Summary
Her beskriver vi en hydroponic plantevekst analysen å kvantifisere arter tilstedeværelse og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter deres overføring til ulike vekst miljøer.
Abstract
Bakterier danner komplekse rhizosphere microbiomes formet av samspill mikrober, større organismer, og abiotiske miljøet. Under laboratorieforhold, rhizosphere kolonisering av plantevekst-fremme bakterier (PGPB) kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg i forhold til uncolonized planter. Men i feltet innstillinger, bakteriell behandlinger med PGPB ofte ikke gir betydelige fordeler til avlinger. En forklaring er at dette kan skyldes tap av PGPB under interaksjoner med endogene Jord mikrober over levetiden til anlegget. Denne muligheten har vært vanskelig å bekrefte, siden de fleste studier fokus på den første kolonisering snarere enn vedlikehold av PGPB innen rhizosphere samfunn. Det er hypotetisk gjennomsnitt her at forsamlingen, sameksistens, og vedlikehold av bakterielle samfunn er formet av deterministisk funksjoner i rhizosphere mikromiljøet, og at disse interaksjoner kan påvirke PGPB overlevelse i native Settings. Å studere disse atferd, en hydroponic plante-vekst analysen er optimalisert ved hjelp Arabidopsis thaliana å kvantifisere og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter overføring til annen vekst Miljøer. Dette systemets reproduserbarhet og nytte blir deretter validert med godt studert PGPB Pseudomonas simiae. For å undersøke hvordan tilstedeværelsen av flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedlikehold dynamikk på anlegget roten, en modell samfunn fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og Microbacterium arter) som opprinnelig ble isolert fra A. thaliana rhizosphere er konstruert. Det er vist at tilstedeværelsen av disse ulike bakterielle arter kan måles ved hjelp av denne hydroponic plante-vedlikehold analysen, som gir et alternativ til sekvensering-baserte bakterielle samfunnet studier. Fremtidige studier ved hjelp av dette systemet kan forbedre forståelsen av bakteriell atferd i multispecies anlegget microbiomes over tid og i skiftende miljøforhold.
Introduction
Crop ødeleggelse av bakterielle og Fungal sykdommer resulterer i senket matproduksjon og kan sterkt forstyrre global stabilitet1. Basert på oppdagelsen av at mikrober i undertrykkende jordsmonn er ansvarlig for å øke plante helse2, har forskere spurt om anlegget mikrobiomet kan utnyttes til å støtte plantevekst ved å endre tilstedeværelsen og overflod av spesielle bakteriearter3. Bakterier funnet å hjelpe i plantevekst eller utvikling er kollektivt betegnet plantevekst-fremme bakterier (PGPB). Flere nylig har studier forskjøvet fra bare identifisere potensielle PGPB å forstå hvordan interkingdom interaksjoner i jorda, rundt røtter, eller i rhizosphere (området direkte rundt og med roten overflaten) kan påvirke PGPB aktivitet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg som svar på ulike stressfaktorer i forhold til uncolonized planter5. Men resultatene er ofte mer variabel i native jord forhold sammenlignet med de som er observert i de nøye kontrollerte drivhus og laboratorie innstillinger6. En hypotese for denne forskjellen er at veksten eller atferden til PGPB kan være hemmet av innfødte jord bakterier eller sopp i feltene7,8. Gunstige effekter av rhizosphere bakterier generelt avhenge av evnen til bakterier til 1) finne og bevege seg mot roten, 2) kolonisere roten gjennom biofilm formasjon, og 3) samhandle med verten plante eller patogener via produksjon av små molekyl metabolitter7,9. Noen av disse kolonisering atferd kan påvirkes av tilstedeværelsen og aktiviteten til nærliggende mikrober10.
Vi utviklet et system for å kvantifisere og visualisere disse distinkte bakteriell kolonisering stadier av rhizosphere (figur 1). Denne tilnærmingen vil lette studier undersøker hvorfor langsiktige PGPB vedlikehold er noen ganger ikke observert etter overføring av planter i nye miljøer, for eksempel under planting av pre-inokulert frøplanter. Arabidopsis thaliana AS ble valgt som en plante modell på grunn av sin omfattende bruk i laboratoriestudier, samt rikelig data tilgjengelig om sin mikrobielle interaksjoner11. Det er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vekst, 2) bakteriell kolonisering og 3) bakteriell vedlikehold (se figur 1). Fordi A. thaliana er en bakkenett plante, var det viktig å sikre at det ikke var lider unødig vann stress i hydroponic system12. Inspirert av metodene som brukes av Haney et al.13, er frøplanter dyrket på plast Mesh for å skille skyte fra væsken vekstmedium. Dette systemet ser ikke ut til å kompromittere helsen og utviklingen av anlegget vert, og det forbedrer A. thaliana vekst i flytende11. Som anlegget skyter flyter over overflaten, røttene er fullt eksponert for kolonisering av bakterier inokulert inn i væsken bakteriell vekstmedium. Dette tillater bakterier av interesse å bli undersøkt for kolonisering i næringsstoffer som er mest bidrar til vekst, samtidig som skiftende forhold slik at anlegget til å fortsette å vokse i et nærings medium utviklet for å støtte sin vekst. Begge stadier inkluderer jevn risting for å hindre Anoxia av roten13. Bakterier kan visualisere eller kvantifisert fra planterøttene etter overføring fra enten kolonisering medium eller vedlikehold medium. Dette hydroponic systemet er svært fleksibelt, slik at eksperimentelle forhold og anvendt påkjenninger for å være lett endres avhengig av interessene til forskerne.
Denne beskrevne metoden er viktig i sammenheng med den større kroppen av litteratur om plante-mikrobe interaksjoner fordi det gir et robust system for å studere disse interaksjoner på roten overflaten samtidig som tilpasses til vekst preferanser av forskjellige bakterier. Plant biologi laboratorier ofte utføre plante-mikrobe kolonisering eksperimenter på solid agar, slik at for bare Planar bevegelse (hvis det) av bakterier samtidig krever potensielt ødeleggende manipulering av planter under påfølgende overføring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofte prioritert helsen til bakteriene i sine eksperimenter, til skade for plantene14,15. Disse ulike prioriteringer av plante-og mikrobiologi-fokuserte laboratorier har historisk gjort det vanskelig å sammenligne resultatene mellom disse gruppene, siden hver typisk optimaliserer eksperimentelle forhold for å optimalisere sin organisme av interesse15. Den flytende-mesh-plante-vekst system beskrevet her hindrer full plante nedsenking, en betydelig fordel for tidligere mikrobiologi-orienterte studier, samtidig som midlertidig optimalisere vekst og overlevelse av bakterier for å lette kolonisering. Dermed analysen vi presenterer her kan adressen bekymringer fra både plante biologer (om over-hydration og taktil manipulasjon av anlegget), mens tilfredsstiller kriteriene for mikrobiologer (som tillater ulike bakterielle vekstforhold og flere Arts interaksjoner)7. Denne protokollen er utformet for å kunne tilpasses for bruk med ulike bakterier, planter og miljøforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: det eksperimentelle oppsettet er beskrevet for klarhet og brukes til å generere representative resultater inkludert i denne rapporten, men forholdene kan endres etter ønske. Alle trinn bør utføres ved hjelp av PPE og følgende institusjonelle og føderale varmeste for sikkerhet, i henhold til BSL status for bakteriene som brukes.
1. karakterisering av bakterier
- Bestem morfologi av bakterier på veksten medium agar plate. Resuspend celler på en omtrentlig OD600 = 0,5 og plate en 1 μL volum på agar medium for valg. Legg til X-gal til agar plater til en endelig konsentrasjon på 20 mg/mL for å bedre differensiere individuelle medlemmer av den spesifikke bakterielle samfunnet. Vokse ved 24 ° c eller 30 ° c til koloniene form, deretter ta bilder av og notater på koloni morfologi.
- Definer sammenhengen mellom hver bakterie belastnings optiske tetthet og antall CFU (koloni forming senheter) per mL16. Resuspend bakterier i 1 mL vann i en 24-brønn plate til en omtrentlig OD600 = 5, utføre to-fold seriell fortynninger, overvåke OD600 av alle fortynninger, og plate hver for å bestemme levedyktig CFU/ml i hver prøve på flere optiske tettheten.
- Bestem maksimal sonikering toleranse for hver bakterie belastning. For å gjøre dette, alikvot celler i en 24-brønn plate som inneholder flytende medium, reservere noen celler som en unsonicated kontroll prøve. Ved hjelp av en ultralyd med en 24-tip horn vedlegg, Påfør tre runder av 12 s av sonikering på 40 amp med 2 s pulser.
Merk: bruk av en 24-brønn ultralyd anbefales for å lette nedstrøms multipleksing av prosessanlegget prøver, men hvis man ikke er tilgjengelig, bruke en ultralyd utstyrt med en mikrotip og utføre hver prøve sonikering uavhengig. Bruk alltid øreklokker som er vurdert til minst 25 NRR-beskyttelse. - Utfør 10-fold seriell fortynninger av sonikert og unsonicated prøver og flekk på agar plater. Bestem om det er en reduksjon i levedyktige celler etter sonikering. Hvis det er tilfelle, bruk en ny prøve og gjenta sonikering trinn ved hjelp av en redusert total sonikering tid eller amplitude til behandlingen har ingen effekt på endelige CFU/mL17.
2. utarbeidelse av Arabidopsis thaliana frøplanter på en plast Mesh
- Lag disker av plast Mesh ved hjelp av en standard hull puncher.
- Samle diskene i en glassbeholder med et løst deksel av aluminiumsfolie, og sterilisere ved hjelp av en autoklav satt til en 20 min tørr syklus13.
- Ved hjelp av flamme sterilisert pinsett, distribuere ca 40 sterilisert mesh disker i et enkelt lag over overflaten av en plante-vekst-medium agar plate. Bruk 0,5 x Murashige og Skoog (MS) salter, inneholdende 500 mg/L av MES buffer [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid] og 1,5% Bacto agar, som plantevekst medium, med 50 μg/mL benomyl lagt til grensen fungal forurensning av frøplanter.
- Forbered axenic frø av A. thaliana som tidligere beskrevet17.
- Plasser ca. 100 – 300 frø hver i individuelle sentrifugerør i et rack og plasser dem i et resealable glass eller en tung plastbeholder ("krukke") i en avtrekks hette.
- Ved hjelp av forsiktighet, plassere et beger med 100 mL blekemiddel i glasset, tilsett 3 mL konsentrert HCl til blekemiddel, og umiddelbart forsegle glasset og la røyken å sterilisere frø i minst 4 t.
- Forsiktig fjerne rørene av sterilisert frø fra undersiden av glasset og forsegle.
- Plasser to frø i midten av hver mesh. Tetnings plater med kirurgisk tape og ruge for 2 – 6 dager ved 4 ° c i mørket for å vernalize frø.
- Å spire og dyrke frøplanter, plasserer platen agar side ned i en plantevekst kammer for 8-10 dager under korte dag innstillinger: 9 h av lys ved 21 ° c og 15 h av mørkt ved 18 ° c (figur 1, trinn 2).
3. kolonisering av planter i flytende bakterievekst medium
- Tilsett 1 mL bakterievekst medium til hver brønn av en steril 24-brønn plate, med unntak for medie bare kontroll brønner. Bruk Lennox Luria buljong (10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl) som bakteriell vekstmedium.
- Overfør spirer frøplanter innebygd i mesh fra agar plater til væsken (figur 1, trinn 3a).
- Forsiktig skrelle mesh inneholder to spirer frøplanter opp og av agar plate ved hjelp av flamme sterilisert tang. Velg mesh med like store og uskadet frøplanter.
- Hvis fjerning fra agar er ikke glatt, forkaste det mesh og plante. Overfør en dupp til hver brønn av bakteriell vekst væske, root side ned.
- Vaksinere bakterier i brønner som inneholder flytende frøplanter.
- Resuspend bakterier dyrket over natten på agar plater til en OD600 tilsvarende 108 CFU/ml i bakteriell vekstmedium væske. Tilsett 10 μL av bakteriell suspensjon til hver brønn for en endelig konsentrasjon på 106 CFU bakterier per brønn.
- Hvis du forbereder en blanding av bakterier, resuspend hver til OD600 tilsvarer 108 CFU/ml, bland i like proporsjoner, og tilsett 10 μL av den endelige blandingen per brønn av væske.
- Forsegle platen for steril vekst. Uten å berøre den klebrige siden, trykk forsiktig på gass gjennomtrengelig film over platen. Sørg for at hver brønn har blitt individuelt forseglet ved å påføre trykk rundt hver av ringene som er gjort av brønnene. Skift ut plate snuggly plastlokk over platen og gass gjennomtrengelig film (figur 1, trinn 3b).
- Ruge platene for 18 t i en plantevekst kammer, under samme vilkår som frøplanter var opprinnelig spirer, bortsett fra på en orbital plate shaker satt til 220 RPM.
4. vedlikehold av bakteriell kolonisering
- Å skylle alle flyter (planter på mesh), tilsett 1 mL sterilt vann til brønner av en ny 24-brønn plate. Fjern den gass gjennomtrengelig filmen. Ved hjelp av steril tang, overføre flyter til brønner med vann (figur 1, trinn 4a). Skyll ved å hvile i 10 min ved romtemperatur (RT) uten omrøring.
Merk: for å bestemme bakteriell kolonisering effektiviteten av røtter i stedet for deres evne til å opprettholde kolonisering over tid, kan plantene bli ofret på dette trinnet ved å ta dem direkte til trinn 5,1. - Fyll brønnene på en ny 24-brønn plate med 1 mL plantevekst medium. Overfør ett nett til hver brønn. Dekk med en gass gjennomtrengelig forsegling og ruge for 72 h på orbital plate shaker ved 220 RPM i plantevekst kammer (figur 1, trinn 4b).
- Gjenta skylling som utført i trinn 4,1 med flyter etter den 72 h inkubasjonsperioden.
5. innsamling av bakterier for levedyktige celle tellinger
Merk: antall bakterier per frøplante rot kan fastslås ved enhver inkubasjons timepoint. Kolonisering kan overvåkes mellom 0 h og 18 timer, mens vedlikehold kan overvåkes fra 18 h og framover. Planter ment for Imaging kan gå direkte til § 6.
- Fjern frøplanter fra mesh (figur 1, trinn 5). Forsiktig sted flamme sterilisert tang under bladene (men på bladet siden av mesh), og lett klemme stammen. Vri frøplanter opp og bort fra mesh for å løsne roten uten å bryte den. Hvis roten bryter, forsiktig skrape mesh bunnen for å samle hele lengden.
- Fjern bakterier fra planterøtter. Overfør bakteriene til brønner av en 24-brønn plate som inneholder 1 mL ddH20. Sonikere prøvene som beskrevet i trinn 1,3.
Merk: Bruk et mikroskop og se etter eventuelle gjenværende bakterier på rot flaten på en sonikert prøve. Hvis bakterier gjenstår, øke den totale sonikering tid eller intensitet til ingen bakterier forblir bundet, opp til det høyeste nivået av sonikering som ikke påvirker levedyktige celle tellinger som bestemmes i del 1. - Kvantifisere bakteriene på røttene.
- Utfør seriell 10-fold fortynninger av sonikert prøvene opp til en 10-6 fortynning i bakteriell vekstmedium. Tilsett 50 μL av hver fortynning til individuelle agar plater og spres med sterile glassperler (eller bakteriell spre). Ruge plater ved optimal temperatur for bakterier til enkelte kolonier er countable.
- Når identifiserbar, telle antall hver koloni morfologi (som bestemmes i del 1), og beregne CFU av hver bakteriell Art per frøplante. Kast noen prøver som viser forurensning, som forurensning under kolonisering eller vedlikehold kan påvirke bakteriell tilstedeværelse.
6. samling av intakt planterøtter for mikroskopi
- Bruke tang, fjerne frøplanter fra mesh som i § 5.
- Overfør hver plante til objektglass.
- Plasser spissen av roten på lysbildet og dra bort fra tuppen for å sette skyte ned flush med raset, noe som sikrer en rettet rot for best tenkelig. Legg en dråpe vann eller steril plantevekst medium til prøvene å hydrere grensesnitt mellom coverslips og lysbilder.
- Plasser et glass dekkglass like over roten kronen (øverste eske regionen i figur 1) og under skyte bladene for å unngå skrå av dekkglass (for å tillate root Crown Imaging), og trykk ned forsiktig17.
- Hvis du bruker fluorescerende bakterier, bilde ved hjelp av egnede eksitasjon/utslipps filtre for å skille bakterier fra hverandre og anlegget roten18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den godt preget PGPB P. simiae WCS417r er kjent for å kolonisere røttene av A. thaliana i hydroponic kultur. Dette naturlig fluorescerende bakterien kan lett bli visualisere ved hjelp av mikroskopi på røttene av frøplanter etter kolonisering (figur 2). Selv om det er mulig å avbilde hele lengden av disse A. thaliana frøplanter ' (4-6 mm lengde) røtter, gjør det for mange planter ville ta en uoverkommelige tid. Fordi de fleste variasjon på tvers av tidspunkter og arter av bakterier kan fanges opp av Imaging kronen, midten, og spissen av roten14 (indikert av røde bokser i figur 1), disse regionene ble prioritert for Imaging stedet Imaging full root Lengder. I lyse felt bilder av P. simiae-kolonisert A. thaliana røtter (figur 2), er det mulig å visualisere omrisset av røttene og rot hårene; men ved 18 h av kolonisering, er det ikke mulig å skille klart kolonisert versus ikke-kolonisert røtter ved hjelp av lyse felt bilder. Mens P. simiae viser autofluorescence, brukte vi en belastning som også var konstruert for å uttrykke et gult fluorescerende PROTEIN (YFP)19 med eksitasjon/utslipps bølgelengder på 490-510/520-550 NM18. En forstørrelse på 100% var tilstrekkelig til å identifisere individuelle og små aggregater av P. simiae celler på A. thaliana røtter. Som vist i figur 2, laboratorier med tilgang til enten høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskop eller rimeligere stasjonære mikroskop kan både visualisere tilstedeværelsen og fordelingen av bakterier langs roten.
Mens informative i form av romlig distribusjon, mikroskopi bilder er ikke godt egnet for kvantifisering av bakterielle celler. Vi dermed samlet bakterier fra overflaten av røtter ved hjelp av ultralyd som tidligere beskrevet og validert9,20. Tre runder av 12 s av ultralydbehandling21 på en amplitude av 40 var tilstrekkelig til å forstyrre den ytre overflaten av roten frøplanter (supplerende figur 1) og fjerne alle bakterier mens ikke påvirker bakteriell levedyktighet. Sonikering ble brukt i stedet for perle-juling metoder9 for å bedre fremme spredning av bakterielle aggregater/biofilm. Kvantifisere CFU/root etter 18 h av kolonisering og ytterligere 72 h av vedlikehold viste at P. simiae både overvekst og opprettholdes på røttene av A. thaliana i vår hydroponic, flytende frøplante system (Figur 3). Antallet CFU/frøplante på enten timepoint viste god reproduserbarhet på tvers av biologiske replikerer utført på forskjellige dager (Figur 3). Variasjonen observert er vanlig blant rot kolonisering analyser22 og er sannsynligvis på grunn av mindre variasjoner av timing, miljømessige forhold, eller plante rot størrelse, selv blant frøplanter spirer på samme tid og valgt å være lik i størrelse. Vi observerer en økning i antall CFU/frøplante etter 72 h i vedlikeholds medium i forhold til tallene observert på post-kolonisering 18 h timepoint (Figur 3). Dette indikerer aktiv vekst av kolonisert bakterier på anlegget roten skjedde under vedlikehold scenen.
I tillegg til nytten av denne hydroponic analysen å kvantifisere individuelle bakteriell kolonisering og vedlikehold, er det også aktuelt å overvåke foreningen av flere arter på planterøtter. For å demonstrere dette, tre arter av bakterier isolert fra A. thaliana dyrket i naturlig jord under laboratorieforhold ble valgt20. De isolerer var stammer av Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, og Curtobacterium oceanosedimentum23. Denne forenklede samfunnet ble valgt på grunn av disse artene evne til å eksistere sammen i flytende bakteriell vekst Media i risting kultur (upubliserte data). I tillegg kan disse tre artene være klart differensiert på medier som inneholder X-gal på grunn av forskjeller i kolonien morfologi og farge (figur 4a). The X-gal påvirker ikke relativ vekst av noen av disse bakterielle arter (upubliserte data). Disse forskjellene i morfologi og koloni opptreden på X-gal tillot oss å telle CFU/frøplante av hver art uten antibiotika valg, selv i multi-arter coculture.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, og C. oceanosedimentum var alle kolonisert og opprettholdt på roten, enten alene eller i bakteriell coculture (figur 4b). Hver art viste trender som var lik på tvers av ulike biologiske og tekniske replikerer, selv innenfor blandede samfunn. Dette viser at analysen protokollen kan brukes til å måle både relative eller totale CFU/root av hver art. Interessant, når vokst alene, ingen individuelle arter viste en merkbar økning i overflod under vedlikehold scenen, men den samlede CFU/roten av det kombinerte samfunnet økte i cocultures, noe som indikerer at disse bakteriene ikke forbyr kolonisering av de andre stammene.
For alle eksperimenter, planter dyrket i flytende media uten tilsetning av bakterier som negative kontroller var alltid inkludert. Ingen bakterier var synlige på disse kontroll røttene under mikroskopi (figur 2), og heller ikke var noen bakterier oppdages via PLATING for CFU (upubliserte data). Dette indikerer at sterilisering av frø og bruke sterile teknikker i løpet av denne analysen var tilstrekkelig til å holde plantene axenic med mindre med hensikt kolonisert.
Figur 1: analysen for bakteriell kolonisering og vedlikehold på A. thaliana røtter. A. thaliana frøplanter dyrket på sterilisert plast Mesh ble overført til en vekstmedium optimalisert for bakterier [her, 0,1 x lb (Luria buljong) Lennox]. Bakterier deretter kolonisert roten over 18 timer mens anlegget fløt i risting væske. Etter en skylling, kolonisert flyte ble overført til et vekstmedium optimalisert for planter (0,5 x MS + MES) for 72 h for å teste for vedlikehold av bakterier på røttene. Den float ble deretter skylt, og anlegget med eventuelle tilknyttede mikrober ble fjernet for analyse (kvantifisering av CFU/frøplante eller Imaging av mikroskopi). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: visualisere P. simiae kolonisering av røtter med fluorescerende mikroskopi. P. simiae (False-farget grønn) kolonisert A. thaliana røtter og ble opprettholdt på roten følgende overføring til plante-vekstmedium. Root Crown (venstre), mid-lengde (midten), og TIP (høyre) ved 40x forstørrelse vises fra områder som er angitt i figur 1. De to øverste radene viser lyse felt og fluorescerende bilder av røtter kolonisert av P. simiae (avbildet av epifluorescent mikroskopi). De samme røttene ble også avbildet av en konfokalmikroskopi mikroskop (sentrum to rader). Den ingen-bakterier negativ kontroll i de to nederste radene viste ingen kolonisering. Skala bars representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvantifisering av P. simiae på A. thaliana røtter. Totalt antall P. simiae levedyktige celler utvinnes per A. thaliana frøplante følgende 18 h av kolonisering eller 72 h av vedlikehold. Tre individuelle biologiske replikerer er vist, hver med tre tekniske replikerer av to frøplanter per float. Tallene som vises er midlene fra de tekniske replikerer, mens barer representerer standard feil av midlene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisering av kolonisering og vedlikehold av en blandet bakteriell samfunnet på a. thaliana røtter. (A) kolonier av A. nicotinovorans, M. oleivorans, og C. oceanosedimentum kan skilles på X-gal-inneholdende agar medium av koloni morfologi og farge. (B) røtter av 10 dag gamle frøplanter ble inokulert med ca 3x105 CFU/ml av hver av de tre stammene. Vist er totalt CFU/frøplante utvinnes av hver art etter 18 h av kolonisering eller 72 h av vedlikehold når kolonisert enten alene eller i en tre-medlem bakteriell samfunnet. To biologiske replikeres, hver bestående av to tekniske replikerer av to frøplanter per float, vises. Tallene som vises er midlene fra de to tekniske replikerer, mens barer representerer standard feil av midlene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: ultralyd forstyrrer rot flaten. For å løsne bakterier fra overflaten av roten, var hele planter sonikert, og bakteriene ble sluppet inn i væsken, som ble serielt fortynnet og belagt for kvantifisering av CFU/frøplante. (A) en intakt frøplante er (B) strukturelt forstyrret etter ultralydbehandling. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planter i alle miljøer samhandle med tusener til millioner av forskjellige bakterier og sopp5,7. Disse interaksjoner kan enten negativt og positivt påvirke plante helse, med potensielle effekter på avling yield og matproduksjon. Nyere arbeid tyder også på at variabel kolonisering av avlinger av PGPBs kan gjøre rede for uforutsigbare plante størrelse og beskjære yield i feltet prøvelser22. Forstå mekanismene bak disse interaksjoner kan tillate oss å direkte manipulere plante-assosiert mikrobielle samfunn til hjelp i sunn plante utvikling, selv under stress24.
Fordi bakteriell kolonisering av røtter og deres vedlikehold i rhizosphere er avgjørende for plante-mikrobe interaksjoner9, ønsket vi å bygge et system for å reproduserbar visualisere og kvantifisere disse bakterielle atferd. Dette hydroponic, flytende frøplante vekst systemet muliggjør mikroskopisk bildebehandling og kvantifisering av bakterie populasjoner på røttene av A. thaliana.
Den beskrevne plante-mikrobe interaksjon analysen integrerer gunstige elementer av eksisterende eksperimentelle protokoller. Den flytende mesh metoden var basert på at fra Haney et al.13, som målte første kolonisering av P. simiae WCS417r på statisk, flytende A. thaliana frøplanter. I evalueringen av dette systemet, sterk kolonisering av A. thaliana røtter av P. simiae ble validert, selv om en annen vekstmedium fra Haney et al. ble benyttet og inkluderte orbital risting under kolonisering. Inkludering av orbital risting under både kolonisering og vedlikehold forenkler bakteriell samhandling som kanskje ikke forekommer i statisk kultur, samt redusere anoksisk forhold som kan hemme både bakteriell vekst og plante root helse13. Vi har også integrert aspekter av mikrobiologi-fokuserte protokoller designet for å støtte plante root kolonisering av ulike bakterielle arter8,15,25. Dette inkluderte en avgjørende overføring skritt ut av mediet optimalisert for bakteriell kolonisering og inn i et medium optimalisert for plantevekst. Denne overføringen til friskt medium vil også tillate at mekanismene underliggende bakteriell vedlikehold på røtter skal begynne å bli adressert, en tilnærming som kan gi innsikt i uberegnelig vedlikehold av PGPB i feltforsøk6.
Denne analysen ble optimalisert for rask behandling av flere prøver for å tillate miljømessige variabler og blandede bakterielle samfunn skal analyseres innen en multi-brønn biologisk gjenskape. Mens ultralydbehandling har tidligere vist å være tilstrekkelig for avbrudd og samling av rhizosphere bakterier, 24-brønn plate og multi-spiss horn vedlegg quickens sample behandling. Denne cellen levedyktighet beregning tilnærming til kvantifisere bakteriell tilstedeværelse kan suppleres med, eller utvides til å omfatte, qPCR eller MiSeq 16S rRNA genet samfunnet profilering å bestemme den relative overflod av mer mangfoldig samfunn av kolonisere bakterier 20. i tillegg, under Imaging, nytten av å fokusere på bare tre regioner av hver plante roten til hastigheten visualisering av bakteriell tilstedeværelse og lokalisering på røttene er uthevet. Den kolonisering av disse forskjellige rot områder har vist seg å variere blant bakterielle arter14. Imaging kan utføres med enten naturlig autofluorescent bakterier eller genetisk medgjørlig bakterier konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein.
Metodikken beskrevet her gir rask og reproduserbar evaluering av rot kolonisering av PGPB bakterier, men det er begrensninger på konklusjoner som kan trekkes fra disse eksperimentene. For eksempel, muligheten for bakterier å chemotax mot roten er kjent for å være viktig for mange bakterielle arter ' kolonisering av planterøtter, men denne prosessen kan ikke kreves i denne risting inoculation systemet. Når det er sagt, for studier spesielt interessert i chemotaxis, kan kolonisering trinnet utføres i statisk flytende kultur eller på overflaten av en myk agar medium, der bakterier kan være belagt fjernt fra anlegget, som krever dem til å aktivt bevege seg mot Roten. I tillegg ble en relativt rik vekstmedium under kolonisering brukt til å fremme bakteriell vekst og plante vedlegg; Imidlertid kan disse relativt høye nærings konsentrasjonene forby undersøkelse av bakteriell utnyttelse av eller konkurranse for plante-avledet karbon under kolonisering. Igjen, avhengig av vekst kravene til bakteriene blir studert, kolonisering medium kan varieres til best passer den spesielle forskningen spørsmål av spesifikke forskere.
Dette systemet ble designet for å være lett mottagelig for ulike bakterielle og plantevekst forhold og til tillegg av ulike miljømessige stressfaktorer og tidspunkter. Men metodene som er beskrevet her er best egnet for måling av bakterielle interaksjoner med røttene av A. thaliana frøplanter. Kolleksjonen er optimalisert for dette anlegget, og større eller mer følsomme planter kan være intractable i den flytende multi-brønn-plate system. Til slutt, mens bakterier av interesse som brukes her kolonisere anlegget roten i flytende kultur, for andre bakterier kan det være nødvendig å vaksinere planterøttene ved DIP-inoculation eller plating på en solid agar medium i stedet19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler levert av Department of Energy biologiske og miljømessige forskning (DOE-BER 0000217519 til E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 til E. A. S). SLH ble også støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Vi takker Dr. Jeffery Dangl for å gi bakterielle stammer og uvurderlig innsikt. Vi takker Dr. Andrew Klein og Matthew J. Powers for eksperimentelle forslag. Til slutt, SLH ønsker å takke tilkoblinger på sosiale medier for påminner oss om at formidling av vitenskap er et privilegium og et ansvar, spesielt gjennom kreative og tilgjengelige midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
