هنا ، يتم وصف بروتوكولات لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الطاردة السماوية وعزل exoproteomes الخاصة بهم. ويجسد كلا الإجراءين خطوات رئيسية للحصول على البوليمرات أو البروتينات ذات درجات النقاء العالية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليل أو التطبيقات. ويمكن أيضا تكييفها بسهولة وفقا لاحتياجات المستخدم محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تفرز البكتيريا السماوية بنشاط مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في البيئة خارج الخلية، مثل السكريات غير المتجانسة والبروتينات. يمكن لتحديد وتوصيف هذه الجزيئات الحيوية تحسين المعرفة حول مسارات إفرازها وتساعد على التلاعب بها. وعلاوة على ذلك، فإن بعض هذه الجزيئات الحيوية مثيرة للاهتمام أيضا من حيث تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا اثنين من بروتوكولات العزل السهل والسريع للبوليمرات الكربوهيدرات المنكتيرية المفرج عنها والبروتينات. وتستند طريقة عزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة على تقنيات هطول الأمطار التقليدية من السكريات في الحلول المائية باستخدام المذيبات العضوية. تحافظ هذه الطريقة على خصائص البوليمر وتتجنب في الوقت نفسه وجود الملوثات من حطام الخلايا والثقافة المتوسطة. في نهاية العملية، البوليمر الليوفيل على استعداد لاستخدامها أو وصفها أو يمكن أن تخضع لجولات أخرى من تنقية، اعتمادا على الاستخدام النهائي المقصود. وفيما يتعلق بعزل الإكسبروتيوم السيانوبكتيري، تقوم هذه التقنية على تركيز الوسيط الخالي من الخلايا بعد إزالة الملوثات الرئيسية عن طريق الطرد المركزي والترشيح. تسمح هذه الاستراتيجية لعزل موثوق بها من البروتينات التي تصل إلى الوسط خارج الخلية عن طريق ناقلات الغشاء أو الحويصلات الغشاء الخارجي. ويمكن تحديد هذه البروتينات في وقت لاحق باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي القياسية. البروتوكولات المعروضة هنا يمكن تطبيقها ليس فقط على مجموعة واسعة من البكتيريا السماوية، ولكن أيضا على سلالات البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الإجراءات مصممة بسهولة وفقا للاستخدام النهائي للمنتجات، ودرجة النقاء المطلوبة، والإجهاد البكتيري.
المقدمة
ومن المسلم به على نطاق واسع البكتيريا السماوية كمصادر وافرة من المنتجات الطبيعية مع التطبيقات الواعدة للتكنولوجيا الحيوية / الطبية الحيوية. ولذلك، فهم آليات إفراز السيانوبكتيرية وتحسين أساليب الاستخراج / الاستعادة ضرورية لتنفيذ البكتيريا السماوية كمصانع الخلايا الميكروبية فعالة.
العديد من سلالات الخلايا القادرة على إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، التي شكلت أساسا من قبل السكريات heteropolysacrides، التي لا تزال مرتبطة سطح الخلية أو يتم تحريرها في المتوسط1. هذه البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة لها ميزات متميزة بالمقارنة مع تلك التي من البكتيريا الأخرى، والتيتجعلها مناسبة لمجموعة واسعة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. السماوية أطلقت الكربوهيدرات البوليمر العزلة
-
عزل البوليمر وإزالة الملوثات
- زراعة سلالة السيانوبكتيرية في ظل ظروف قياسية [على سبيل المثال، 30 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة (50 درجة مئويةم −2ق −1)/12 ح نظام الظلام، مع اهتزاز المداري في 150 دورة في الدقيقة]. قياس النمو باستخدام بروتوكولات قياسية [على سبيل المثال، الكثافة البصرية في 730 نانومتر (OD730nm)،الكلوروفيل أ، الوزن الجاف، وما إلى ذلك]، ثم قياس إنتاج السكريات الصادرة وفقا لطريقة حمض الفينول الكبريتيك16.
- نقل الثقافة إلى أغشية غسيل الكلى (12-14 kDa من قطع الوزن الجزيئي) وdialyze ضد ما لا يقل عن 10 مجلدات من الماء منزو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للطريقة الموصوفة لاستخراج البوليمرات الكربوهيدراتية الصادرة من الثقافات السماوية. البوليمرات المعجّلة من منتج EPS المعتدل سيانوباكتريوم سينشيوسيستينس sp. PCC 6803 ومنتج EPS الفعال Cyanothece sp. CCY 0110 مبين في الشكل 2. في الشكل 3، تظهر البوليمرات الليفيلية بدرجات مختلفة من التلوث ، مما يبرز أهمية خطوات الطرد المركزي لنقاء المنتج النهائي. يصور الشكل 4 طريقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لفهم آليات إفراز البكتيريا بشكل أفضل ودراسة المنتجات الصادرة، فمن الأهمية بمكان لإظهار العزلة الفعالة وتحليل الجزيئات الحيوية الموجودة في البيئة البكتيرية خارج الخلية (مثل الإفراج البوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات).
البوليمرات الكربوهيدرات الخلوية خارج الخلية معقدة للغاية، ويرجع ذلك أساسا إلى عدد ونسبة السكريات الأحادية المختلفة التي تشكل تكوينها1. تعتمد الطرق التقليدية المستخدمة لعزل هذه المواد البوليمرية على مفهوم بسيط بأن هذه المواد الغنية بالسكر قابلة للذوبان في ح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من صناديق الصندوق الأوروبي للمشاريع الإقليمية من خلال برنامج COMPETE 2020 - Operacional للقدرة التنافسية والتدويل، البرتغال 2020، ومن الأموال البرتغالية من خلال FCT - Fundação para a Ciência e (أ) Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the project POCI-01-0145-FEDER-028779 and grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أغشية غسيل الكلى | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | أنبوب فيسكينغ الحجم 7 ، ضياء 23.8 مم ، العرض 39-41 مم 30 م لفة ؛ |
| الإيثانول 96٪ | AGA - Á lcool e G & eacute; نيروس أليمنتيريس ، إس إيه | 4.000.02.02.00 | الإيثيلي التخمير 96٪ مرشح AGA |
| PES 0.2 & mu ؛ م | فيشر العلمي ، Lda | 15206869 | حقنة مرشح البوليسترين 33 مم 0.2 & مايكرو ؛ م STR |
| Amicon Ultra-15 ، Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | مرشحات الطرد المركزي بقطع الوزن الجزيئي الاسمي 3 كيلو دالتون |
| Thermo Scientific ؛ بيرس BCA فحص البروتين | فيشر العلمي ، Lda | 10741395 | كاشف فحص من الأخضر إلى الأزرق ، دقيق ، متوافق مع المنظفات لقياس إجمالي تركيز البروتين |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate ؛ | سيجما ألدريتش كو & iacute; ميكا SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
المراجع
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
