Summary
Denne protokollen demonstrerer metoder for en mus modell av åpen-Skull traumatisk hjerneskade og transplantasjon av kultivert menneskelig indusert pluripotent stilk cellen-avledet celler inn i skaden området. Atferds-og histologic tester av resultatene fra disse prosedyrene er også beskrevet i korte trekk.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Sykdom patologi på grunn av TBI utvikler seg fra den primære mekaniske fornærmelse til sekundære skader prosesser, inkludert apoptose og betennelser. Animal modellering har vært verdifullt i søket til å løse skade mekanismer og evaluere potensielle nervecellene terapier. Denne protokollen beskriver kontrollerte kortikale Impact (CCI) modell av fokal, åpen hodet TBI. Nærmere bestemt beskrives parametere for å produsere en mild ensidig kortikale skade. Behavioral konsekvensene av CCI er analysert ved hjelp av teip fjerning test av bilaterale Sensorimotor integrering. Når det gjelder eksperimentell terapi for TBI patologi, illustrerer denne protokollen også en prosess for å transplantere kultivert celler inn i hjernen. Neural cellekulturer avledet fra humant indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) ble valgt for sitt potensial til å vise overlegen funksjonell restaurering i menneskelige TBI pasienter. Kronisk overlevelse av hiPSCs i verts musen hjernevevet oppdages ved hjelp av en modifisert DAB immunhistokjemiske prosess.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en generell betegnelse for ervervet skade på hjernen på grunn av enten indirekte mekaniske krefter (rotasjons akselerasjon/retardasjon eller Contra-kupp) fra slag mot hodet eller direkte skade fra gjenstander eller blast bølger. TBI er anslått å være årsaken til om lag 9% av verdensomspennende dødsfall og observert i anslagsvis 50 000 000 tilfeller per år1,2. En 2017 rapport fra Centers for sykdom kontroll og forebygging anslått at i 2013, var det totalt 2 800 000 sykehus besøk og dødsfall på grunn av TBI i USA3. Mange mildere TBIs gå urapporterte hvert år. Alvorlig TBI kan føre til livslang svekkelse av kognisjon, motorisk funksjon, og generell livskvalitet. Konsekvensene av mild TBI, spesielt repeterende sport-relaterte TBI, har nylig blitt verdsatt for deres lumske helseeffekter4,5.
Prekliniske modellering er en viktig komponent i utviklingen av ny mekanistisk innsikt og potensiell oppkvikkende terapi for TBI. Den kontrollerte kortikale virkningen (CCI) modell av TBI er en åpen-Head modell av mekanisk kontusjon skade på cortex. Virkningen parametrene kan endres for å produsere CCI skader som spenner fra mild til alvorlig6. CCI skader er fokal i stedet for diffuse, som sett med andre lukkede hodet modeller av TBI. CCI kan utføres for å indusere en ensidig skade, slik at kontralateral cortex kan tjene som en intern komparator. Denne protokollen demonstrerer egenskapene til en mild CCI til en del av cortex som omfatter primære somatosensory og motor regioner. Dette kortikale området ble valgt for sitt engasjement i Sensorimotor atferd som mange atferds tester kan oppdage skade-indusert underskudd7. Atferds forbedringer på grunn av terapeutiske intervensjoner for TBI kan oppdages, også.
Et kjennetegn på TBI er utbredt neural dysfunksjon i den skadde regionen. Skadde neurons gjennomgår celle død, og neuronal nettverkstilkobling er forstyrret8,9. TBI forstyrrer rekrutteringen av endogene stamceller, noe som fører til videre nedstrøms atferd underskudd10,11. Transplantasjon av nevrale stamceller og stilk cellen-avledet celler har blitt utforsket som en mulighet til å gjenopprette funksjon i den skadde hjernen. I tillegg til potensialet for å gjenopprette skadede nevrale kretser, transplanterte celler utøve paracrine effekter som fremmer neuronal overlevelse og funksjonell utvinning fra TBI12. En rekke celletyper har blitt transplantert preklinisk å evaluere deres styrkende potensial i modeller av nevrologiske lidelser13,14,15. Den nylige popularisering av indusert pluripotent stamcelleteknologi16 har muliggjort utviklingen av en rekke menneskelige stilk cellen linjer for eksperimentell bruk. Prekliniske testing med hiPSC-avledede celler er et viktig første skritt for å karakteriserer en gitt cellelinje potensielle terapeutiske effekt mot menneskelige sykdommer. Dette laboratoriet har utviklet protokoller for å skille hiPSCs til neural fenotyper17 i jakten på transplantable celler for å hjelpe utvinning fra traumatisk hjerneskade.
Eksperimenter i denne protokollen bruker en ensidig CCI for å indusere TBI til venstre somatosensory og motor cortex hos voksne mus. En mild CCI skade resulterer i en vedvarende funksjonell underskudd i riktig fire som brukes til å spore virkningene av hiPSC-avledet nevrale celle engraftment på funksjonell utvinning. Fire Sensorimotor testing i denne protokollen ble tilpasset fra metodikken etablert av Bouet og kolleger18 og demonstrerte tidligere av Fleming og kolleger19. Denne protokollen skisserer en komplett arbeidsflyt for å utføre en eksperimentell hjerneskade, terapeutisk transplantasjon av hiPS celler, og atferds-og histologic analyse av eksperimentelle utfallet tiltak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som er beskrevet i denne protokollen ble gjennomgått og godkjent av uniformerte Services University Animal Care og use Committee.
1. Craniectomy og kontrollert kortikale effekt
- Utarbeidelse av kontrollert kortikale innvirkning enhet og kirurgiske forsyninger.
- Legg en 1 mL slip-tip-sprøyte med 0,5 mL sterilt saltvann for sår vanning. Fest en 25 G nål til sprøyten for å kontrollere vanning.
- Forbered en fortynnet løsning av CsA i DMSO til endelig konsentrasjon av 1 mg/mL. Legg inn en andre 1 mL slip-tip-sprøyte med 0,5 mL Ciklosporin A (CsA) løsning for immunsuppresjon. Fest en 25 G nål eller større til CsA sprøyten.
- Fest den kontrollerte kortikale innvirkning stempelet til en arm på en stereotaxic ramme og satt til en vinkel på 15 °. Fest en 3 mm nedslaget sonde til stempelet.
- Sett hastigheten av virkningen til 1,5 m/s og virkningen dvele tid til 0,1 s for å produsere en mild kortikale skade.
- Utfør en ensidig craniectomy
- Plasser musen i en anestesi induksjon kammer koblet til en isoflurane fordamper med komprimert oksygen kilde. Indusere anestesi med ~ 3% isoflurane på ~ 0,7 L/min oksygen. Sjekk for dybden av anestesi ved mangelen på respons til tå-klype.
- Barbere hodebunnen ved hjelp av elektrisk Clippers og tørk bort eventuelle løs pels.
- Plasser musen i en stereotaxic ramme med vedlagt anestesi levering nesen kjegle.
- Plasser en varmende pute satt til 37 ° c på den stereotaxic rammen under musen for å opprettholde kroppstemperaturen under anestesi. Fix hodet på plass med øret barer og en bite bar og orientere hodet slik at skallen frontal benet er horisontal. Opprettholde anestesi på ~ 1.5%-2% isoflurane for varigheten av operasjonen.
- For å utføre preoperativ pleie og aseptisk kirurgisk tilberedning, Påfør en steril bomulls salve på øynene ved hjelp av en Påfør en jod-basert løsning på den barberte hodebunnen området. Fjern dette med 70% etanol. Dekk dyret med en fenestrated kirurgisk, slik at toppen av hodet er synlig, men øynene er dekket.
- Lag en midtlinjen snitt (1,5-2 cm) i hodebunnen ved hjelp av en skalpell eller saks. Bruk sterile bomullspinner til å rense såret og for å fjerne konseptet igjen av midtlinjen på bregma.
- Bruk nedslaget sonden til å identifisere craniectomy området.
- Angi stereotaxic referansepunkt (X = 0, Y = 0) til bregma. Juster proben sideveis til 2 mm igjen av midtlinjen. Omriss en 5 mm diameter sirkel rundt sonden ved hjelp av en fin-tip kirurgisk sikker markør. Hev og roter nedslaget ut av posisjon.
- Bruk den høyhastighets roterende mikromotoren Kit håndverktøyet til å lage et åpent hull i skallen ved hjelp av en rund-tip 0,6 mm eller 0,8 mm Burr Drill bit på ~ 70%-80% maksimal hastighet. Påfør lett trykk på skallen mens du borer langs 5 mm circumferential omriss for å tynne denne grensen.
- Ikke Påfør overflødig trykk under boring. Dette kan forårsake kortikale Kader på grunn av vibrasjon, kompresjon eller utilsiktet inntrengning. Tillate hastigheten på borekronen å gjøre arbeidet.
- Ikke bore på et gitt sted for lenge for å unngå overflødig friksjon oppvarming av skallen. Skyll craniectomy sporadisk med steril saltvann for å fjerne rusk og for å redusere oppvarming fra rotasjonsverktøyet.
- Følg nøye med når du borer over koronale Sutur linjen ettersom disse punktene er sårbare for blødning.
- Bruk et par fine pinsett for å fjerne hodeskallen når craniectomy omrisset er tilstrekkelig tynnet. Ta tak i klaff anteriort, og løft den forsiktig og trekk den sidelengs med en radial bevegelse.
- Ikke for å skade Dura mater når løfte klaffen; Dette kan forårsake alvorlig personskade og hemorrhaging.
- Utføre en mild kontrollert kortikale innvirkning skade
- Rengjør nedslaget sonden med en steril alkohol prep pad. Flytt nedslaget sonden tilbake på plass over den eksponerte cortex. Senk sonden til den berører Dura mater overflaten. Merk denne posisjonen som Z = 0.
- Trekk ut stempelet og Flytt til Z =-1,0 mm. Lad ut stempelet for å påvirke cortex.
- Løft stempelet raskt og beveg armen ut av posisjon. Påfør sjenerøse mengder saltvann for å vanne cortex etter skade. Skyll kirurgi området med saltvann etter behov og Sutur i hodebunnen innsnitt ved hjelp av enkle avbrutte masker med 5,0 silke Sutur.
- Utfør postoperativ behandling på musen
- Avslutte anestesi. Lever CsA ved subkutan injeksjon i scruff ved 10 mg/kg dose. Plasser musen i en ren og forvarmet postoperativ bur.
- Gi Paracetamol smertestillende i drikkevannet ved 1,0 mg/mL.
Merk: gi analgesi i henhold til den aktuelle IACUC standard driftsprosedyre og i betraktning av eksperimentelle utfallet variabler (for eksempel, sedasjon, nevroinflammasjon). - Gi fuktet Chow mat i en varmet utvinning buret for å hjelpe i rehydrering og utvinning.
- Gå videre fra del 2 til avsnitt 4 ovenfor når du utfører bare craniectomy (humbug)-kontroller.
2. Stereotaxic transplantasjon av celle suspensjon
- Begynn celle transplantasjon prosedyre omtrent 24 h etter craniectomy.
- Forbered celle transplantasjon utstyr og kirurgiske forsyninger
- Fyll en 1 mL slip-tip-sprøyte med sterilt saltvann for sår vanning. Fest en 25 G nål til sprøyten for å kontrollere vanning.
- Fyll en 1 mL slip-tip-sprøyte med CsA-løsning for immunsuppresjon. Fest en 25 G nål eller større til CsA sprøyten. Påfylling av CsA sprøyten etter behov mellom operasjoner.
- Forbered glass pinner fra 1,0 mm OD Borosilikatglass glass kapillær Pipetter ved hjelp av standard metoder.
- Bruk fin pinsett til å bryte nålen tips til ca en 200 μm diameter. Sørg for at den sylindriske akselen på nålen er ikke lenger enn 2,5 cm.
- Kalibrer sprøyte pumpen for bruk med en sprøyte på 10 μL. Angi en strømningshastighet på 0,2 μL/min for å levere et total volum på 2,0 μL.
- Forbered humant indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) suspensjon.
- Utfør all celle håndtering i en cellekultur BSL-2 hette ved hjelp av standard steril håndtering teknikker.
- Forbered cellekulturer på forhånd i henhold til standardbetingelsene som er definert for celletypen. Se Lischka et al.17 som et eksempel.
Merk: eksperimenter som vises i denne demonstrasjonen brukte ulike nevrale fenotype celler avledet fra hiPSCs. - Forsiktig distansere cellene i en enkelt celle suspensjon ved hjelp av en celle avløsning løsning, eller andre foretrukne enzymatisk eller kjemiske midler.
- Telle celler i suspensjon, deretter fortynne suspensjonen til 5 x 104 celler/μL i minimalt cellekultur medium (f. eks, DMEM) i en 1,7 ml flip Top test tube.
- Observer følgende merknader for transplantasjon:
- Oppretthold cellene i suspensjon ved 37 ° c for varigheten av prosedyrene.
- Legg sprøyten bare rett før du utfører intraparenchymal injeksjon (trinn 4,5 under).
Merk: tyngdekraften kan føre til at cellen suspensjonen til å bosette seg eller å klamre seg til siden av sprøyten hvis lagt på sin side. Dette fører til uregelmessigheter i antall celler injisert. - Allot ~ 5 x 105 celler (10 μL suspensjon) per mus hvis du utfører flere celle transplantasjon prosedyrer på en dag.
- Utføre stereotaxic transplantasjon kirurgi
- Plasser musen i en anestesi induksjon kammer koblet til en isoflurane fordamper med komprimert oksygen kilde. Indusere anestesi med ~ 3% isoflurane på ~ 0,7 L/min oksygen.
- Plasser musen i en stereotaxic ramme med vedlagt bedøvelse nese kjegle.
- Fix hodet på plass med øret barer og en bite bar og orientere hodet slik at skallen frontal benet er horisontal. Opprettholde anestesi på ~ 1.5%-2% isoflurane for varigheten av operasjonen.
- Utføre preoperativ Stell og aseptisk forberedelse
- Påfør fuktighetsgivende øyen salve som inneholder antibiotika til øynene ved hjelp av en bomullspinne.
- Tømming av snittområdet med sterilt saltvann for å rense området og for å løsne sting. Påfør forsiktig 70% etanol med en bomullspinne for å sterilisere snittområdet.
- Fjern sting ved hjelp av fine pinsett og øyen saks. Skyll operasjonsstedet og craniectomy med rikelig sterilt saltvann.
- Vurder dyret for utelukkelse hvis cortex viser Diskvalifiserende egenskaper, inkludert overdreven herniation, misfarging, forstyrret endometrial blodkar eller blødning.
- Legg celle transplantasjon sprøyten
- Flytt celle fjæring fra 37 ° c inkubator til en cellekultur biosafety hette. Snurr forsiktig eller trykk på røret for å sikre en homogen celle suspensjon.
- Bruk en mikro-pipettehjelper for å laste ~ 7,5 μL celle fjæring i Hamilton-sprøyten gjennom stempel enden.
- Hold sprøyten i en vinkel på ~ 120 ° med stempel enden vendt ned. Sett inn stempelet, pass på at du ikke innfører en luftboble mellom fjæringen og stempel spissen.
- Fest paknings forsamlingen til pipette nålen, og fest deretter nålen til sprøyten.
- Trykk på stempelet for å flytte celle fjæringen inn i pipette nålen. Hvis det er motstand mot suspensjon utløp, bruk fin pinsett til å bryte nålen spissen for å forstørre diameteren.
- Fest sprøyten til den stereotaxic sprøyte pumpen. Før stempelet for å sikre at sprøyte pumpeenheten fungerer som den skal.
- Beveg nålen inn i koordinatene for injeksjon.
- Rett inn nålespissen til bregma. Angi X-og Y-koordinatene til 0. Deretter flytter du nålespissen over craniectomy til 2,0 mm sideveis og-1,0 mm bakre til bregma. Berør nålen spissen til Dura mater overflaten og sette stereotaxic koordinaten til Z = 0.
- Skyv stempelet for å sikre at celle fjæringen flyter tilstrekkelig før du introduserer nålen inn i hjernen.
- Introduser nålen inn i hjernen til en dybde på Z =-1,4 mm. Disse stereotaxic koordinerer plassere pode på grå materie-hvit materie grensen av den dype cortex20.
- Start sprøyten pumpen for å sette mot celle suspensjon. Sett laboratoriebenk timer til 15 minutter og starttid takeren. Bruk en lang arbeidsavstand mikroskop for å overvåke celle suspensjon utløp.
- Skyll operasjonsstedet med sterilt saltvann under injeksjonen for å opprettholde vevs fuktigheten.
- Ved 15 min, langsomt trekke transplantasjon nålen. Vanne operasjonsstedet med saltvann og Lukk snittet med sting.
- Utfør postoperativ behandling
- Avslutte anestesi. Lever CsA ved subkutan injeksjon i scruff ved 10 mg/kg dose. Plasser musen i en ren og forvarmet postoperativ bur.
- Gi Paracetamol smertestillende i drikkevannet ved 1,0 mg/mL.
Merk: gi analgesi i henhold til den aktuelle IACUC standard drifts protokollen (SOP) og i betraktning av eksperimentelle utfallet variabler. - Gi fuktet Chow mat utvinning buret for å hjelpe i rehydrering og utvinning.
- Fortsett daglig CsA injeksjoner på 10 mg/kg gjennom hele overlevelses varigheten av musen.
3. teip fjerning test av Sensorimotor integrering
- Skjær den elektriske tapen i 3 mm x 5 mm strimler ved hjelp av en liten barberhøvel kniv før du utfører atferden testen. Bruk en glatt glass overflate for kutting av selvklebende strimler.
Merk: Bruk gul og rød tape, da mus har vanskeligheter med å skille mellom disse fargene21.- Velg et lite speil som passer godt inn i den klare plast boksen.
- Fix speilet på plass på en cirka 45 ° vinkel med modellering leire eller teip for å vise dyr atferd fra under.
- Plasser boksen og speil montering på en benk i en rolig dedikert atferd testing rom. Ordne sylinderen på plast boksen over speilet.
- Ordne håndtering klut, pinsett, og selvklebende strimler på benken ved siden av atferden testing boksen.
- Rengjør esken og sylinderen med 70% etanol og papirhåndklær. La overflatene tørke grundig.
- Bringe musene inn i atferden testing rommet. La musene acclimate til testrommet i minst 30 min før atferds testing.
- Fjern vannforsyninger fra burene for å minimere vannlating under testing, noe som kan forstyrre effektiv test ytelse.
- Velg et lite speil som passer godt inn i den klare plast boksen.
- Utfør testen av selvklebende fjerning
Merk: denne atferden testen er best utført av to til tre etterforskere: en til å betjene stoppe klokker, og en eller to til å håndtere mus og observere atferden.- Bruk hver TWEEZER å skrelle en selvklebende stripe av hver farge.
- Velg hvilken stripe farge som samsvarer med hvilken fire og forbli konsekvent gjennom hele rettssaken.
- Bruk det handling tøyet å holde fast en musen av scruff av halsen og rygg slik det musa avholde forepaws fjerne fra dens kropp og leder.
- Bruk pinsett til å plassere en selvklebende stripe på plantar overflate av hver fire. Bruk delikat og konsistent finger trykk for å sikre strimler til poter.
- Plasser musen raskt inn i plast sylinderen. Start de to stoppe klokker når musen har alle fire poter på plast boksen.
- Bruk det to stoppe klokker å fortegnelse det latencies for det fulgte fire begivenheter: igjen pote legge merke til, igjen pote flytting, rett pote legge merke til, rett pote flytting.
- Fortegnelse en legge merke til begivenhet når det dyr lager entydig gjenkjennelse av limet strimmel av risting eller flinching det pote eller skarp stripen.
- Record en fjerne hendelse når dyret effektivt fjerner stripen fra fire plantar overflaten.
Merk: fjerne hendelsen er ikke diskvalifisert av stripen readherence eller hvis stripen klynger seg til den laterale overflaten av fire. - Stopp tidtakeren ved 120 s hvis den tilsvarende stripen ikke er fjernet.
- Registrer medgått tid for de fire hendelsene i databladet.
- Utfør en ny prøve på hver mus
- Tillat minimum 5 min å gå mellom forsøk for en individuell mus for å redusere stress, noe som kan forstyrre effektiv ytelse på testen.
- Rengjør apparatet med papirhåndklær mellom testing mus for å fjerne avfall når du tester flere mus fra et enkelt bur.
- Rengjør apparatet grundig med 70% etanol og papirhåndklær når du tester mus fra flere bur.
- Omvendt fargen-pote plasseringen ordre for sekundet prøve av møtet å tilfeldig alle bevirke av fargen.
- Beregn Gjennomsnittlig ventetid for hver hendelse mellom to forsøk per daglige økt for hvert dyr.
- Bruk hver TWEEZER å skrelle en selvklebende stripe av hver farge.
- Rengjør apparatet og håndtering klut grundig med vann, erstatte buret vannforsyninger, og returnere musene til sine Holding anlegg.
- Gjenta trinn 3.1-3.2 på påfølgende eksperimentelle tidspunkter for en gjentatt tiltak prøve design.
Merk: Gjenta trinn 3.2.1-3.2.5.3 daglig i 5 dager før en datainnsamling for å acclimate dyrene til oppgaven. Datainnhenting ved Baseline før operasjon anbefales.
4. Diaminobenzidine (DAB) immunhistokjemiske analyse av overlevelse og skade på pode
- Euthanize dyrene og utfør en transcardial.
- Forbered løsninger av 0,1 M fosfat-bufret saltvann (PBS) og 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS. Balansere pH i begge løsninger til 7,4.
- Plasser de to løsningene på is i en avtrekksvifte. Plasser en peristaltisk pumpe i avtrekks panseret, og Kjør pumpen for å fylle slangen med PBS. Sett pumpens strømningshastighet til ~ 7 ml/min. Koble en 25 G nål til utløpsrøret på pumpen.
- Plasser et drenerings brett med et mykt substrat i hetten. Løft den ene enden av skuffen i en liten vinkel, slik at under væsker tappes til den nedre enden.
- Plasser en mus i en anestesi induksjon kammer. Fyll kammeret med 4% isoflurane ved hjelp av komprimerte 100% oksygen kjøretøy gass.
- Flytt anesthetized musen fra kammeret til en anestesi nese kjegle. Reduser isoflurane til 2%.
- Utfør en toraktomi for å avdekke hjertet. Avvikle anestesi, som toraktomi forårsaker døds aktiv.
- Plasser forsiktig den strøm nålen i venstre ventrikkel langs den lange aksen i hjertet. Ikke Pierce hjertet septum, da dette vil føre til dårlig.
- Bruk små saks til å kutte riktig Atrium, deretter umiddelbart slå på peristaltisk pumpen.
- Fortsett PBS strømme til væsken forlater høyre Atrium går tom for blod.
- Slå av pumpen. Flytt pumpen inntaksrøret til beholderen av PFA. Start pumpen på nytt. Fortsett perfusing PFA til enten dyret er tilstrekkelig stivt eller til et 20 mL volum har blitt pumpet gjennom.
- Slå av pumpen. Fjern strøm nålen fra hjertet. Flytt inntaksrøret fra PFA til PBS, og Tøm PFA grundig fra slangen.
- Fjern hjernen fra skallen ved forsiktig disseksjon. Plasser hjernen i en liten beholder fylt med 4% paraformaldehyde, og la hjernen til å post-Fix over natten ved 4 ° c.
- På dagen etter fiksering, erstatte P med PBS og 0,1% natrium Natriumazid. Oppbevar hjernen i denne løsningen til forberedelse til histologic snitting.
- Samle inn 40-50 μm deler av formaldehyd-fast hjernevev via en frysing mikrotomen eller romtemperatur vibratome.
- Forbehandle vev i 0,3% hydrogen peroxide i vann for å deaktivere endogene peroxidases, som kan produsere uspesifisert farging.
- Utføre antigen henting ved hjelp av sitronsyre buffer (10 mM natrium citrate, 0,05% polysorbat, pH 6,0) ved 60 ° c i 30 min.
- Utfør antistoff merking ved standard metoder. Se Lundell et al. s rapport22 fra dette laboratoriet for flere detaljer.
- Bruk en mus IgG nøytralisering Kit (se tabell over materialer) for å redusere kryss-reaktivitet med endogene antistoffer. Ruge vevet i IgG-nøytralisering buffer i minst 1 time ved romtemperatur (RT) etter produsentens anvisninger.
- Bruk en mus anti-humant kjernefysisk antigen primære antistoff (hNA; 1:500 fortynning) når transplantere menneskelige iPSC-avledede celler for å finne de transplanterte cellene. Ruge vev med det primære antistoff ved 4 ° c for 48-72 h ved hjelp av skånsom agitasjon.
- Etter å ha skylt bort primær antistoff løsning, ruge vev med HRP-likt anti-mus sekundært antistoff ved 1:250 fortynning for 2 timer ved RT.
- Utfør DAB kromogen reaksjon ved standard metoder for å avdekke immunolabeling. La DAB-reaksjonen utvikle seg i 5 til 10 minutter ved RT.
- Fest beiset vev til lysbilder og bruke omslags slips ved hjelp av standard metoder.
- Kvantifisere antall merkede celler ved hjelp av upartiske stereology som beskrevet tidligere23,24. Utfør analyse ved hjelp av 20 μm optiske seksjoner og mellom Seksjons intervall på tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Craniectomy kirurgi forenkler eksperimentell hjerneskade og terapeutisk celle transplantasjon: den kontrollerte kortikale innvirkning modell av hjerneskade og påfølgende celle transplantasjon terapi krever forsiktig fjerning av overliggende skallen. Craniectomy kan utføres på en rygg flate av skallen for å tillate manipulasjoner til hjernen regionen av interesse. Diagrammet i figur 1 viser en 5 mm diameter craniectomy skjematisk å avdekke primær somatosensory og motor barken (figur 1a). Ved 24 h etter craniectomy, en annen operasjon ble utført for å injisere menneskelige iPSC-avledet neural celle suspensjon i dype lag av cortex (figur 1B). Noen cerebral ødem er normalt på den første dagen etter craniectomy, og spesielt etter CCI. Men cerebral blodkar sparing under alle faser av denne prosedyren er avgjørende for overlevelse av cortex. Figur 2 illustrerer celle transplantasjon prosedyre i en mus med minimal cerebral herniation, minimal blødning, og omfattende kortikale endometrial blodkar. Disse funksjonene er gode Prognostisk indikatorer for en vellykket operasjon.
Testing av selvklebende tape avslører Sensorimotor underskudd etter ensidig hjerneskade: parametrene av hjerneskade modellen som er beskrevet ovenfor, ble spådd til å påvirke forlemen sensorisk og motorisk funksjon. Den selvklebende tape fjerning testen ble valgt for å evaluere alvorlighetsgraden av forlemen funksjonelle underskudd, og de potensielle terapeutiske fordelene av celle transplantasjon. Mus ble trent på testprosedyren i 5 dager, deretter lov til å hvile i to dager før Baseline atferds testing. Operasjonene ble utført på dagen etter Baseline testing. Atferds tester i denne studien ble utført på postoperative dager 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 og 42. Figur 3 viser resultater fra et forsøks eksperiment der forlemen funksjon i mus med craniectomy alene (humbug) og med CCI skaden ble sammenlignet med forlemen funksjon i naive mus (n = 11 naiv, 12 humbug, 11 CCI). Mus som gjennomgikk kirurgi utstilt forbigående økt latencies å legge merke til selvklebende stimuli for 1-3 dager umiddelbart etter operasjonen (Figur 3A, B). Mus viste forbigående postoperativ underskudd ved fjerning av ipsilateral fire også (fig.3C). Men mus som gjennomgikk CCI viste betydelige underskudd i motorytelse i fire kontralateral til skade sammenlignet med naive mus ut til postoperativ dag 28 (Figur 3D). Disse dataene beskriver også den uventede alvorlighetsgraden av Sensorimotor tap i craniotomized mus uten CCI, noe som indikerer at kirurgisk craniectomy til dette området også medfører TBI-relatert neurofunctional underskudd.
Immunodetection av humant indusert pluripotent stilk cellen (IPSC)-avledet celle-transplantasjon i mus hjernen seksjoner: eksperimenter ble utført for å avgjøre om menneskelige IPSC-avledede nevrale celler ville overleve langsiktig hårtransplantasjon i musen hjernen. Human nevrale stamceller (NSCs) avledet fra iPSCs var differensiert i enten umodne neurons eller astrocytter in vitro bruker etablerte metoder17. Transplantasjon av hver av de tre nevrale celle fenotyper ble testet i vår CCI modell av traumatisk hjerneskade ved hjelp av prosedyren som er beskrevet ovenfor, og avbildet i figur 2. Musene var euthanized for histologic analyse på 7 dager etter transplantasjon. Mouse hjerne seksjoner ble immunostained for den menneskelige kjernefysiske antigen (hNA). Menneskelige celle-hud kan være klart skilles fra verten vev i humbug kirurgi og CCI hjerner (Figur 4). Astrocytt... (n = 3 humbug, 2 CCI) viste dårlig overlevelse sammenlignet med NSCs (n = 12 humbug, 15 CCI) og neurons (n = 11 humbug, 10 CCI), og ble ikke vurdert for fremtidige eksperimenter.
Figur 1 : Koordinere parametre for kirurgiske manipulasjoner. Cartoon skildringer av mus hjernen områder av interesse. Røde sirkler indikerer en ~ 5 mm diameter craniectomy. Et rødt kryss indikerer craniectomy sentrale punkt 2 mm lateral til bregma. (A) det fargede området av hjernebarken i det øvre diagrammet påvirkes av mild CCI når en craniectomy utføres som vist i nedre diagram. (B) den blå pilen i øvre diagram indikerer omtrentlig plassering av celle injeksjoner ved 1,4 mm dybde fra kortikale overflate. Det blå krysset i det nedre diagrammet indikerer plassering av celle injeksjon 2 mm lateral og 1 mm bakre til bregma. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Intraoperativ overvåking av celle suspensjon injeksjon. Fotografere tatt gjennom en lang arbeidsavstand mikroskop under intraparenchymal celle injeksjon. Anatomiske funksjoner er kommentert for klarhet. Hodebunnen delvis tilslører kirurgi stedet for å minimere dehydrering under inngrepet. Mindre blødning kan oppstå under nålen penetrasjon som vist, som ikke er grunn til bekymring hvis store kortikale fartøy forblir intakt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Atferds evaluering av Sensorimotor integrering etter hjerneskade. Mus som gjennomgikk craniectomy og CCI ble sammenlignet med naive kontroller og mus som gjennomgikk bare humbug kirurgi (n = 11 naiv, 12 humbug, 11 CCI). Data presenteres som gruppe bety latencies, med feil linjer som indikerer SEM. (A) mus som gjennomgikk CCI utstilt økt ventetid til å gjenkjenne lim stimuli brukes til ipsilateral fire på den første postoperative dagen. (B) mus som gjennomgikk CRANIECTOMY eller CCI viste betydelig økt ventetid til å legge merke til lim stimuli brukt på kontralateral fire på postoperativ dager 1 og 3. (C) mus som gjennomgikk CRANIECTOMY eller CCI viste betydelig økt latency for å fjerne lim stimuli fra ipsilateral fire på postoperativ dager 1 og 3. (D) mus som gjennomgikk CRANIECTOMY eller CCI viste betydelig økt latency for å fjerne lim stimuli fra kontralateral fire på postoperative dager 1-5. Motor underskudd hos mus med CCI holdt sterkt i 28 dager etter skade. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : DAB-immunhistokjemi for menneskeceller i mus hjerner. Human iPSCs var differensiert i nevrale stamceller (NSCs), neurons, eller astrocytter in vitro. Cellekulturer ble transplantert inn mus hjerner med eller uten CCI. Mus ble euthanized for histologic analyse syv dager etter celle transplantasjon. Micrographs skildre representative resultater av menneskelig kjernefysisk antigen farging. Sorte gir avbilder markører for stereologic kvantifisering av celle tall (cyan) og pode volum (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mild CCI som et modell system for testing av eksperimentell regenererende behandling
CCI-modellen er et verdifullt verktøy for å undersøke mekanismer for vevs dysfunksjon etter mekanisk skade på cortex. Justeringsevne av skaden parametrene er en attraktiv ansiktstrekk av denne modell. Endring av Z dybden av virkningen, hastigheten, eller holde tid kan øke eller redusere alvorlighetsgraden av skaden som ønsket av etterforsker10,25. Den milde CCI modell av contusive hjerneskade, når den utføres på riktig måte, bør føre til beskjeden kortikale celle død og minimal kavitasjon. Craniectomy og skallen klaff fjerning må utføres med stor forsiktighet. Overdreven nedadgående kraft påført mens boring av craniectomy grøft kan forårsake kortikale Kader på grunn av oppvarming og vibrasjon. Mekanisk forstyrrelse av Dura mater under skallen klaff fjerning nesten jevnt spår alvorlig kortikale skade. Forstyrrelse av store kortikale blodkar er sannsynlig å resultere i overdreven lesioning av cortex og er grunnlag for å ekskludere dyret fra eksperimentet. Dessverre kan tegn på en forverret skade være subtil på dagen etter operasjonen. Verken ødem eller små kortikale fartøy brudd er nødvendigvis negative indikatorer. Hematomer og unormal farge på grunn av iskemi er klarere indikatorer på kirurgiske komplikasjoner. Dokumentere intraoperativ hendelser og samkjøre komplikasjoner med histopathologic utfall er avgjørende for raffinering god craniectomy teknikk.
Det må bemerkes at mTBI modellering i dyr kommer med visse begrensninger. Det er mange prekliniske modeller av mTBI annet enn den modellen som presenteres her. Eksperimentelle TBI kan bli indusert gjennom mekaniske krefter, blast bølger gjennom luften, eller en kombinasjon av disse kreftene26,27,28. Milde til alvorlige skader blir bedømt av en kombinasjon av histopathological og atferds resultater (gjennomgått i Petraglia29 og Siebold30). Opptreden underskudd inne Red kanne løse innen dager å ukens31 mens derimot Human mTBI pasienter ' underskudd kanne vedvarer i månedsvis inne formen av stolpe-concussive Syndrome32. Selv om ingen enkelt modell er en komplett analog for klinisk mTBI, prekliniske testing avslører fysiologiske mekanismer som ikke kan vurderes i den menneskelige tilstand.
De viktigste trinnene i cellen transplantasjon prosedyren er håndtering og injeksjon av cellen suspensjon. Røff håndtering forårsaker cellelyse, som fører til utgivelsen av klebrig genomisk DNA og aggregering av de overlevende suspenderte celler. Nålen spissen diameter må være bred nok til å tillate jevn strøm av suspensjonen; begrenset flyt fører til usammenhengende levering som suspensjon sedimenter inne i nålen. Når du følger denne protokollen og unngår fallgruvene som diskuteres her, ble det vist robuste og påfølgende tilfeller etter 7-dagers overlevelses tid (Figur 4). Langsiktig pode overlevelse i en prekliniske modell er nøkkelen til å bestemme potensiell terapeutisk effekt av denne tilnærmingen.
Påføring av tapen fjerning test for å contusive hjerneskade modellering
Den selvklebende fjerning testen avslører positive nevrologiske underskudd i form av økt latency for å fjerne limet stimuli. Den største potensielle ulempen med denne testen er sannsynligheten for hemmet ytelse på grunn av faktorer som ikke er relatert til skade. Håndtering stress kan redusere mus undersøkende atferd33, så det er avgjørende at dyrene gjennomgår omfattende tilbakeholdenhet acclimation før Baseline datainnsamling. Det er viktig å fjerne vannforsyninger minst 30 min før testing for å redusere vannlating-relaterte frysing hendelser. Til slutt, det tester apparat må være renset ofte idet dyrene kanne bli distrahert i undersøkende snuse av odor stikkordene fra ukjent dyrene.
Resultatene som presenteres her viser betydelige fire motor underskudd kontralateral til mild CCI opptil 28 dager etter skade. Til sammenligning viste samtidig testing ved hjelp av sylinder test34 og akselererende rotarod3 skade induserte funksjons underskudd som ble løst i løpet av 5 – 10 dager (data ikke vist). Fjerning av selvklebende tape har blitt brukt i en rekke eksperimenter som evaluerer ensidig underskudd i Sensorimotor integrerende adferd7,35. Testen ble også nylig brukt til å vurdere motorfunksjon utvinning etter regenererende intervensjon for cervical ryggmargsskade36. Det dynamiske spekteret av ytelse på denne testen kan stilles for ventetid eller variasjon i arter ved å velge Lim med ulik styrke. Her foreslås det at 3M elektrisk tape er en optimal stimulans for mus basert på tilgjengelighet, holdbarhet, og betydelig økt ventetid for å fjerne stimuli etter mild CCI. Selv om foreløpige eksperimenter vist her ikke kombinere celle transplantasjon og atferd testing, pågående eksperimenter i laboratoriet vårt vil vurdere transplantasjon overlevelse og samtidige effekter på Sensorimotor atferdsdata utvinning fra hjerneskade på 56 dager etter transplantasjon.
Raffinement til DAB-immunodetection av menneskelige celler
DAB-immunhistokjemi ble valgt for å produsere sterk, vedvarende merking av humane celler i muse vevet for påfølgende stereologic kvantifisering. Forbehandling med hydrogenperoksid er avgjørende for å redusere uspesifisert farging i hjernevevet på grunn av endogene peroxidases i erytrocytter. Uspesifisert farging i disse eksperimentene ble ytterligere redusert ved hjelp av en mus IgG nøytralisering Kit. Dette settet bruker proprietære kjemikalier for å redusere antigenisiteten av endogene musen IgG, som kan extravasate inn i hjernevevet etter TBI37. Tidlige forsøk brukte en kombinasjon av mus anti-hNA primære antistoff, biotin-bøyd sekundære antistoffer, og streptavidin-HRP bøye tertiær merking ved hjelp av Vector Laboratories ABC Kit. ABC bøy utstilt omfattende uspesifisert DAB flekker i cortex ipsilateral til craniectomy (data ikke vist). Etterfølgende farging prøvelser ansatt sekundære antistoffer direkte bøyd med HRP. Denne modifiserte protokollen produserer høyoppløselige kjernefysiske flekker med sterkt redusert bakgrunn for alle hiPS-avledede celletyper og kirurgi forhold (Figur 4). Upubliserte eksperimenter fra dette laboratoriet ved hjelp av denne modifiserte DAB farge teknikken oppdager hNA-positive celler i mus hjerner 56 dager etter mild CCI. Overall, en binær antistoff merking prosedyre lagret tid og produsert klarere immunostaining sammenlignet med den tradisjonelle tertiær merking ABC Kit prosedyre. Denne protokollen kan være nyttig for andre prekliniske studier av menneskelige celler transplantert inn i musen sentrale nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra senter for nevrovitenskap og regenererende medisin (CNRM, Grant nummer G170244014). Vi setter pris på hjelp av Mahima Dewan og Clara Selbrede i lim fjerning pilotstudier. Kryslaine Radomski utført foreløpige hjerneskade og celle transplantasjon operasjoner. Amanda Fu og Laura Tucker av USU CNRM prekliniske Studies kjerne laboratorium gitt verdifulle råd om dyr operasjoner og atferds testing, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S.
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
