Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, Drosophila melanogaster, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

Ce protocole décrit un essai de phagocytose in vivo chez l’adulte Drosophila melanogaster pour quantifier la reconnaissance phagocyte et apurement des infections microbiennes.

Abstract

Chez tous les animaux, l’immunité innée fournit une défense immédiate et robuste contre un large spectre d’agents pathogènes. Réponse immunitaire humorale et cellulaire sont les branches principales de l’immunité innée, et bon nombre des facteurs régulant ces réponses sont conservées évolutionnaires entre les invertébrés et mammifères. La phagocytose, l’élément central de l’immunité innée cellulaire, est effectuée par des cellules de sang spécialisées du système immunitaire. La drosophile, Drosophila melanogaster, est devenue un puissant modèle génétique pour étudier les mécanismes moléculaires et les effets physiologiques de la phagocytose dans animaux entiers. Nous démontrons une analyse axée sur l’injection de phagocytose in vivo afin de quantifier l’absorption de particules et de la destruction de cellules de sang de drosophile , hemocytes. La procédure permet aux chercheurs de contrôler avec précision la concentration des particules et la dose, ce qui permet d’obtenir des résultats très reproductibles dans un court laps de temps. L’expérience est quantitative, facile à exécuter et pourront être utilisés pour dépister les facteurs de l’hôte cette influence pathogène reconnaissance, absorption et dégagement.

Introduction

Défenses immunitaires innées constituent la première ligne de défense contre les microbes pathogènes. Ces réponses se divisent sur le plan fonctionnel en immunité innée humorale et cellulaire, qui sont médiés par les récepteurs de reconnaissance de modèle codé en lignée germinale (SDRP) qui détectent les profils moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs)1. Bon nombre des voies de signalisation et les mécanismes effecteurs de l’immunité innée sont conservés chez les mammifères et les invertébrés, tels que le nématode, Caenorhabditis elegans et la drosophile, Drosophila melanogaster,2. La mouche des fruits est devenue un système puissant pour étudier la défense de l’hôte contre les microorganismes infectieux3. Drosophile est génétiquement tractable, facilement et à moindre coût élevés dans les laboratoires et a un temps de génération court. Par ailleurs, la mouche à fruit présente des défenses très efficaces contre un tableau de microbes, ce qui permet l’examen de l’immunité contre les agents pathogènes virales, bactériennes, fongiques ou parasitaires hôte.

Drosophila immunologistes ont historiquement utilisé avant écrans génétiques, génome-large-mediated RNA interférence (Arni) sélection de lignées cellulaires insectes et préexistant des souches mutantes de mouche afin d’examiner l’immunité innée – menant à la identification et caractérisation de plusieurs voies immunitaires humorales évolutivement conservés4,5,6,7,8. La réponse immunitaire innée humorale est, sans doute, le mieux caractérisé des défenses immunitaires chez la drosophile. Suite à une infection, la réponse humorale aboutit à la production et la libération systémique de peptide antimicrobien des molécules (AMP) dans l’hémolymphe, le sang équivalent chez les insectes. Ampères sont produites par hautement conservée sans frais et de l’Imd, voies de signalisation. La voie de péage est homologue aux mammifères récepteurs TLR/IL-1R de signalisation, et la voie de l’IDM est homologue au facteur de nécrose tumorale-alpha chez les mammifères de signalisation. Drosophila, péage signalisation est induite par des bactéries gram-positives, les champignons et X de la drosophile virus6,9,10 et Imd signalisation est induite par des bactéries à gram négatif11 ,,12.

L’immunité cellulaire, composée d’encapsulation, de mélanisation et phagocytose des pathogènes invasifs, réalisée par des cellules spécialisées de sang appelées hémocytes13. Il existe trois classes d’hémocytes chez la drosophile : crystal cellules, lamellocytes et plasmatocytes13. Crystal cellules, qui représentent 5 % des hémocytes circulants chez les larves, libèrent des enzymes Phénoloxydase (proPO) conduisant à la mélanisation des pathogènes et des tissus de l’hôte au sites de plaie. Lamellocytes, qui ne sont pas normalement trouvés dans les embryons sains ou des larves, sont des cellules adhérentes qui encapsulent des objets étrangers. Ces cellules sont induites sur puparium ou lorsque les oeufs de guêpe parasite sont déposés chez les larves. Plasmatocytes phagocytaires, qui représentent 95 % de diffuser les hémocytes chez les larves et tous les hémocytes restants chez l’adulte, jouent un rôle dans le tissu transformant au cours du développement et, notamment, servir la cellule principal effecteur de l’immunité cellulaire de drosophile .

Phagocytose une ligne immédiate et cruciale de défense immunitaire innée ; les microbes qui violent la barrière épithéliale de l’hôte sont rapidement engloutis et éliminés par les cellules phagocytaires de sang (pour un examen complet de la biologie cellulaire de phagocytose voir référence 14). Ce processus se lance en reconnaissance des formes codées germline récepteurs (SDRP) sur les hémocytes reconnaissent pathogène lié profils moléculaires (PAMPs) des microbes. Une fois lié à leurs cibles, SDRP initier des cascades de signalisation qui conduisent à la formation des pseudopodes par actine cytosquelette remodelage. Les pseudopodes entourent le microbe, qui est ensuite englouti et intériorisé dans un organite naissant, le phagosome. Les microbes sont détruits comme le phagosome subit le processus de maturation du phagosome lorsque le phagosome est victimes de la traite vers l’intérieur des hémocytes et acidifie à travers une série d’interactions avec les lysosomes. In vitro et la cellule des études de biologie des cellules mammaliennes primaires ont grandement contribués à identifier et à caractériser les facteurs qui régissent la phagocytose, tels que les mammifères récepteurs Fc-gamma et C3b récepteurs15,16. Néanmoins, la possibilité d’exécuter de grands écrans ou études in vivo sont limitées dans les systèmes mammaliens.

Nous présentons ici un essai in vivo pour phagocytose chez la drosophile adulte, qui repose sur une procédure introduite par le laboratoire de David Schneider en 2000,17. Le laboratoire de Schneider a montré que sessiles hémocytes groupées le long du vaisseau dorsal abdominal facilement phagocytent les bactéries et les billes de polystyrène. Afin de visualiser la phagocytose, les mouches sont injectées avec des particules fluorescent étiquetés (comme e. coli étiquetés avec l’isothiocyanate de fluorescéine (e. coli -FITC)), incuber pendant 30 minutes pour laisser le temps de hemocytes à phagocyter les particules, puis par injection trypan blue, qui apaise la fluorescence des particules ne pas phagocytées au cours de la période d’incubation. Bateaux mouche de dorsale est imagés puis à l’aide d’un microscope inversé à fluorescent. Cet article fondamental, à l’aide d’une expérience relativement simple, ont démontré que les hémocytes phagocytent les bactéries et billes de latex, cette phagocytose bactérienne peuvent être inhibées par l’injection de pré vole avec des billes de latex, et qui vole sans cellulaires et humorales réponses immunitaires sont sensibles même à e. coli. L’analyse présentée dans le présent rapport s’appuie sur les travaux du laboratoire Schneider pour quantifier la phagocytose in vivo en mesurant l’intensité de la fluorescence des particules englouti par les hémocytes vaisseau dorsal associé.

Semblable à l’approche adoptée dans les systèmes mammaliens, Drosophila généticiens initialement utilisé génome-large in vitro Arni écrans afin d’identifier les gènes nécessaires à la réponse immunitaire cellulaire18,,19,20 ,21,22,23. Cependant, le développement du dosage adulte phagocytose in vivo a permis des expériences suivis à effectuer facilement dans des animaux entiers, ce qui permet aux chercheurs de vérifier le biologique le rôle des facteurs identifiés dans les études in vitro. Ce fut le cas avec le récepteur transmembranaire Eater, qui fut d’abord identifié comme un récepteur bactérien dans un écran d’Arni en utilisant S2 cellules24 et puis plus tard montré à la médiation d' Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, et la phagocytose staphylocoque doré (Staphylococcus aureus) adultes25.

Notre laboratoire employé l’essai in vivo de la phagocytose dans avancer les écrans génétiques et études d’association pangénomique (en utilisant le panneau de référence génétiques Drosophila (DGRP)) pour identifier de nouveaux gènes qui régulent la phagocytose dans les hémocytes adultes. Ces études conduisirent à la caractérisation des récepteurs PGRP-SC1A et PGRP-SA26, la vésicule intracellulaire traite des protéines Rab1427, le glutamate transporteur Polyphème28et protéines de liaison à l’ARN Fox-129.

Nous prévoyons que les futurs écrans intégrant la phagocytose in vivo pourraient conduire à l’identification de gènes supplémentaires qui sont importants pour la réponse immunitaire cellulaire chez la drosophile. Écrans à l’aide de lignées autofécondées-séquencé, tels que la DGRP ou la drosophile synthétique Population Resource (DSPR), peuvent d’identifier les variantes naturelles qui affectent le développement de phagocytose ou hémocytes. En outre, la technique pourrait être adoptée dans d’autres espèces de drosophile ou utilisée aux nouvelles ressources communautaires d’écran, telles que la collection de 250 espèces de drosophile , maintenu par la drosophile National espèces Stock Center (NDSSC ) à Cornell. Ces expériences peuvent être effectuées à l’aide de fluorescent marqué bactérienne ou fongique-mur bioparticules qui sont disponibles dans le commerce ou peuvent être effectuées à l’aide de n’importe quel nombre de bactéries ou de champignons – visé que le microbe exprime les marqueurs fluorescents .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparer les particules de fluorescéine injectable

  1. 10 mg de bactéries tuées par la chaleur disponibles dans le commerce de reconstituer particules marqués à la fluorescéine (voir Table des matières) à une concentration de stock de 10 mg/mL en ajoutant 990 µL stérile 1 x PBS et azide de sodium 10 µL 50 mM. Vortex pour mélanger.
    1. Diviser en 8 µL d’extraits non réutilisables dans des tubes de 0,2 mL et les stocker dans une boîte sombre à 4 ° C, afin de minimiser la sensibilité associée à la lumière.
      Remarque : L’azoture de Sodium conservateur est facultative et peut être omis si les stocks de 10 mg/mL sont faites avec du PBS stérile 1 x de 1 mL, aliquotés et conservé à-20 ° C.
  2. Préparer une solution de 10 mL de colorant dans du PBS 1 x en mélangeant 500 µL seringue filtré nourriture verte coloration et 9,5 mL stérile 1 x PBS d’alimentaire de 5 %.
  3. Laver les particules avant l’injection pour enlever l’azoture de sodium. Mix 42 µL stérile 1 x PBS et 8 µL de 10 mg/mL dans un tube de 1,7 mL. Centrifuger à vitesse maximum pendant 2,5 min à température ambiante.
    1. Retirer le surnageant, ajouter 50 µL 1 x PBS et centrifugeuse à vitesse maximum pendant 2,5 min à température ambiante.
    2. Répétez les étapes 1.3 et 1.3.1 x 2, pour un total de 3 lavages.
    3. Après le lavage final, éliminer le surnageant et remettre en suspension les particules à 1,6 mg/mL dans 50 µL de 5 % de colorant dans du PBS 1 x alimentaire.
    4. Enrouler le tube en papier d’aluminium pour protéger de la lumière. Conserver à 4 ° C, mettre au rebut après 1 semaine.

2. préparer le poste d’injection et les mouches

  1. Préparer la garniture de l’injection. D’injecter jusqu'à 4 génotypes de mouches en même temps, utiliser du ruban laboratoire de diviser une mouche de2 CO rectangulaire pavé en 4 sections. Sur le banc près du microscope, désigner des zones de placer les flacons une fois que les mouches ont été alignés sur le clavier (un pour chaque coin du pad).
  2. Préparer les flacons de même âge, 4-7 jours-vieux, mouches pour injection. Pour chaque souche à tester, transfert 5 males et 5 femelles dans un flacon frais, marqué des aliments préparés de mouche et garder à 25 ° C.
  3. Préparer l’injecteur pneumatique (voir Table des matières) en affectant à l’instrument un mode temporisé de 100 ms (saccades de pression de gaz pour expulser le liquide – permettant la livraison de sub-nanolitres volumes).
  4. Préparer des lames de microscope. Couper des bandes de 1,5 po de ruban électrique, incorporer une boucle avec le côté adhésif sur et placer sur une lame de microscope étiquetée.

3. préparer les aiguilles capillaires de verre

  1. Tirer des aiguilles de verre (capillaires en verre à paroi fine) à l’aide d’un extracteur de l’aiguille.
    1. Tenez l’aiguille sous le microscope avec un micromètre et casser la pointe avec une pincette en acier inoxydable de fine pointe #5. 100 µm conseils ne suffisent pas à percer la cuticule de la mouche tout en minimisant les blessures.
    2. Mesurer le volume de liquide qui est injecté dans chaque volée. Chargez l’aiguille stérile 5 % nourriture à colorier dans du PBS 1 x et expulser le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre de 0,01 mm.
      Remarque : Si la goutte de liquide est sphérique, le volume en picolitre est calculé comme (taille)3/1910. 30 une aiguille d’un diamètre de 100 µm éjecte 2 ~ nL à 100 ms.

4. injecter mouches

  1. Déposer 10µl de particules de 1,6 mg/mL sur un petit carré de parafilm.
    1. Tirer le liquide dans l’aiguille et monter dans la buse de l’injecteur (voir Table des matières).
    2. Anesthésier les mouches avec du CO2 et les aligner dans leur région désignée sur la flypad, avec la face ventrale vers le haut et la tête orientée vers l’avant du coussin. Placer les flacons dans les zones correspondantes sur le banc.
    3. Injecter des mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec 5, ms 100 pompes de liquide (au total 10 ~ nL).
    4. Transférer les mouches injectés dans les flacons appropriés, noter l’heure sur le flacon. Conserver à 25 ° C.
  2. Charger une nouvelle aiguille avec 0,4 % Solution de bleu de Trypan.
  3. Affectez l’injecteur pneumatique GATED, qui permet un débit constant d’air pour pousser le liquide hors de l’aiguille.
  4. Anesthésier les mouches après que qu’ils ont reposé pendant 30 min et injecter avec le bleu Trypan, jusqu'à ce que l’abdomen est plein et distendu.
    Remarque : Lorsqu’on examine la maturation phagosome avec particules marqués par un agent sensibles au pH, permettent des mouches se reposer pendant 1 h et ne pas injecter avec trypan bleu avant le montage de mouches.
  5. Monter les mouches sur lames de microscope avec du chatterton, la face ventrale vers le bas. Pousser les ailes sur le côté de la mouche et les fixer au ruban. En outre, poussez doucement la tête dans le ruban adhésif pour s’assurer que la mouche ne bougera pas.
  6. Passer immédiatement à l’étape 5.

5. imagerie mouches

  1. Image d’oiseau, un à la fois, à 25 x ou 32 x grossissement, à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé attaché à un appareil photo numérique et l’ordinateur (voir Table des matières). Mettre l’accent sur le vaisseau dorsal de la volée en utilisant des logiciels pour l’appareil photo numérique.
  2. Enregistrer le temps d’exposition et de grossissement entre les expériences.
    NOTE : Perdre la trace des génotypes est une source potentielle d’erreur lorsque vous photographiez des souches multiples en une seule séance. Pour éviter un étiquetage erroné de mouches, notez le numéro de l’image de la première et la dernière photographie de mouche pour chaque génotype.

6. quantification et normaliser la fluorescence

  1. Ouvrez le logiciel et ouvrir une image à la fois.
    1. Mesurer l’intensité de la fluorescence du vaisseau dorsal. Dessiner un polygone autour du vaisseau dorsal. Sélectionnez la mesure et enregistre l’intensité de fluorescence à l’intérieur du polygone.
    2. Déterminer l’intensité de fluorescence de fond. Copiez le premier polygone et le déplacer dans une zone adjacente au vaisseau dorsal de la mouche. Sélectionnez la mesure et l’intensité de fluorescence record de la zone d’arrière-plan.
    3. Normaliser la fluorescence de vaisseau dorsal de la fluorescence de fond :
      Fond de ÷ vaisseau dorsal.
    4. Calculer que la moyenne normalisée d’intensité de fluorescence du vaisseau dorsal de toutes les mouches dans une souche.
    5. Répétez l’expérience 2 fois plus.
    6. Utiliser un étudiant de non appariés t-test pour comparer les intensités de fluorescence relative moyenne des mouches de contrôle et d’essai à partir les trois expériences. Calculer la taille de l’effet en utilisant la formule : Cohen d = (M - M12) ÷ SDmis en commun, où M1 correspond à la moyenne de génotype 1 et M2 correspond à la moyenne du génotype 2 &
      SD mise en commun =Equation
      où SD1 est l’écart-type de génotype 1 et SD2 est l’écart-type du génotype 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Une représentation schématique de l’essai de phagocytose in vivo à l’aide de particules marqué à la fluorescéine est montrée dans la Figure 1 a. Les mouches sont monté sur la face ventrale vers le bas sur un morceau de ruban isolant et les deux premiers segments de l’abdomen, où se trouve le vaisseau dorsal, est clairement visible (Figure 1 b). Principales sources d’erreurs expérimentales se posent à l’injection et l’imagerie des étapes de la procédure (Figure 1). À l’aide de l’aiguille pour injecter plusieurs mouches peut provoquer son se bouchent avec les particules ou les tissus mouche (panneau supérieur gauche dans la Figure 1). Parce que la drosophile auto-émet une fluorescence sous la lumière de la GFP, mouches injectés avec une aiguille bouchée seront réagissent faiblement mais n’ont pas la fluorescence claire, ponctuée de particules intériorisées par les hémocytes. Une autre source possible d’erreur expérimentale peut apparaître pendant les injections bleu Trypan. Trente minutes après la première injection de particules fluorescent marqué mouches recevoir une deuxième injection avec le bleu de Trypan, qui apaise la fluorescence de particules non phagocytés extracellulaires. Intensité de la fluorescence relative pour chaque volée est calculée en divisant la fluorescence du vaisseau dorsal par celle d’une même taille zone adjacente sur l’abdomen. Les mouches qui ne reçoivent pas suffisamment le bleu Trypan réagissent en couleurs vives tout au long de leur abdomen entier (panneau gauche inférieur de la Figure 1). Cette fluorescence lumineuse peut réduire le rapport entre le vaisseau dorsal à fluorescence de fond, ce qui réduit le ratio d’intensité de fluorescence vrai de l’animal. Enfin, mouches devraient être photographiées alors qu’il est immobilisé par le CO2, déplaçant activement oiseau produisent des images floues qui ne peuvent être quantifiés (haut et bas, à droite panneaux de la Figure 1).

La collection Zuker est un panel de méthanesulfonate d’éthyle (EMS) traité les mouches porteuses de mutations autosomiques. 31 à l’origine établi comme une ressource communautaire en 2004, les lignes ont été utilisés pour réaliser des écrans génétiques avant et arrière. Notre laboratoire a découvert une ligne de la collection Zuker ne parvient pas à phagocyter gram négatif (souche K-12d’e. coli ) et les bactéries à gram positif (souche deStaphylococcus aureus bois sans protéine A) (Figure 2). Ce mutant, appelé argus, ne présente presque aucune fluorescence vaisseau dorsal dans l’essai in vivo de la phagocytose. Par rapport à la souche de fond isogéniques Zuker, cn bw, argus montre significativement plus faible absorption d’Escherichia coli (p-value = 0,019 ; Cohen d = 1.677) et S. aureus (p-value = 0,0083 ; Cohen d = 1,672). Argus, phagocytose bactérienne est également significativement réduite, e. coli (p-value = 0,045 ; Cohen d = 0.850) et S. aureus (p-value = 0.0136 ; Cohen d = 1.422) par rapport à une autre souche de contrôle laboratoire commun, Canton-S.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble et des images représentatives des test in vivo de la phagocytose. A. schématique de l’essai de phagocytose in vivo à l’aide de particules marqué à la fluorescéine. Deux injections, 30 minutes d’intervalle, servent à particule visualisé la reconnaissance et l’adoption par les globules associés à vaisseau dorsales. B. lumière blanche d’image montrant une mouche montée sur bande, avec des segments abdominaux antérieures bien visibles. C. exemple en images de phagocytose de vivo. (en haut à gauche) Une mouche injectée avec une aiguille bouchée n’a aucune fluorescence de particules. (enbas à gauche) Une mouche avec une fluorescence extracellulaire élevée en raison de l’insuffisante bleu de trypan. (en haut à droite) Une volée d’immobiliser avec aucune fluorescence extracellulaire – image idéale. (enbas à droite) Une mouche se déplaçant comme CO2 anesthésie s’estompe crée une image floue. Barre d’échelle, de 0,2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La phagocytose des bactéries en mutant et le contrôle des mouches. A. des images représentatives des bactéries de la phagocytose marqués par agent de fluorescéine ; E. coli (panneaux supérieure) et S. aureus (panneaux inférieurs). B. le ratio d’intensité de fluorescence de mouches injecté avec fluorescéine - particulesd’e. coli . C. le ratio d’intensité de fluorescence de mouches injecté avec fluorescéine - particules deS. aureus . n = 3 expériences pour chaque type de bactéries, avec 6-8 mouches par expérience. Barres d’erreur, ± SEM. Statistical analysis = bilatérale t -test. Barre d’échelle, de 0,2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Disponibles dans le commerce, fluorescent étiquetés de particules sont utilisés pour évaluer la phagocytose en général (0,2 µm carboxylate-modified microsphères) ou la phagocytose des microbes (chaleur - fluorescent-étiquetés ou chimiquement tués bactéries ou levures). Afin d’évaluer la maturation phagosome, chercheurs peuvent sélectionner des particules marqués par un agent sensibles au pH qui émet une fluorescence quand le pH diminue de neutre à acide, comme dans le phagolysosome. Alternativement, pour examiner les premières étapes de la phagocytose, la reconnaissance de l’agent pathogène et absorption, chercheurs devraient choisir particules marquées avec des étiquettes fluorescentes qui réagissent en intérieur et en dehors des cellules.

Conditions expérimentales soigneusement contrôlées sont essentielles pour s’assurer que le dosage de la phagocytose in vivo est effectué de façon reproductible. Tout d’abord, Drosophila subit immunosénescence cellulaire32, donc les mouches utilisées pour l’expérience devraient être appariés selon l’âge, idéalement dans une fourchette de 4 à 7 jours. En second lieu, la période entre les injections soient cohérente. La phagocytose se produit rapidement, quelques minutes de la cellule hôte, sentant le microbe14. Au cours de la prochaine heure, maturation phagosome a lieu, menant à l’acidification du phagosome et destruction du microbe intériorisée. Désignant un intervalle défini à attendre entre les injections réduit la variabilité expérimentale et permet de faire des comparaisons entre les souches et les expériences menées sur des jours différents. Nous vous conseillons d’attendre trente minutes lorsque, à l’aide de particules de fluorescéine et une heure pour le dosage de la maturation du phagosome in vivo utilisant des particules marqué par sensibles au pH agent fluorescent.

À l’aide de l’aiguille pour injecter plusieurs souches s’assure que toutes les mouches recevoir la même dose de particules et variabilité expérimentale peut survenir si les aiguilles de verre pause ou se bouchent. Mise en place du poste d’injection et les mouches au préalable est donc essentielle pour assurer que le dosage de la phagocytose in vivo est effectué rapidement et efficacement. Avant de commencer l’expérience, mesurer le volume de liquide expulsé par plusieurs aiguilles et conserver un ensemble d’aiguilles de même taille. Ainsi, si une aiguille se casse entre les injections, il peut être remplacé immédiatement. En outre, aiguilles obstrués peuvent conduire à des résultats faussement négatifs, rendant difficile de distinguer entre les mouches dont hémocytes ne peuvent phagocyter les microbes et les mouches n’ayant pas reçu de particules fluorescentes. Teindre des solutions rendues avec colorant alimentaire vert, rendent plus facile à suivre qui vole ont été injectés et d’identifier les problèmes avec des aiguilles bouchés. Idéalement, l’expérience doit être réalisée plusieurs fois, avec moins 6-8 mouches par souche dans chaque expérience, et compare les résultats d’expériences afin d’identifier les valeurs aberrantes. Enfin, assez bleu Trypan devrait être administré pour assouvir pleinement la fluorescence des particules extracellulaires afin que la fluorescence de fond est comparable entre les mouches (Figure 1).

Lorsque l’imagerie des mouches, il devrait également veiller afin d’obtenir des images claires et cohérentes du vaisseau dorsal. Ruban isolant noir est utilisé pour créer un fond sombre et mouches doivent être monté sur la face ventrale vers le bas, avec leurs ailes et la tête fixée au côté du ruban adhésif. Si possible, mouches doivent rester immobilisés sous CO2 , alors que les images sont prises. Enfin, pour limiter la possibilité de partialité expérimentale, nous recommandons l’utilisation d’un montage expérimental aveugle ; où les flacons et les souches sont codés par un chercheur et l’expérience sont mené et quantifié par un autre chercheur.

Le test in vivo de la phagocytose est un outil utile pour identifier des défauts globales dans la phagocytose. Toutefois, il ne distingue pas entre les hémocytes phagocytose efficacité et différences dans les hémocytes nombre ou de la situation, en raison de la diminution liée à l’âge ou les anomalies du développement. 32 en outre, la procédure ne fournit pas d’informations sur les différences dans la taille ou la capacité phagocytaire de hemocytes individuels. Ainsi, une fois que les mouches avec phagocytose réduite ont été identifiés à l’aide de l’essai in vivo de la phagocytose, chercheurs devraient effectuer des études de suivi, éventuellement à l’aide d’autres particules, afin de distinguer les défauts du système immunitaire phagocytose et défauts phagocytaires généraux. En fin de compte, déterminer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les défauts phagocytaires de souches mutantes nécessite un examen de la phagocytose dans les hémocytes unique. Ceci peut être accompli en utilisant, par exemple, microscopie confocale, fluorescence activé tri ou magnétiques perle isolement des cellules d’adultes hémocytes27,28,29,32,33 , 34.

Dans l’ensemble, les Drosophila s’est avéré pour être un bon modèle pour étudier l’immunité innée chez les animaux vivants. Ici, nous avons fourni une vue d’ensemble de l’essai in vivo de la phagocytose, une méthode pour étudier la phagocytose globale et la réponse immunitaire cellulaire chez les mouches adultes. La procédure peut être appliquée pour dépister les nouveaux gènes qui peuvent être importants pour la défense de l’hôte, valider les gènes identifiés dans les écrans d’Arni in vitro à grande échelle et caractériser davantage des mutants présentant des défauts dans la réponse immunitaire humorale, intestin ou antivirale. Il est facile à installer et peut produire une grande quantité de données fiables sur plusieurs variétés de mouches dans un court laps de temps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Dr Beth Gonzalez et Dr Aprajita Garg de soutien dans la réalisation des expériences in vivo de la phagocytose. Une subvention de démarrage de NSF UMD avance et UMD NIH T32 subventions de formation, cellulaire et biologie moléculaire (CMB) et les Interactions hôte-pathogène (HPI), a financé ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Tags

Immunologie et Infection numéro 146 phagocytose bactérie l’immunité cellulaire Drosophila melanogaster l’immunité innée adulte
Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, <em>Drosophila melanogaster</em>, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter