Summary
Vi har optimalisert en protokoll for å isolere og rense murine CARDIAC pericytes for grunnleggende forskning og etterforskning av deres biologi og terapeutiske potensial.
Abstract
Pericytes, inflammasjon celler av microårene og blodkar, er kjent for å spille en rolle i angiogenese, fartøy stabilisering, og endothelial barriere integritet. Men deres vev-spesifikke funksjoner i hjertet er ikke godt forstått. Videre er det for tiden ingen protokoll som bruker lett tilgjengelige materialer for å isolere og rense pericytes av CARDIAC opprinnelse. Vår protokoll fokuserer på å bruke den mye brukte pattedyr modellen, musen, som vår kilde til celler. Ved hjelp av enzymatisk fordøyelsen og mekaniske dissosiasjon av hjerte vev, fikk vi en rå celle blanding som ble ytterligere renset ved fluorescens aktivere celle sortering (FACS) av en mengde markører. Fordi det er ingen enkelt utvetydig markør for pericytes, vi gated for celler som var CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Etter rensing var disse primær cellene kultivert og passert flere ganger uten endringer i morfologi og markør uttrykk. Med muligheten til å regelmessig få primære murine CARDIAC pericytes bruker vår protokoll, håper vi å ytterligere forstå rollen til pericytes i kardiovaskulær fysiologi og deres terapeutiske potensial.
Introduction
Inflammasjon celler kjent som pericytes omgir microårene og blodkar av vaskulære treet1,2. Fysiologisk, de er kjent for å fremme og spille en rolle i angiogenese, øke barriere integritet på grunn av deres nære forhold til endothelial celler samt stabilisere og modne fartøy1,2. Videre har dysfunksjon og/eller tap av disse cellene vært innblandet i sykdommer som Alzheimers sykdom2,3 og ulike kardiovaskulære sykdommer4. Disse cellene finnes i hele kroppen, men celle tallene er avhengig av vev. Pericytes har særlig blitt studert i hjernen på grunn av høy endometrial blodkar av blod-hjerne barriere1,2. Men i hjertet, er biologi av pericytes lite studert.
Nylig er det økt interesser i feltet for CARDIAC pericytes, men det er for tiden ingen strømlinjeformet protokoll tilgjengelig for deres isolasjon fra en av de mest brukte verktøyene i biologi-musen. Det finnes protokoller i litteraturen om å isolere pericytes fra hjernen5, Retina6, placenta7, og skjelettlidelser muskel8,9; Imidlertid, få protokoller er opp på isolere pericytes fra hjertet. Det er flere grupper som har isolert CARDIAC pericytes. Nees et al. var i stand til å isolere en rikelig mengde CARDIAC pericytes fra flere arter, inkludert musen; metodene brukte imidlertid spesifikke interne utstyr som reduserer reproduserbarhet10. Avolio tailored et al.11, Chen et al.12, og Baily et al.13 også vellykket isolert CARDIAC pericytes fra menneskets hjerte vev, men menneskelig vev er ikke alltid tilgjengelig og vanskelig å få tak i noen etterforskere. Her har vi utviklet en isolasjons metode for å få CARDIAC pericytes fra musemodeller for etterforskere til videre studere deres biologi med lett tilgjengelige materialer.
Ved hjelp av enzymatisk fordøyelse og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) med kjente nøkkel pericyte markører14, tillater vår protokoll oss å isolere og rense en populasjon av pericytes som er PREGET av CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. Vårt panel av markører inneholder både inkludering og ekskludering markører. CD45 brukes som en markør for å ekskludere blodkreft celler. CD31 brukes som en markør for å ekskludere endothelial celler. CD34 brukes som en markør for å ekskludere både blodkreft og endothelial stamceller. CD146 er en markør for inflammasjon celler. Endelig, NG2 og CD140b (også kjent som blodplate avledet vekstfaktorreseptor beta-PDGFRβ) er begge akseptert markører for pericytes14. Den primære kulturen innhentet kan være kultivert og passert flere ganger uten endringer i morfologi eller markør uttrykk. Videre kan disse cellene være co-kultivert med endothelial celler for å studere deres interaksjoner og crosstalk med hverandre. Denne celle isolasjons metoden vil tillate etterforskere å studere biologi og patofysiologi av CARDIAC pericytes fra vill type, sykdom, og genetisk variant mus modeller.
Protocol
Alle dyrene var huset og anvendt inne en forening for vurderingen og akkreditering av laboratorium dyr bekymre internasjonal (AAALAC) akkreditert Letter og alle dyr arbeide var gjennomførte under passende veterinary forglemmelse og under det institusjonell dyr IACUC-godkjent protokoll for Amgen Inc.
1. utarbeidelse av verktøy og kultur Media
- Autoklav kirurgisk 9 cm rett spissen fint punkt saks og 10 cm vinklet taggete tang.
- Tilsett 25 mL 5% fosterets storfe serum (FBS) og 5 mL 1% penicillin Streptomycin (P/S) inn i en 500 mL flaske kalsium magnesium gratis Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (CMF-DPBS). Sted løsning i et is bad for å sikre at det blir kaldt på tidspunktet for bruk. Alikvot 50 mL inn i et 50 mL konisk rør for hjerte isolering. Legg i 250 enheter/mL heparin natrium oppløsning i 50 mL alikvot. Dette vil bli referert til som heparinisert CMF-DPBS.
- Tilsett 20% FBS (100 mL) og 1% P/S (5 mL) inn i en 500 mL flaske med høy glukose Dulbecco ' s medium (DMEM). Dette vil bli referert til som enzymet-fri kultur Media. Alikvot 20 mL DMEM + 20% FBS + 1% P/S og tilsett i 500 μg/mL av kollagenase B. Dette vil bli referert til som enzymet løsning. Oppbevar både enzym frie kultur medier og enzym løsninger varme ved 37 ° c i en inkubator eller vannbad.
2. utarbeidelse av dyr og anskaffelse av CARDIAC tissue
- Intraperitonealt injisere en mus med 250 enheter av heparin natrium oppløsning med en 31 G nål sprøyte. Vent deretter 10 − 15 minutter mens musen forblir aktiv i hjemme buret.
Merk: Representative data i denne studien ble innhentet fra en 4 måneder gammel mannlig C57BL/6 mus. Imidlertid kan denne protokollen brukes på alle mus uavhengig av belastning, alder, kjønn, vekt, etc. - Bedøve musen med 5% isoflurane. Sjekk anestesi dybden på musen ved å klype refleks.
- Plasser anesthetized musen i liggende posisjon og tape ned sin forelimbs. Forsiktig åpne brystet hulrom og kannelerer den synkende aorta ved hjelp av en 25 G Butterfly nål.
- Lag et Nick i riktig Atrium og perfuse hjertet med minst 20 mL av 250 enheter/mL heparinisert CMF-DPBS ved 2 mL/min med en variabel-Flow peristaltisk pumpe. Når PBS kommer ut av rett Atria ren, er det komplett.
- Skjær hjertet ut ved aorta og plasser den i iskald CMF-DPBS.
3. dissosiasjon av hjerte vev
- Overfør hjertet til en 15 cm x 15 cm Petri parabolen. Skjær hjertet i små biter (1 mm/brikke) ved hjelp av våren saks og fin spiss tang med nok enzym løsning for å dekke bitene (10-15 mL).
- Overfør bitene og løsningen til en 50 mL konisk slange, tetning med para fin plastfilm og ruge ved 37 ° c på en orbital shaker ved 120 RPM i 75 min.
- Etter kollagenase fordøyelsen med enzymet løsning, Dekanter væsken gjennom en 100 μm celle sil inn i en ny 50 mL Tube men la nok løsning for å sikre at brikkene ikke tørker ut.
- Ved hjelp av fine punkt tang, ta ut vevet fra røret og plassere et par stykker på et mikroskop lysbilde. Deretter slipe vevet mellom to mikroskop lysbilder å bryte opp vevet. Skyll lysbildene med enzym frie kultur medier til en ny 50 mL konisk slange.
- Gjenta trinn 3,4 til alle vevs bitene er dissosiert.
- Kombiner løsningene fra trinn 3.3 − 3,5 til ett rør. Sil den resulterende suspensjonen gjennom en 100 μm celle sil inn i en ny 50 mL konisk rør.
- Sentrifuger ved 220 x g, 4 ° c, i 5 min. aspirer av tidligere løsning og forsiktig resuspend celle pellet i fersk enzym fri kultur Media.
- Telle celler og kontrollere levedyktighet ved hjelp av en celle teller. Fortynne celler til 1 x 106/ml med kald FACS farge buffer som inneholder 500 ml DPBS og 10 − 25 ml av 2 − 5% storfe serum ALBUMIN (BSA). Cellene er klare til å bli flekkete og sorteres.
4. rensing av Pericytes fra rå celle blanding bruke FACS
- Klargjør og Merk 5 mL FACS-rør for alle kontroller og celleprøver. Alikvot ut celler (1 mL celler per rør) for en unstained prøve, fluorescens minus én (FMO) kontroller og isotype kontroller. Bruk de resterende cellene til sorteringen. Alle kontroller og prøver kan tilberedes og beiset på samme tid.
Merk:Totalt 13 mL ved 0,5 x 106celler/mL ble brukt for representant sortere fra ett hjerte. Imidlertid avhenger volumet av hvor mange celler etterforsker henter fra isolasjonen, hvor mange hjerter de bruker, og hvor godt hjertevevet blir fordøyd; størrelsen på hvert hjerte er også en variabel som kan endre volumet.- Bruk kompensasjon perler (tabell av materialer) for å optimalisere fluorescens kompensasjon kontroller. Forbered én kompensasjons kontroll for hver fluorokromkonjugert i eksperimentet i et merket 5 mL FACS-rør. For dette eksperimentet, utarbeide totalt 9 kompensasjon kontroller-2 typer unstained perler pluss 7 forskjellige fluorokromer fra markør panelet inkludert NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, og celle levedyktighet-APC-Cy7 ( Tabell med materialer).
- Tilsett en dråpe kompensasjon perler (~ 50 μL) fra klem hetteglasset til hvert rør. Tilsett deretter 1 μL antistoff i perlene. Gjenta for hvert antistoff fra markør panelet. Bland kraftig ved puls-virvlingen. Ruge i 30 min ved 4 ° c beskyttet mot lys med unntak av celle levedyktighet perler som kan stå ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Deretter legger du til 3 mL FACS farge buffer til hvert rør og sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Aspirer av oppløsning og resuspend hver perle pellet i 400 μL av FACS farge buffer. Kompensasjons kontrollene er klare til bruk. Fortsett isen.
- Bruk FMO-kontroller for å optimere bakgrunns flekker på grunn av Spectral overlapping.
- Klargjør FMO-kontroller ved å bruke 1 mL celler som ble aliquoted fra avsnitt 4,1 i et 5 mL FACS-rør og legge til alle antistoffer fra markør panelet som er beskrevet i trinn 4.1.1 ved en 1:100 fortynning, men unntatt ett antistoff. For eksempel utarbeide en NG2-AF488 FMO ved å inkludere antistoffer for CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, celle levedyktighet fargestoff, men ikke NG2-AF488 antistoff. Bland forsiktig ved puls-virvlingen. Gjenta for hvert antistoff for totalt 7 kontroller. Ruge i 30 min ved 4 ° c beskyttet mot lys.
- Deretter legger du til 3 mL FACS farge buffer til hvert rør og sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Aspirer av oppløsning og resuspend hver celle pellet i 400 μL av FACS farge buffer. FMO-kontrollene er klare til bruk. Fortsett isen.
- Bruk isotype kontroll antistoffer (tabell med materialer) for ikke-spesifikke flekker.
- Klargjør isotype kontroller ved å legge til isotype kontroll antistoff (tabell av materialer) til 1 ml celleprøve som er klargjort fra seksjon 4,1 ved en 1:100 fortynning hver i et 5 ml FACS-rør. Bland forsiktig ved puls-virvlingen. Ruge i 30 min ved 4 ° c beskyttet mot lys.
- Deretter legger du til 3 mL FACS farge buffer til hvert rør og sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Aspirer av oppløsning og resuspend hver celle pellet i 400 μL av FACS farge buffer. De isotype kontrollene er klare til bruk. Fortsett isen.
- Forbered celler som skal sorteres ved å legge antistoff cocktail til friske isolerte celler.
- Forbered celleprøve fra § 4,1 ved å legge i et antistoff cocktail inneholder anti-mus NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 ved 1:100 fortynning hver og celle levedyktighet fargestoff ved 1:1000 fortynning. Forsiktig Vortex å blande. Ruge prøver ved 4 ° c i 30 min beskyttet mot lys.
- Etter farging, vaske celler med FACS farging buffer ved sentrifugering ved 300 x g for 5 min 4 ° c. Aspirer av oppløsning og resuspend celle pellet i FACS farge buffer til 0,5 x 106 celler/ml.
- Ved hjelp av nye FACS-rør som har 35 μm filter topper, pipette farget celleprøver på lokkene og tyngdekraften Filtrer å få enkelt celle suspensjoner. Fortsett isen.
- Bruk kompensasjon perler (tabell av materialer) for å optimalisere fluorescens kompensasjon kontroller. Forbered én kompensasjons kontroll for hver fluorokromkonjugert i eksperimentet i et merket 5 mL FACS-rør. For dette eksperimentet, utarbeide totalt 9 kompensasjon kontroller-2 typer unstained perler pluss 7 forskjellige fluorokromer fra markør panelet inkludert NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, og celle levedyktighet-APC-Cy7 ( Tabell med materialer).
- Bruk en celle sortering til å rense celler.
- Kjør de unstained cellene i celle sorteringen for å angi spenninger og korrigere for bakgrunns signalet (for eksempel angi spenninger for videre spredning til 490 − 560 og for side punktdiagram til 180 − 250).
- Kjør hver enkelt farge kompensasjon perle prøve en om gangen for å justere spenninger for hver kanal og justere portene for det positive signalet. Samle inn data. Bruk programvaren til å beregne om Spectral overlapper hverandre ved å beregne kompensasjonsmatrisen. Alle spenninger er klar og innstilt.
- Kjør hver isotype kontroll en om gangen, og disse dataene kan brukes til å justere portene for ikke-spesifikk binding hvis det er noen.
- Kjør hver FMO prøve én om gangen og justere spenninger for hver kanal for å korrigere for Spectral blø gjennom på grunn av et multi-fargepanel.
- Kjør farget celle prøvene i celle sorteringen og samle celler i 10 mL enzym frie kultur medier (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) i et 15 mL konisk oppsamlings rør. Bruk følgende gating strategi: gate for enkeltceller, gate for levende celler, gate for CD45 negative celler, gate for CD34 og CD31 negative celler, gate for NG2 positive celler, og til slutt gate for CD146 og CD140b positive celler.
5. dyrking av Pericytes
- Coat en 24-brønn plate med 0,2% gelatin i 5 min og aspirer av gelatin løsning. Seed fersk innhentet celler fra trinn 4.2.5 i DMEM + 20% FBS + 1% P/S opp til 2 x 104 celler/cm2. Kultur celler i en celle inkubator satt til 37 ° c, 5% CO2 og 95% O2.
- Passaging av pericytes
- Når cellene er 95% confluent, vask celler med varm 1x DPBS, og løft celler med 200 μL av 0,1% Trypsin i hver brønn ved romtemperatur i 3 − 5 min.
- Trykk forsiktig på platen for å løsne cellene.
- Nøytralisere Trypsin med 3,5 x mengden kultur Media (700 μL DMEM + 20% FBS + 1% P/S) og frø passasje to (P2) celler på en ubehandlede 6-brønn plate til 2 x 104 celler/cm2.
- Hver brønn, når confluent, kan flyttes inn i en enkelt T-75 kolbe som P3 celler som deretter kan deles på en 1:6 ratio.
6. karakterisering av Pericytes
-
Flow flowcytometri analyse
- Bruk samme FACS fargeprotokoll og gating strategi som tidligere beskrevet i avsnitt 4.
- Kjør kontroller og fargede prøver på strømnings flowcytometer. Samle inn data og analyser data ved hjelp av analyseprogramvaren (tabell materiale).
- Å samle brightfield bilder, vokse celler i en kolbe i en celle inkubator satt til 37 ° c, 5% CO2 og 95% O2. Ta bilder på et mikroskop etter at cellene er festet til overflaten.
-
Immuncytokjemi
- Dyrke celler i en 96-brønn plate til 90% confluent. Vask celler med varm 1x DPBS og fest med 4% paraformaldehyde i 30 min ved romtemperatur.
- Vask cellene 3x med 1x DPBS og permeabilize med 0,1% vaskemiddel i 10 minutter ved romtemperatur.
- Ruge celler med blokkerings buffer for 1 time ved romtemperatur. Etter blokkering, tilsett primære antistoffer (ett antistoff per brønn) fortynnet 1:100 i blokkerings buffer og ruge ved 4 ° c over natten. Primære antistoffer er: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentin, anti-desmin, og anti-Alpha glatt muskel utgangen.
- Neste dag, vask celler 3x med vaskebuffer (tabell av materialer). Tilsett sekundært antistoff fortynnet 1:1000 i blokkerings buffer og ruge for 2 t ved romtemperatur i mørket. Sekundært antistoff er en anti-kanin bøyd til FITC.
- Vask cellene 3x med vaskebuffer. Tilsett 300 μM kjernefysisk beis fortynnet til 1:1000 i 5 min ved romtemperatur.
- Vask cellene 3x med 1x DPBS og Monter med monterings medier.
- Bilde celler med et konfokalmikroskopi mikroskop.
Representative Results
Etter enzymatisk fordøyelse og dissosiasjon av hele hjertet og før FACS rensing av cellene, celler er en grov blanding som inneholder mange forskjellige celletyper fra hjertet (figur 1a). Etter FACS rensing og dyrking, celler er homogen. De er singel kjerne, ganske flatt, og har den typiske pericyte rhomboid morfologi (figur 1B).
Ved hjelp av FACS, celler er renset for å homogeny. Unstained kontroll celleprøve brukes til å vise gating strategien (figur 2). Først rusk og doublets var gated ut basert på fremover og side scatter distribusjoner. Da døde celler var gated ut på grunn av deres Amin reaksjon med fargestoff som produserer et signal større og mer intens enn levende celler. Av de levende celler, blodkreft celler ble gated ut ved å være CD45+. For ytterligere å fjerne blodkreft og endothelial celler, CD34+ og CD31+ celler ble gated out. Endelig, NG2+ og CD140b+/CD146+ celler ble valgt for å være inflammasjon celler med uttrykk for typiske pericyte markører (Figur 3). Markøren panelet ble også testet på musen koronar endothelial celler som en kontroll (supplerende figur 1). Bare ca 1% av råolje celle blandingen besto av pericytes etter sortering.
For å validere at cellene faktisk var pericytes, passert vi cellene for videre karakterisering. Celler vokste raskt når de nådde P3 i T-75 flasker uten endringer i levedyktighet som de ble eldre (supplerende figur 2). Sammenlignet med menneskelige hjerne pericytes, hadde cellene en lignende morfologi (figur 4a). Sammenlignet med mus og menneskelige glatte muskelceller, hadde cellene en annen morfologi (figur 4a). Det var heller ingen observerte endringer i morfologi eller markør uttrykket på P7 når immunostained eller ved flyt flowcytometri analyse etter passaging (figur 4b,C).
Figur 1 : Råolje celler versus renset celler. (A) brightfield bilde av rå celle blanding innlegg hele hjertet enzymatisk fordøyelse og dissosiasjon som har vært kultivert i en T25 kolbe i 14 dager. (B) det brightfield bildet av en homogen befolkning på CARDIAC pericytes etter sortering og dyrking etter 14 dager. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative bilder av FACS-analyse av unstained celler. Skjematisk fremstilling av gating strategien som brukes til å rense rå celle blanding. Gate for celler som er singel, Live, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+, og CD140b+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representative bilder av FACS analyse av råolje celler. Skjematisk fremstilling av sorteringen som brukes til å få en homogen befolkning på CARDIAC pericytes. Om lag 1% av råolje cellene er CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Karakterisering av primær isolert CARDIAC pericytes (A) Brightfield bilder av kulturperler celler fra hjernen (hPC) og mus hjerter (MPC) viser lignende pericyte celle morfologi, men ulike morfologi fra menneskelige glatte muskelceller hSMC) og mus glatte muskelceller (mSMC). Scale bar = 100 μm. (B) fenotypiske karakterisering av celler ved P7 ved immuncytokjemi for pericyte markører. Scale bar = 100 μm. (C) analyse av strømnings flowcytometri av Pericytes på P7 der de var gated for negative markører CD31, CD34, CD45 og positive markører NG2, CD140B og CD146. Befolkningen forblir homogen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: representative bilder av Flow flowcytometri analyse av endothelial celler ved hjelp av markør panel. En mus koronar endothelial cellelinje ble brukt som kontroll for bindingen spesifisitet for markører. Ved hjelp av samme gating strategi som ble brukt i sort bortsett fra en positiv gate for CD31 i stedet for en negativ gate, de endothelial cellene var negative for CD45, CD34, NG2, CD140b, og CD146 men positive for CD31 som forventet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: representative bilder av Flow flowcytometri analyse av ulike passasjer av MPC. Primær isolert CARDIAC pericytes var kultivert og passert opp til passasje 12. Celler ble farget med propidium iodide og analysert på en flyt flowcytometer. Kontroll befolkningen er en blanding av døde celler og levende celler. Det var ingen vesentlige forskjeller i antall levedyktige celler mellom passasjer. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
Som studier på CARDIAC pericytes er relativt ny, har rollen som pericytes i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi ennå ikke definert. I andre organer, har de blitt vist å spille nøkkelroller i fartøyet homeostase og å få1,2. Sammenlignet med litteraturen om pericytes fra andre organer som hjernen, er det betydelig færre publikasjoner om CARDIAC pericytes. Isolasjonen av CARDIAC pericytes er avgjørende for forståelsen av deres funksjonelle egenskaper og signalering mekanismer. Derfor vil denne protokollen gi etterforskere en enklere måte å få tilgang til CARDIAC pericytes fra en mer lett tilgjengelig vev kilde og fremme studier på biologi deres. Det vil bidra til å svare på spørsmål om hvordan CARDIAC pericytes bidra til hjerte homeostase og patofysiologi samt undersøke deres terapeutiske potensial.
Den pericyte befolkningen isolert fra murine hjerte og preget av CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ har vært passert flere ganger (opp til P12 og var fortsatt sterk), som ikke nedgang i levedyktighet og sprer raskt (supplerende figur 2). Cellene har også blitt cryofrozen og utvinnes med minst 95% levedyktighet. Men vi foretrekker å bruke celler P7 eller yngre for våre eksperimenter. Sammenligne brightfield bilder av våre pericytes med menneskelige hjerne pericytes, de to cellelinjer har sammenlignbare celle morfologi (figur 4a) mens de skiller seg i morfologi fra glatte muskelceller (figur 4a). Våre P7 celler var preget av immuncytokjemi for pericyte markører, noen fra vår FACS panel (NG2 og CD140b), og noen ikke i panelet (vimentin, desmin, αSMA) og vi fant at cellene uttrykt pericyte markører homogenously (figur 4b). I tillegg våre P7 celler ble analysert av Flow flowcytometri igjen med samme markør panel for å vurdere om endringer i markøren uttrykk på grunn av passaging og vi fant ut at det ikke var noen endringer (figur 4c). Derfor, både phenotypically og morfologisk, våre celler er pericytes.
Studiene av nees et al.10, avolio tailored et al.11, Chen et al.12, og Baily et al.13 har vist vellykket CARDIAC pericyte isolasjoner. Men bruken av en in-House tilpasset bygget utstyr for å løsne pericytes fra microårene av nees et al.10 involverte to kamre med pumper som perfusert protease løsning frem og tilbake gjennom en mesh netto stabel, som var vanskelig å gjenskape som de ikke gi en skjematisk og/eller bilde av apparatet og hvordan det ble bygget. Selv nees et al.10 vellykket isolert CARDIAC pericytes fra mange arter, var vi aldri i stand til å reprodusere sin metode. Vår pericyte avløsning trinn i vår protokoll bruker bare en orbital shaker (til distansere alle celler) som er tilgjengelig i de fleste, om ikke alle laboratorier, med vev og enzym løsning i et konisk rør etterfulgt av en mekanisk dissosiasjon trinn. Det er ingen tilpassede apparater nødvendig. Dernest, de resterende protokollene innebære bruk av menneskelig vev og dermed anskaffelse av menneskelig vev er begrensende til etterforskere. Vår protokoll er en modifikasjon og optimalisering av gjeldende protokoller9,12 ved hjelp av musemodeller (Wild type, genmodifiserte, syke) og materialer som er lett tilgjengelig for alle etterforskere.
Fordi inflammasjon celler generelt er følsomme, levedyktigheten av cellene er avgjørende for å få en god avkastning. Under anskaffelse av CARDIAC vev og farging av celler, vevet/cellene må holdes iskald. Dernest kan enzymatisk fordøyelse av vevet kreve optimalisering på individuell basis. Avhengig av enhetene av aktivitet på ens hetteglass med enzymer, konsentrasjon og fordøyelse tid kan være nødvendig å optimalisere. Sørg for at enzymatisk løsningen er forberedt friskt hver gang ellers yield vil avta. For det tredje inneholder råolje blandingen en rekke celler, noen døde og/eller døende, er det best å senke konsentrasjonen av FBS i farging buffer fra 5% til 2%. Hvis du har problemer med cellene tilstopping munnstykket under sortering, berike cellene først ved hjelp av en død celle fjerning Kit. Du kan også legge til EDTA/HEPES buffer eller DNase behandling til cellen pre-sort for å hindre celle klumper. Til slutt, fordi vår panel av antistoffer er ganske stor og bruker mange fluorophores, være sikker på at FMO kontroller og kompensasjon kontroller er gjort riktig.
En begrensning til denne metoden er mengden av CARDIAC pericytes som kan fås per hjerte. I vårt tilfelle var bare 1,1% av vår råolje blanding fra en mus hjertet pericytes som kan sammenlignes med prosent i menneskets hjerte isolasjoner, men antall celler er betydelig mindre på grunn av mengden av hjerte vev en mus gir. Fordi Startantall celler er så lav etter FACS, ville det være bedre å isolere fra flere hjerter samtidig. Men problemet med det er det store antallet celler som du må sortere gjennom på en dag. Hvis du har mer enn 30 000 000 celler, vil det være vanskelig å komme gjennom den typen uten å påvirke levedyktigheten til cellene. Hvis etterforsker hadde flere celle sorterere, isolere fra flere hjerter på en dag ville være gjennomførbart. En annen begrensning er at fordi vi ikke vet om det er subpopulasjoner av pericytes i hjertet som det er skjelettlidelser muskelen15,16, vi vet ikke om vi eliminerer en under type i vår gating strategi. Vi er i ferd med å karakteriserer våre CARDIAC pericytes og så langt i våre upubliserte data, de er funksjonelt som andre pericytes i litteraturen.
Vår protokoll vil gjøre det mulig for etterforskere å svare på spørsmål om CARDIAC pericyte egenskaper, egenskaper, funksjonalitet og andre aspekter som vil bidra til å definere deres bidrag til hjerte homeostase og Hemodynamics. Disse cellene kan ha terapeutisk potensial til hjerte-og karsykdommer når deres biologi er bedre forstått.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Amgen Flow flowcytometri Core for deres hjelp med fluoroforen panel design, feilsøking og celle sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 G butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 G needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody - FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody - APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody - BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody - BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody - PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody - PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C.
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
