식을 추출하지 않고 간접적으로 세포 생존가능성을 평가하는 데 사용되었다. 이식이 실험 동안 대사 활성에 상당한 저하를 나타낸다면, 이식은 추가 분석에서 제외될 수 있다.
이화 치료.
O+T는 O+T 매개 연골 저하를 조사하기 위해 배양 유정에 매주 3회 적용하였다(그림3, 도 4). MMP 매개 형 II 콜라겐 분해 및 응고 매개 된 아그레칸 분해는 C2M 및 AGNx1 ELISAs에 의해 평가되었다. O+T는 7-21일(도3A)에서타입 II 콜라겐 분해를 증가시키고 3-14일(도4A)로부터의 아그레칸 분해를 w/o 군과 비교하였다. O+T 치료와 조합하여 GM6001(광범위한 MMP 억제제)을 첨가할 때, O+T 매개 C2M 방출이 차단되었다(그림3A,B). 감소 된 AGNx1 릴리스는 3-7 일에 GM6001을 추가 할 때 관찰되었지만, 10 일 AGNx1 릴리스피크는 O + T 그룹(그림 4A)과유사한 수준에서, GM6001은 제한된 정도로 침략 저하를 감소시이어. AGNx1 및 C2M 방출에서 이 패턴은 O+T로 자극된 소 연골 모델에서 관찰된 일반적인 그림이다. 첫째, AGNx1은 대략 3일째부터 방출되고 10-14일에 피크가 정점에 도달하여 침략의 조기 저하를 나타냅니다. 다음으로, O+T로 배양한 지 2주 후, 타입 II 콜라겐 분해는 C2M 바이오마커에 의해 측정된 바와 같이 관찰된다.
단백 동화 치료.
단백 동화 자극 연골 ECM 회전율을 조절 하는 방법을 조사 하기 위해, 성장 인자-1 같은 인슐린 (IGF-1) 3 소 전체 깊이 이식에 매주 적용 되었다. 연골 박종에 IGF-1의 효과 주로 유형 II 콜라겐 형성의 측정에 관찰 되었다, ProC2에 의해 평가, 근육 자극에 대 한 예상 대로(그림 5). 이 모델의 Day 0은 항상 샘플 추출에 대한 반응으로 높은 ProC2 측정값을 보여줍니다. 이러한 높은 수준 감소 실질적으로 하 고 일에서 밖으로 수준 7-21. IGF-1로 치료 하는 경우, ProC2 수준 w/o 그룹에서 관찰 보다 감소, IGF-1 에서 유형 II 콜라겐 형성을 자극 하는 것을 나타내는 7(그림 5B). ProC2 그래프는 또한 소의 생물학적 변이를 보여줍니다. 2마리의 소로부터의 이출은 그룹당 소 당 6개의 이전을 이용한 실험에 사용되었다. 첫 번째 암소는 두꺼운 연골을 했고 더 큰 이식을 생성, 기준선에서 더 높은 ProC2 수준의 결과, 두 번째 암소는 얇은 연골과 함께 작은 반면, 기준선에서 낮은 ProC2 수준 결과. w/o에 대 한, IGF-1, 그리고 O +T 그룹, 묘사 된 ProC2 수준 두 암소에서 이식의 평균을 나타냅니다., 하지만 GM6001 얇은 이전 두 번째 소에서 만 측정 되었다. 따라서, GM6001 그룹은 0일째에 낮은 ProC2 레벨로 시작했는데, 이는 곡선 아래의 ProC2 영역에서 분명하게 드러난다(그림5C). ProC2 값의 정규화를 0일 수준으로 의한 생물학적 차이를 고려하여, 치료의 효과를 나타내고있다(도 5B,D).
사프라닌 O 및 빠른 녹색 조직학적 염색은 실험 전반에 걸쳐 이식의 프로테오글리칸 함량 및 연골 구조를 시각화하기 위해 수행되었다(도6). 일 0, 7, 14, 및 21, w/o에서 이루, IGF-1, 및 O+T 그룹은 조직학적 염색을 위해 고정되었다(그림 6). w/o 및 IGF-1 그룹은 실험 전반에 걸쳐 0일 동안 유사한 사프란노 어 스테인링 강도를 가지는 것으로 나타났으며, 이는 두 그룹 중 어느 것도 AGNx1 방출을 증가시켰다는 것을 보여주는 바이오마커 결과와 상관관계가있다(그림 4). O+T를 가진 처리는 7일째에 상당한 proteoglycan 내용 손실 및 21일째에 완전한 손실을 초래했습니다. 또한, 빠른 녹색 염색 강도는 14-21 일에서 감소, C2M 결과와 정렬콜라겐 손실을 나타내는.
그림 1: 소 연골 방법의 개략적 개요.
1일째에, 소 대퇴부 는 뒷경골 관절로부터 분리되었다. 전체 깊이 연골 박자는 메스와 생검 펀처와 condyles에서 발표되었다. 추출된 이식액을 세척하고 멸균 된 96 웰 배양 판으로 옮겼습니다. 0일째, 3일, 5일, 7일, 10일, 12, 14, 17, 19 및 21에, 상급체는 배양 플레이트로부터 수확하고, 저장 플레이트로 옮겨지고, 중간 변화 1단계에 도시된 바와 같이 -20°C에서 유지하였다. 저장된 상복부는 나중에 특정 ELISA 검정에 의한 조직 회전율 바이오마커의 측정을 위해 해동되었다. 배지 변화 2단계에서, 상수체를 제거한 후, 상수 처리 또는 대조군 이식에 대한 처리를 포함하지 않는 새로운 배양 배지가 적용되었다. 0일째, 7일, 14일 및 21일째에, 이파는 상월체를 수확한 후 3시간 동안 10% resazurin 용액으로 배양하였다. 10% 레자주린 상월체를 검정 96웰 플레이트로 옮겨 색도 반응을 측정하였다. 배양 웰은 배지 변화 2단계에 나타낸 바와 같이 치료 유무에 관계없이 새로운 배양 배지를 이식하기 전에 3회 세척하였다. 21 일째, 상류및 resazurin 측정의 수확 후, 이파는 포름알데히드와 인큐베이션에 의해 고정되었다 2 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레자주린에 의해 측정된 대사 활성.
소 전체 깊이 연골 박식물은 3 주 동안 격리및 배양되었다. 배양 배지는 새로운 치료법을 주 3회 첨가하여 변경하였다(n=2마리의 소로부터 12개의 이내). 치료는 IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O+T) [10/20 ng/mL], 그리고 O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]으로 구성되었다. 치료없이 대조군 (w / o) 포함되었다. w/o에 대 한, IGF-1, 그리고 O+T 그룹, 평균의 평균 및 표준 오차 (SEM) 의 12 에서 복제 2 암소 (6 암소 당 복제) 표시 됩니다. GM6001 그룹의 경우 1마리의 소에서 6개의 복제물의 평균 및 SEM이 표시됩니다. (A)레자주린에 의해 측정된 대사 활성. (B)(A)에도시된 대사 활성 그래프에 대해 0-21일 동안 곡선(AUC) 아래의 영역. p > 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: C2M에 의해 측정된 타입 II 콜라겐 분해.
소 전체 깊이 연골 박식물은 3 주 동안 격리및 배양되었다. 배양 배지는 일주일에 3회 새로운 치료법을 첨가하여 변경하였다. 치료는 IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O+T) [10/20 ng/mL], 그리고 O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]으로 구성되었다. 치료없이 대조군 (w / o) 포함되었다. w/o에 대 한, IGF-1, 그리고 O+T 그룹, 평균 및 SEM12 에서 복제 2 암소 (6 암소 당 복제) 표시 됩니다. GM6001 그룹의 경우 1마리의 소에서 6개의 복제물의 평균 및 SEM이 표시됩니다. (A)C2M 측정. w/o의 통계적 유의 수준은 Sidak의 다중 비교 시험을 갖는 반복 측정(RM) 양방향 ANOVA에 의해 계산되었다. (B)A에표시된 C2M 그래프에 대해 0-21일 동안 AUC를 표시합니다. 통계적 유의는 던의 다중 비교 시험을 가진 Kruskal-Wallis 시험에 의해 계산되었습니다. p > 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: AGNx1에 의해 측정된 아그레칸 분해.
소 전체 깊이 연골 박식물은 3 주 동안 격리및 배양되었다. 배양 배지는 일주일에 3회 새로운 치료법을 첨가하여 변경하였다. 치료는 IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O+T) [10/20 ng/mL], 그리고 O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]으로 구성되었다. 치료없이 대조군 (w / o) 포함되었다. w/o에 대 한, IGF-1, 그리고 O+T 그룹, 평균 및 SEM12 에서 복제 2 암소 (6 암소 당 복제) 표시 됩니다. GM6001 그룹의 경우 1마리의 소에서 6개의 복제물의 평균 및 SEM이 표시됩니다. (A)AGNx1 측정. w/o의 통계적 유의 수준은 Sidak의 다중 비교 시험을 갖는 RM 양방향 ANOVA에 의해 계산되었다. (B)AUC를 0-21일 동안 AGNx1그래프(A)에도시하였다. 통계적 유의는 던의 다중 비교 시험을 가진 Kruskal-Wallis 시험에 의해 계산되었습니다. **p > 0.01, ***p > 0.001, ****p > 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ProC2에 의해 측정된 타입 II 콜라겐 형성.
소 전체 깊이 연골 박식물은 3 주 동안 격리및 배양되었다. 배양 배지는 일주일에 3회 새로운 치료법을 첨가하여 변경하였다. 치료는 IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O+T) [10/20 ng/mL], 그리고 O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]으로 구성되었다. 치료없이 대조군 (w / o) 포함되었다. w/o에 대 한, IGF-1, 그리고 O+T 그룹, 평균 및 SEM12 에서 복제 2 암소 (6 암소 당 복제) 표시 됩니다. GM6001 그룹의 경우, 6의 평균 및 SEM은 1 암소에서 복제됩니다. (A)0-21 일에서 ProC2 측정. (B)ProC2 값은 각 개별 이식에 대해 0일 측정으로 정규화됩니다. ProC2 결과는 종종 0일째에 높은 바이오마커 수준으로 위장할 수 있는 치료 효과를 밝히기 위해 0일째 정규화의 이점을 누릴 수 있습니다. A 및 B에서,통계적 유의 수준은 Sidak의 다중 비교 시험을 갖는 RM 양방향 ANOVA에 의해 계산되었다. (C)A)에표시된 ProC2 그래프의 경우 0-21일 동안 AUC를 표시합니다. (D)AUC 일 0-21 일 동안 0 정규화 된 ProC2 그래프(B)에도시된. C와 D에서,통계적 유의는 던의 다중 비교 시험을 가진 Kruskal-Wallis 시험에 의해 계산되었습니다. **p > 0.01, ***p > 0.001, ****p > 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 사프라닌 O/빠른 녹색 염색에 의한 프로테오글리칸 콘텐츠의 조직학적 시각화.
소 전체 깊이 연골 박식물은 3 주 동안 격리및 배양되었다. 배양 배지는 일주일에 3회 새로운 치료법을 첨가하여 변경하였다. 치료는 IGF-1 [100 ng/mL] 및 OSM + TNFα (O+T) [10/20 ng/mL]로 구성. 치료없이 대조군 (w / o) 포함되었다. 0일, 7일, 14일, 21일에는 파라핀을 박살내고, 파라핀에 넣고, 얇게 썰고, 커버 슬라이드에 놓고, 헤마톡실린, 사프라닌 O, 패스트 그린으로 염색했습니다. 각 처리 군 및 각 타임포인트에 대해, 대표적인 이식이 도시된다. 기준선 샘플(일 0)에 표시된 축척줄은 200 μm를 나타냅니다.
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Discussion
소 연골 이식에서 연골 조직 회전율의 프로파일링을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 염증성 세포 내 경로의 억제제, 억제제를 포함하여 많은 유형의 약물의 치료 효과를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로테올리산 효소, 또는 단백 동화 성장 인자.
두 개의 다른 설정이 프로토콜에 설명 되었다: 이식 인슐린 같은 성장 인자로 자극 했다 단백 동화 설정 1 (IGF-1), 그리고 TNF 알파와 Oncostatin M 자극을 포함 하는 이화 설정, 조직 회전율 수 있는 광범위한 MMP 억제제사용으로 억제. 이 방법의 주요 출력은 배양 기간 동안 수확되는 컨디셔닝 된 배지에서 직접 네오 에피토프 바이오 마커의 정량화입니다. 몇몇 바이오마커는 상온상에서 측정될 수 있어 동일한 샘플에서 다른 이화 및 단백 동화 공정을 동시에 프로파일링할 수 있습니다. 사프라닌 O/Fast Green을 사용한 조직학적 염색은 바이오마커 분석에서 발견을 검증하는 데 사용되었다. 온코스타틴 M, TNF-알파, 및 IGF-1은 프로토콜을 설명하기 위해 사용되었고; 그러나, 상기 방법은 특정 사이토카인 자극기에 한정되지 않으며 이들은 가설 또는 시험 치료에 따라 다른 사람들을 위해 용이하게 교환될 수 있다.
바이오 마커 출력의 해석은 시간이 지남에 따라 근육 또는 이화 자극을 가진 연골 세포 기능 및 발현 프로필의 동적 변화로 인한 시간적 운동입니다. 치료되지 않은 이식에서, 바이오마커 ProC2에 의해 측정된 타입 II 콜라겐 형성은 처음 7-10일 이내에 급격히 감소한다. IGF-1 또는 유사한 성장 인자를 가진 자극은 기준선에 필적하는 수준에서 조건화 된 매체에 ProC2 방출을 유지; 따라서, 감소는 더 점진적이며, 방출은 처리되지 않은 이식에 비해 증가한다. 이화 작용 설정에서, 프로-염증성 사이토카인은 0-14일 동안 연골세포에 의한 프로테아제의 증가된 발현을 유도한다; 이것은 주로 침략으로 구성됩니다. 이것은 AGNx1를 포함하여 aggrecanase 파생된 단백질 단편에 있는 처음 큰 증가를 일으키는 원인이 됩니다. 문화의 후기 단계에서, 연골세포는 더 많은 MmPs를 표현합니다, 이는 C2M과 같은 MMP 생성 마커의 방출을 구동, 일 의 주위에 14 이후. 따라서, 치료의 효과를 프로파일링하기 위해서는 적절한 시간 간격으로 바이오마커를 측정하는 것이 중요하다.
설명된 바와 같이, O+T 칵테일과 같은 염증성 사이토카인을 가진 처리는 시간이 지남에 따라 연골 조직 저하를 일으키는 원인이 될 것입니다. ECM의 총 풀은 이식 크기에 의해 제한되며 바이오마커 프로파일을 분석할 때 고려해야 한다. 따라서, 바이오마커 방출의 초기 증가 후, 단순히 ECM 을 이식하는 나머지 양의 감소로 인해 시간이 지남에 따라 수치가 감소할 수 있다.
이전에, OA는 주로 관절 연골의 질병으로 간주되었다. 그러나, 최근 연구는 OA가 개별 합동 구획, synovium, 뼈 및 연골에 있는 초기 질병 관련 변경이 병렬로 생기고, 합동 실패귀착되는 전체 합동의 질병으로 전망되어야 한다는 것을 건의합니다12 ,21. 따라서이 모델 시스템에서 연골이 관절의 나머지 부분 (및 유기체)에서 분리되어 조직의 항상성을 조절 할 수있는 조직 상호 작용 효과 및 전신 인자의 영향을 제한한다는 것을 인식하는 것이 중요합니다. 대신, 생화학 기술, 바이오마커 또는 조직학적 시각화를 사용하여 조직에 대한 병리학적 또는 개입적 변화를 검출하기 위해 실험적으로 조절된 조건을 조절할 수 있는 단순화된 단일 조직 배양이다. 연골의 구조로 인해, 세포 수의 변화, 매트릭스 조성물, 및 양 변화는 이식과 조직 소스 사이의 둘 다 예상된다. 바이오마커 출력의 상대적 크기는 실험 간에 다를 수 있으므로 더 나은 비교를 위해 데이터 세트를 정규화하는 것이 좋습니다.
최소한의 변화와 최상의 결과를 보장하기 위해, 가능한 한 신선한 무릎에서 연골을 사용하는 것이 중요합니다, 바람직하게는 사이 1 과 24 도축 후 시간. 연골 조직의 격리는 이식이 대략 동일한 두께인 균일 한 방법으로 수행해야합니다. 전지는 두꺼운 연골의 영역에서 격리되어야한다, 중간에 가장 가까운 영역을 피. 조직은 세포 사멸과 매트릭스 분해를 피하기 위해 항상 촉촉해야 한다. 실험3의길이는, 배지 변화 사이의 시간, 사이토카인 자극의 타이밍, 및 치료 간격은 개별 화합물 또는 메커니즘의 가설 된 작용 모드에 맞게 조정할 수 있다.
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Disclosures
CST, ACBJ, MK는 북유럽 생명과학의 직원입니다. ACBJ와 MK는 북유럽 생명과학의 지분을 보유하고 있습니다. 나머지 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 실험실 지원을 위한 북유럽 생명과학의 기술 직원, 그리고 우리의 연구의 일반적인 지원을 위한 덴마크 연구 재단에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
