Summary
لقد قمنا بتحسين بروتوكول لعزل وتنقية البيريسيتات القلبية للمورين للبحث والتحقيق الأساسي في البيولوجيا والإمكانات العلاجية.
Abstract
ومن المعروف أن البيريسيس، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأوعية الدقيقة والشعيرات الدموية، تلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وتثبيت الأوعية، وسلامة الحاجز البطانية. ومع ذلك، وظائفها الخاصة بالأنسجة في القلب ليست مفهومة جيدا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد حاليا أي بروتوكول يستخدم مواد يسهل الوصول إليها لعزل وتنقية البيريسيتات ذات المنشأ القلبي. يركز بروتوكولنا على استخدام نموذج الثدييات المستخدم على نطاق واسع، الماوس، كمصدر للخلايا. باستخدام الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي لأنسجة القلب، حصلنا على خليط الخلايا الخام التي تم تنقيتها بشكل أكبر عن طريق تنشيط الفلورة فرز الخلايا (FACS) من قبل عدد كبير من العلامات. لأنه لا يوجد علامة واحدة لا لبس فيها لpericytes، ونحن مسور للخلايا التي كانت CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ . بعد التنقية، تم زراعة هذه الخلايا الأولية ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا والتعبير علامة. مع القدرة على الحصول بانتظام على pericytes القلب المورين الأولية باستخدام بروتوكولنا، ونأمل في مزيد من فهم دور pericytes في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية وإمكاناتها العلاجية.
Introduction
تحيط الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية المعروفة باسم pericytes بالسفن الدقيقة والشعيرات الدموية لشجرة الأوعية الدموية1،2. من الناحية الفسيولوجية، ومن المعروف أنها تعزز وتلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وزيادة سلامة الحاجز بسبب علاقتها الوثيقة مع الخلايا البطانية، فضلا عن استقرار ونضج الأوعية1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الخلل و / أو فقدان هذه الخلاياقد تورطت في أمراض مثل مرض الزهايمر 2،3 وأمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة4. توجد هذه الخلايا في جميع أنحاء الجسم بأكمله، ولكن أرقام الخلايا تعتمد على الأنسجة. وقد درست Pericytes أبرزها في الدماغ بسبب ارتفاع الأوعية الدموية من حاجز الدم في الدماغ1،2. ومع ذلك، في القلب، يتم دراسة بيولوجيا البيريكيت بشكل ناقص.
في الآونة الأخيرة، هناك مصالح متزايدة في هذا المجال لpericytes القلب، ولكن لا يوجد حاليا بروتوكول مبسط المتاحة لعزلها عن واحدة من الأدوات الأكثر استخداما في علم الأحياء - الماوس. هناك بروتوكولات في الأدب على عزل pericytes من الدماغ5, شبكية العين6, المشيمة7, والعضلات الهيكلية8,9; ومع ذلك، هناك عدد قليل من البروتوكولات على عزل pericytes من القلب. هناك العديد من المجموعات التي عزلت pericytes القلب. وقد تمكن نيس وآخرون من عزل كمية وفيرة من البيريسيتات القلبية عن أنواع متعددة بما في ذلك الفأر؛ ومع ذلك، فإن أساليبها تستخدم معدات محددة في المنزل بنيت مما يقلل من استنساخ10. Avolio et al.11,Chen et al.12,and Baily et al.13 successfullyy ayytes من أنسجة القلب البشرية, ولكن الأنسجة البشرية ليست دائما متاحة ويصعب الحصول عليها لبعض المحققين. هنا، قمنا بتطوير طريقة العزل للحصول على pericytes القلب من نماذج الماوس للمحققين لمواصلة دراسة البيولوجيا مع المواد المتاحة بسهولة.
باستخدام الهضم الأنزيمي والفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS) مع علامات البيريكيت الرئيسية المعروفة14، يسمح لنا بروتوكولنا بعزل وتنقية مجموعة من البيريكيت التي تتميز CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. تحتوي لوحة علاماتنا على علامات التضمين والاستبعاد على حد سواء. يستخدم CD45 كعلامة لاستبعاد خلايا المكونة للدم. يتم استخدام CD31 كعلامة لاستبعاد الخلايا البطانية. يستخدم CD34 كعلامة لاستبعاد كل من خلايا التبويائية وبطانة الرحم. CD146 هو علامة للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية. وأخيرا، NG2 وCD140b (المعروف أيضا باسم الصفائح الدموية المستمدة مستقبلات عامل النمو بيتا - PDGFRβ) هي علامات مقبولة على حد سواء لpericytes14. يمكن أن تكون الثقافة الأساسية التي تم الحصول عليها مستوّلة ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا أو تعبير العلامة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الخلايا مشتركة مع الخلايا البطانية لدراسة تفاعلاتها والكلام المتبادل مع بعضها البعض. هذه الطريقة عزل الخلية سوف تسمح للمحققين لدراسة البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية من pericytes القلب من نوع البرية, المرض, ونماذج الماوس متغير وراثيا.
Protocol
تم إيواء جميع الحيوانات واستخدامها في منشأة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية (AAALAC) وتم إجراء جميع الأعمال الحيوانية تحت إشراف بيطري مناسب وتحت إشراف مؤسسي وافقت لجنة الرعاية والاستخدام (IACUC) بروتوكول شركة Amgen Inc.
1. إعداد الأدوات ووسائل الإعلام الثقافية
- الأوتوكلاف الجراحية 9 سم على التوالي طرف مقص نقطة غرامة و 10 سم بزاوية ملقط مسننة.
- إضافة 25 مل من 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 5 مل من 1٪ البنسلين العقديات (P / S) في زجاجة 500 مل من الكالسيوم المغنيسيوم خالية من دولبكو الفوسفات المخزنة المالحة (CMF-DPBS). وضع الحل في حمام الجليد لضمان أنها سوف تكون باردة في وقت الاستخدام. Aliquot 50 مل في أنبوب مخروطي 50 مل لعزل القلب. إضافة في 250 وحدة / مل من محلول الصوديوم الهيبارين في aliquot 50 مل. وسوف يشار إلى ذلك باسم CMF-DPBS heparinized.
- إضافة 20٪ FBS (100 مل) و 1٪ P / S (5 مل) في زجاجة 500 مل من ارتفاع الجلوكوز Dulbecco في المتوسط النسر المعدلة (DMEM). وسوف يشار إلى هذا باسم وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم. Aliquot 20 مل من DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S وإضافة في 500 ميكروغرام / مل من الكولاجين B. وسوف يشار إلى هذا كحل الإنزيم. حافظ على كل من وسائل الإعلام الثقافية الخالية من الإنزيمات وحل الإنزيمات دافئين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي.
2. إعداد الحيوان وشراء أنسجة القلب
- حقن داخل الصفاع الماوس مع 250 وحدة من محلول الصوديوم الهيبارين مع حقنة إبرة 31 G. ثم انتظر 10-15 دقيقة بينما يبقى الماوس نشطاً في قفصه المنزلي.
ملاحظة: تم الحصول على البيانات التمثيلية في هذه الدراسة من فأر C57BL/6 ذكر يبلغ من العمر 4 أشهر. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول على أي ماوس بغض النظر عن الإجهاد، والعمر، ونوع الجنس، والوزن، الخ. - التخدير الماوس مع 5٪ isoflurane. تحقق من عمق التخدير للماوس عن طريق قرصة رد الفعل.
- ضع الماوس المُعنّص في موضع السوبين وسجّل أطرافه الأمامية. افتح تجويف الصدر بعناية وعلبة الأبهر النازل باستخدام إبرة فراشة 25 G.
- جعل شق في الأذين الأيمن وperfuse القلب مع ما لا يقل عن 20 مل من 250 وحدة / مل heparinized CMF-DPBS في 2 مل / دقيقة مع مضخة تمعجية متغير التدفق. عندما يخرج PBS من الأذين الأيمن نظيفة، وضخ كاملة.
- قطع القلب في الأبهر ووضعها في الجليد الباردة CMF-DPBS.
3. تفكك أنسجة القلب
- نقل القلب إلى 15 سم × 15 سم طبق بيتري. اقطع القلب إلى قطع صغيرة (1 مم/قطعة) باستخدام مقص الربيع وملقط النقاط الدقيقة مع محلول إنزيم يُعد ّ كافياً لتغطية القطع (10-15 مل).
- نقل القطع والحل في أنبوب مخروطي 50 مل، وختم مع فيلم من البلاستيك البارافين، وحضانة في 37 درجة مئوية على شاكر المداريفي 120 دورة في الدقيقة لمدة 75 دقيقة.
- بعد هضم الكولاجين مع محلول الإنزيم، decant السائل من خلال مصفاة خلية 100 م في أنبوب جديد 50 مل ولكن ترك ما يكفي من الحل للتأكد من أن القطع لا تجف.
- باستخدام ملقط نقطة غرامة، وإخراج الأنسجة من الأنبوب ووضع بضع قطع على شريحة المجهر. ثم طحن الأنسجة بين اثنين من الشرائح المجهر لتفريق الأنسجة. شطف الشرائح مع وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
- كرر الخطوة 3.4 حتى يتم فصل كافة قطع الأنسجة.
- الجمع بين الحلول من الخطوات 3.3-3-3.5 في أنبوب واحد. قم بإجهاد التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية بـ 100 درجة مئوية في أنبوب مخروطي جديد بـ 50 مل.
- الطرد المركزي في 220 × ز، 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا وتحقق من صلاحيتها باستخدام عداد خلية. تمييع الخلايا إلى 1 × 106 6مل مع المخزن المؤقت لتلطيخ القوات المسلحة الكونغولية الباردة التي تحتوي على 500 مل من DPBS و10−25 مل من 2−5% ألبوم مصل البقر (BSA). الخلايا على استعداد لتكون ملطخة وفرزها.
4. تنقية Pericytes من خليط الخلايا الخام باستخدام FACS
- إعداد وتسمية أنابيب FACS 5 مل لجميع الضوابط وعينات الخلية. Aliquot خارج الخلايا (1 مل من الخلايا لكل أنبوب) لعينة غير ملطخة، الفلورة ناقص واحد (FMO) الضوابط، وعناصر التحكم متساوي النمط المتطابقة. استخدم الخلايا المتبقية للفرز. يمكن إعداد جميع الضوابط والعينات وملطخة في نفس الوقت.
ملاحظه:ما مجموعه 13 مل في 0.5 × 106تم استخدام الخلايا / مل للفرز التمثيلي من قلب واحد. ومع ذلك، يعتمد الحجم على عدد الخلايا التي يحصل عليها المحقق من عزلتها، وعدد القلوب التي يستخدمونها، ومدى هضم أنسجة القلب. حجم كل قلب هو أيضا متغير التي يمكن أن تغير وحدة التخزين.- استخدام حباتالتعويض (جدول المواد) لتحسين ضوابط التعويض الفلورة. إعداد مراقبة تعويض واحدة لكل فلوروكروم في التجربة في أنبوب FACS 5 مل المسمى. لهذه التجربة، قم بإعداد ما مجموعه 9 ضوابط تعويض - نوعين من الخرز غير الملون بالإضافة إلى 7 فلوروكرومات مختلفة من لوحة العلامات بما في ذلك NG2-FITC، CD31-APC، CD140b-PE، CD146-BV605، CD34-BV421، CD45-PE-Cy7، وخلية قابلة للحياة-APC-Cy7 ( جدول المواد).
- إضافة قطرة واحدة من الخرز التعويض (~ 50 درجة مئوية) من قارورة الضغط إلى كل أنبوب. ثم إضافة 1 درجة مئوية من الأجسام المضادة إلى الخرز. كرر لكل جسم مضاد من لوحة العلامة. يُمزج المزيج بقوة بواسطة دوامة النبض. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء باستثناء حبات البقاء الخلية التي يمكن تركها في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
- بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه حبة في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم التعويض جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
- استخدام عناصر التحكم FMO لتحسين تلطيخ الخلفية بسبب التداخل الطيفي.
- إعداد عناصر تحكم FMO باستخدام 1 مل من الخلايا التي تم اقتباسها من القسم 4.1 في أنبوب FACS 5 مل وإضافة في جميع الأجسام المضادة من لوحة علامة الموضحة في الخطوة 4.1.1 في تخفيف 1:100 ولكن باستثناء جسم مضاد واحد. على سبيل المثال، قم بإعداد جهاز NG2-AF488 FMO عن طريق تضمين الأجسام المضادة لـ CD31-APC وCD140b-PE وCD146-BV605 وCD34-BV421 وCD45-PE-Cy7 وصبغة صلاحية الخلايا ولكن ليس الجسم المضاد NG2-AF488. يُمزج بلطف مع النبض. كرر لكل جسم مضاد لما مجموعه 7 عناصر تحكم. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم FMO جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
- استخدام الأجسام المضادة التحكم isotypeالمتطابقة (جدول المواد) لتلطيخ غير محدد.
- إعداد عناصر التحكم isotype عن طريق إضافة الأجسامالمضادة التحكم مطابقة isotype (جدول المواد) إلى 1 مل من عينة الخلية أعدت من القسم 4.1 في تخفيف 1:100 كل في أنبوب FACS 5 مل. يُمزج بلطف مع النبض. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم isotype جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
- إعداد الخلايا ليتم فرزها عن طريق إضافة كوكتيل الأجسام المضادة إلى الخلايا المعزولة حديثا.
- إعداد عينة الخلية من القسم 4.1 عن طريق إضافة في كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على المضادة للماوس NG2-AF488، CD31-APC، CD140b-PE، CD146-BV605، CD34-BV421، CD45-PE-Cy7 في 1:100 تخفيف كل وخلية صبغ صلاحية في 1:100 تخفيف. دوامة بلطف لخلط. عينات الحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
- بعد تلطيخ، وغسل الخلايا مع FACS تلطيخ العازلة عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق 4 درجة مئوية. استنشق قبالة الحل وإعادة تعليق بيليه الخلية في FACS تلطيخ العازلة إلى 0.5 × 106 خلايا / مل.
- باستخدام أنابيب FACS الجديدة التي لديها 35 ميكرومتر قمم التصفية، عينات الخلية الملونة ماصة على الأغطية والجاذبية filtrate للحصول على تعليق خلية واحدة. حافظ على الثلج
- استخدام حباتالتعويض (جدول المواد) لتحسين ضوابط التعويض الفلورة. إعداد مراقبة تعويض واحدة لكل فلوروكروم في التجربة في أنبوب FACS 5 مل المسمى. لهذه التجربة، قم بإعداد ما مجموعه 9 ضوابط تعويض - نوعين من الخرز غير الملون بالإضافة إلى 7 فلوروكرومات مختلفة من لوحة العلامات بما في ذلك NG2-FITC، CD31-APC، CD140b-PE، CD146-BV605، CD34-BV421، CD45-PE-Cy7، وخلية قابلة للحياة-APC-Cy7 ( جدول المواد).
- استخدام فارز الخلية لتنقية الخلايا.
- تشغيل الخلايا غير الملطخة على فارز الخلية لتعيين الفولتية وتصحيح إشارة الخلفية (على سبيل المثال، تعيين الفولتية للتشتت الأمامي إلى 490-560 ولتشتت الجانب إلى 180-250).
- تشغيل كل عينة حبة تعويض لون واحد واحد في وقت واحد لضبط الفولتية لكل قناة وضبط البوابات للإشارة الإيجابية. جمع البيانات. استخدم البرنامج لحساب التداخل الطيفي عن طريق حساب مصفوفة التعويض. جميع الفولتية جاهزة ومجموعة.
- تشغيل كل عنصر تحكم isotype واحد في كل مرة ويمكن استخدام هذه البيانات لضبط البوابات لربط غير محدد إذا كان هناك أي.
- تشغيل كل عينة FMO واحد في الوقت وضبط الفولتية لكل قناة لتصحيح لنزيف الطيفية من خلال بسبب لوحة متعددة الألوان.
- تشغيل عينات الخلية الملونة في فارز الخلية وجمع الخلايا في 10 مل وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم (DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S) في أنبوب جمع مخروطي 15 مل. استخدم استراتيجية التغرير التالية: بوابة للخلايا المفردة، وبوابة للخلايا الحية، وبوابة للخلايا السالبة CD45، وبوابة للخلايا السلبية CD34 وCD31، وبوابة الخلايا الإيجابية NG2، وأخيراً بوابة الخلايا الإيجابية CD146 وCD140b.
5. زراعة البيريكيت
- تُغطّى طبقة من 24 بئرًا مع الجيلاتين بنسبة 0.2% لمدة 5 دقائق وتستنشق محلول الجيلاتين. البذور التي تم الحصول عليها حديثا الخلايا من الخطوة 4.2.5 في DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S تصل إلى 2 × 104 خلايا / سم2. خلايا الثقافة في حاضنة الخلية تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 95٪ O2.
- تمرير من البيريكيت
- مرة واحدة في الخلايا هي 95٪ confluent، وغسل الخلايا مع DPBS 1X الدافئة، ورفع الخلايا مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ تريبسين في كل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقيقة.
- اضغط بلطف على اللوحة لتخفيف الخلايا.
- تحييد التربسين مع 3.5x كمية وسائل الإعلام الثقافة (700 μL DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S) وتمرير البذور اثنين (P2) الخلايا على لوحة غير المغلفة 6 جيدا في 2 × 104 خلايا / سم2.
- كل بئر، عندما confluent، يمكن نقلها إلى قارورة واحدة T-75 كخلايا P3 التي يمكن بعد ذلك تقسيمها بنسبة 1:6.
6. توصيف البيريكيت
-
تحليل قياس التدفق
- استخدم نفس بروتوكول تلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية واستراتيجية التغرير كما سبق وصفه في القسم 4.
- تشغيل الضوابط وعينات ملطخة على مقياس التدفق. جمع البيانات وتحليلالبيانات باستخدام برنامجالتحليل (جدول المواد).
- لجمع الصور brightfield، تنمو الخلايا في قارورة في حاضنة خلية تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 95٪ O2. التقاط الصور على المجهر بعد الخلايا تعلق على السطح.
-
الكيمياء المناعية
- تنمو الخلايا في لوحة 96 جيدا حتى 90٪ confluent. غسل الخلايا مع DPBS 1X الدافئة وإصلاح مع 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا 3X مع 1X DPBS وpermeabilize مع المنظفات 0.1٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- حضانة الخلايا مع حجب العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحظر، أضف الأجسام المضادة الأساسية (جسم مضاد واحد لكل بئر) مخففة 1:100 في حظر المخزن المؤقت والحضانة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. الأجسام المضادة الأولية هي: المضادة للNG2، المضادة للCD140b، المضادة CD31، المضادة للفيمنتين، المضادة للديسمين، ومكافحة ألفا الأكتين العضلات الملساء.
- في اليوم التالي، وغسل الخلايا3X مع العازلة غسل (جدول المواد). إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:1,000 في حظر العازلة وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الأجسام المضادة الثانوية هي المضادة للأرنب المترافقة مع FITC.
- غسل الخلايا 3X مع العازلة غسل. إضافة 300 μM وصمة عار النووية المخففة في 1:1,000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا 3X مع 1X DPBS وجبل مع تصاعد وسائل الإعلام.
- خلايا الصورة مع مجهر البؤري.
Representative Results
بعد الهضم الأنزيمي وتفكك القلب كله وقبل تنقية FACS من الخلايا، والخلايا هي خليط الخام الذي يحتوي على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من القلب (الشكل1A). بعد تنقية FACS والزراعة، والخلايا متجانسة. فهي واحدة النوى، مسطحة تماما، ولها مورفولوجيا البيريكيت rhomboid نموذجية (الشكل1B).
باستخدام FACS، يتم تنقية الخلايا إلى التجانس. يتم استخدام عينة خلية التحكم غير ملطخة لإظهاراستراتيجية gating (الشكل 2). أولاً، تم وضع بوابات للحطام ودوبلتس على أساس توزيعات التشتت الأمامي والجانبي. ثم تم بوابات الخلايا الميتة بسبب رد فعل أمين مع الصبغة التي تنتج إشارة أكبر وأكثر كثافة من الخلايا الحية. من الخلايا الحية، تم بوابات الخلايا المكونة للدم من خلال كونها CD45+. لمزيد من إزالة الخلايا المكونة للدم والبطانة، CD34+ وCD31+ تم بوابات الخلايا. وأخيرا، تم اختيار NG2+ وCD140b+/CD146+ الخلايا لكونها خلايا الأوعية الدموية مع التعبير عن علامات pericyte نموذجية (الشكل3). كما تم اختبار لوحة علامة على الخلايا البطانية التاجية الماوس كعنصر تحكم (الشكل التكميلي 1). فقط حوالي 1٪ من خليط الخلايا الخام تتكون من pericytes بعد الفرز.
للتحقق من أن الخلايا كانت في الواقع pericytes، ونحن تمرير الخلايا لمزيد من التوصيف. نمت الخلايا بسرعة بمجرد أن وصلت إلى P3 في قوارير T-75 دون تغييرات في الجدوى كما أصبحت أقدم (الشكلالتكميلي2). عند مقارنتها مع pericytes الدماغ البشري، كان الخلايا مورفولوجيا مماثلة (الشكل4A). عند مقارنتها مع الماوس وخلايا العضلات الملساء البشرية، كان الخلايا مورفولوجيا مختلفة (الشكل4A). كما لم تكن هناك أي تغييرات ملحوظة في المورفولوجيا أو التعبير علامة في P7 عندما ملطخة بالمناعة أو عن طريق تحليل قياس السيتومترية التدفق بعد تمرير (الشكل4B،C).
الشكل 1 : الخلايا الخام مقابل الخلايا النقية. (أ) صورة برايتفيلد من خليط الخلية الخام آخر القلب كله الهضم الأنزيمي والتفكك الذي تم زرعه في قارورة T25 لمدة 14 يوما. (ب) صورة لامعة من السكان متجانسة من pericytes القلب بعد الفرز والزراعة بعد 14 يوما. شريط مقياس = 100 درجة.
الشكل 2 الصور التمثيلية لتحليل FACS للخلايا غير الملطخة. التمثيل التخطيطي لاستراتيجية التجشمع المستخدمة لتنقية خليط الخلايا الخام. بوابة للخلايا التي هي واحدة، حية، CD45-، CD31-، CD34-، NG2+، CD146+، وCD140b+ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الصور التمثيلية لتحليل FACS للخلاياالخام. التمثيل التخطيطي للفرز المستخدمة للحصول على مجموعة متجانسة من pericytes القلب. ما يقرب من 1٪ من الخلايا الخام هي CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 توصيف البيريسيتات القلبية المعزولة الأولية: (أ) صور برايتفيلد للخلايا المستزرعة من الدماغ البشري (hPC) وقلوب الماوس (mPC) تظهر نفس المورفولوجيا الخلية pericyte ولكن مورفولوجيا مختلفة من خلايا العضلات الملساء البشرية hSMC) وخلايا العضلات الملساء الماوس (mSMC). شريط مقياس = 100 درجة مئوية (B) توصيف فينوتيبيك للخلايا في P7 بواسطة الكيمياء المناعية لعلامات pericyte. شريط مقياس = 100 درجة مئوية (C) تحليل عن طريق قياس التدفق للpericytes في P7 حيث تم بوابات لعلامات سلبية CD31، CD34، CD45 وعلامات إيجابية NG2، CD140b، وCD146. ولا يزال السكان متجانسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: الصور التمثيلية لتحليل قياس التدفق للخلايا البطانية باستخدام لوحة العلامات. تم استخدام خط الخلايا البطانية التاجية الماوس كتحكم في خصوصية ملزمة للعلامات. باستخدام نفس استراتيجية gating التي تم استخدامها في هذا النوع باستثناء بوابة إيجابية CD31 بدلاً من بوابة سلبية، كانت الخلايا البطانية سلبية لCD45، CD34، NG2، CD140b، و CD146 ولكن إيجابية CD31 كما هو متوقع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: صور تمثيلية لتحليل قياس التدفق للمقاطع المختلفة من MPC. تم زراعة pericytes القلب المعزولة الأولية ومرورها حتى مرور 12. كانت الخلايا ملطخة يوديد البربيديوم وتحليلها على مقياس التدفق. السيطرة على السكان هو مزيج من الخلايا الميتة والخلايا الحية. لم تكن هناك اختلافات كبيرة في عدد الخلايا القابلة للحياة بين الممرات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Discussion
وبما أن الدراسات المتعلقة بpericytes القلبية جديدة نسبياً، فإن دور البيريسيتات في علم وظائف الأعضاء القلبية الوعائية والفيزيولوجيا المرضية لم يُحدد بعد. في أجهزة أخرى، وقد ثبت أنها تلعب أدوارا رئيسية في الهومنة السفينة والتسريب1،2. بالمقارنة مع أدب pericytes من أجهزة أخرى مثل الدماغ، وهناك عدد أقل بكثير من المنشورات على pericytes القلب. إن عزل البيريسيتات القلبية أمر بالغ الأهمية لفهم خصائصها الوظيفية وآليات الإشارة. ولذلك، فإن هذا البروتوكول يوفر للمحققين طريقة أسهل للوصول إلى pericytes القلب من مصدر الأنسجة المتاحة بسهولة أكبر وتعزيز الدراسات على البيولوجيا الخاصة بهم. وسوف يساعد على الإجابة على الأسئلة حول كيفية مساهمة pericytes القلب في التوازن القلبي والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن التحقيق في إمكاناتها العلاجية.
السكان pericyte معزولة عن قلب المورين وتتميز CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ تم تمريرعدة مرات (تصل إلى P12 وكان لا يزال قويا)، والتي لا انخفاض في القدرة على البقاء وينتشر بسرعة (الشكلالتكميلي2). كما تم تجميد الخلايا بالتبريد واستعادتها مع ما لا يقل عن 95٪ من الجدوى. ومع ذلك، نحن نفضل استخدام الخلايا P7 أو أصغر لتجاربنا. مقارنة الصور brightfield من pericytes لدينا مع pericytes الدماغ البشري، وخطوط الخلية اثنين لديها مورفولوجيا الخلية مماثلة (الشكل4A)في حين أنها تختلف في مورفولوجيا من خلايا العضلات الملساء (الشكل4A). تتميز خلايا P7 لدينا بالكيمياء المناعية لعلامات pericyte، وبعضها من لوحة FACS لدينا (NG2 و CD140b)، وعدد قليل ليس في لوحة (vimentin، desmin، αSMA) ووجدنا أن الخلايا أعرب علامات pericyte متجانسة (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل خلايا P7 لدينا عن طريق قياس التدفق مرة أخرى مع نفس لوحة علامة لتقييم التغييرات في التعبير علامة بسبب تمرير ووجدنا أنه لم تكن هناك تغييرات (الشكل4C). لذلك، على حد سواء فينيولاولوجيولوجي، خلايانا هي pericytes.
وقد أظهرت الدراسات التي أجراها نيس وآخرون10وAvolio وآخرون11وChen et al.12وBaily et al.13 عزلات القلب البيريسيت الناجحة. ومع ذلك، فإن استخدام المعدات المبنية حسب الطلب في المنزل لفصل البيريسيتات عن السفن الدقيقة من قبل نيس وآخرون10 ينطوي على غرفتين مع المضخات التي تغرس محلول البروتياز ذهابا وإيابا من خلال كومة شبكة الشبكة، والتي كان من الصعب تكرارها لأنها لم يقدم تخطيطية و / أو صورة للجهاز وكيف تم بناؤه. على الرغم من أن Nees وآخرون10 عزل بنجاح pericytes القلب من العديد من الأنواع، ونحن لم تكن قادرة على إعادة إنتاج طريقتهم. لدينا خطوة مفرزة pericyte في بروتوكولنا يستخدم ببساطة شاكر المدارية (لفصل جميع الخلايا) التي تتوفر في معظم، إن لم يكن كل المختبرات، مع الأنسجة ومحلول الإنزيم في أنبوب مخروطي تليها خطوة التفكك الميكانيكية. لا يوجد جهاز مخصص مطلوب. ثانيا، تنطوي البروتوكولات المتبقية على استخدام الأنسجة البشرية، وبالتالي فإن شراء الأنسجة البشرية يقتصر على المحققين. بروتوكولنا هو تعديل وتحسين البروتوكولاتالحالية 9،12 باستخدام نماذج الماوس (نوع البرية، المعدلة وراثيا، والمرضى) والمواد التي هي متاحة بسهولة لجميع المحققين.
نظرًا لأن الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية بشكل عام حساسة، فإن بقاء الخلايا أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد. أثناء شراء أنسجة القلب وتلطيخ الخلايا، تحتاج الأنسجة / الخلايا إلى أن تبقى باردة. ثانيا، قد يتطلب الهضم الأنزيمي للأنسجة التحسين على أساس فردي. اعتمادا على وحدات النشاط على قارورة واحد من الإنزيمات، والتركيز والهضم الوقت قد تحتاج إلى الأمثل. تأكد من أن يتم إعداد الحل الأنزيمي الطازجة في كل مرة خلاف ذلك سوف ينخفض العائد. ثالثا، يحتوي الخليط الخام على الكثير من الخلايا، وبعضها ميت و/ أو يحتضر، فمن الأفضل لخفض تركيز FBS في المخزن المؤقت تلطيخ من 5٪ إلى 2٪. إذا كنت تواجه مشكلة مع الخلايا انسداد فوهة أثناء الفرز، إثراء الخلايا أولاً باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة. يمكنك أيضًا إضافة المخزن الاحتياطي EDTA/HEPES أو علاج DNase إلى فرز الخلايا المسبق لمنع تكتل الخلايا. وأخيرا، لأن لدينا لوحة من الأجسام المضادة كبيرة نوعا ما ويستخدم العديد من الفلوروفوريس، تأكد من أن يتم التحكم FMO الخاص بك وضوابط التعويض بشكل صحيح.
أحد القيود على هذه الطريقة هو كمية pericytes القلبية التي يمكن الحصول عليها لكل قلب. في حالتنا، فقط 1.1٪ من خليط نا الخام من قلب فأر واحد كانت pericytes التي هي مماثلة للنسبة المئوية في انعزالات القلب البشري، ولكن عدد الخلايا أقل بكثير بسبب كمية أنسجة القلب التي يوفرها الماوس. لأن عدد بدء الخلايا منخفضة جدا بعد FACS، سيكون من الأفضل عزل من قلوب متعددة في وقت واحد. ومع ذلك، فإن المشكلة مع ذلك هو مجرد عدد من الخلايا التي تحتاج إلى فرز من خلال في يوم واحد. إذا كان لديك أكثر من 30 مليون خلية، سيكون من الصعب الحصول من خلال هذا النوع دون التأثير على صلاحية الخلايا. إذا كان المحقق لديه عدة فرز اتّساع خلايا، فإن العزل عن قلوب متعددة في يوم واحد سيكون قابلاً للتنفيذ. قيود أخرى هي أننا لا نعرف ما إذا كان هناك مجموعات فرعية من pericytes في القلب مثل هناك العضلات الهيكلية15،16، ونحن لا نعرف ما إذا كنا القضاء على نوع فرعي في استراتيجيتنا gating. نحن في عملية وصف pericytes القلب لدينا وحتى الآن في بياناتنا غير المنشورة، فهي وظيفية مثل pericytes الأخرى في الأدب.
سيمكن بروتوكولنا المحققين من الإجابة على الأسئلة المتعلقة بخصائص القلب، والخصائص، والوظائف، والجوانب الأخرى التي من شأنها أن تساعد في تحديد مساهمتهم في التوازن القلبي وديناميكا القلب. هذه الخلايا يمكن أن يكون لها القدرة العلاجية لأمراض القلب والأوعية الدموية بمجرد فهم بيولوجيا بشكل أفضل.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا Amgen Flow Cytometry Core على مساعدتهم في تصميم لوحة الفلوروفور، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وفرز الخلايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 G butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 G needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody - FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody - APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody - BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody - BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody - PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody - PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C.
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
