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Biology

Escherichia कोलाई (पी) ppGpp के कई में Vivo माप के लिए Microtiter डिश Radiolabeling का उपयोग पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/59595
Automatic Translation
1, 1
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Summary

microtiter व्यंजन में radiolabeled जीवाणु संस्कृतियों के विकास उच्च थ्रूपुट नमूना है कि न्यूक्लिओटाइड पूल बहुतायत के कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति assays की अनुमति देता है की सुविधा, की है कि (पी) ppGpp सहित. शारीरिक तनाव के स्रोतों के साथ-साथ तनाव से वसूली द्वारा उत्तेजित विकास संक्रमण के प्रभाव पर नजर रखी जा सकती है।

Abstract

(च) पीपीजीपी न्यूक्लिओटाइड विभिन्न प्रकार के शारीरिक और पोषण संबंधी तनाव के प्रत्युत्तर में बैक्टीरिया में एक वैश्विक नियामक के रूप में कार्य करता है। यह एक तेजी से शुरुआत है, सेकंड में, जो स्तर है कि दृष्टिकोण के संचय की ओर जाता है या GTP पूल के उन से अधिक है. तनाव उत्क्रमण अवसरों के एक तेजी से गायब (पी) ppGpp, अक्सर एक मिनट से भी कम समय के एक आधे जीवन के साथ. की उपस्थिति (पी) ppGpp सेलुलर जीन अभिव्यक्ति और चयापचय है कि तनाव के हानिकारक प्रभाव का मुकाबला के परिवर्तन में परिणाम. ग्राम-ऋणात्मक और ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में अलग-अलग प्रतिक्रिया तंत्र होते हैं, लेकिन दोनों (च) पीपीजीपी एकाग्रता पर निर्भर करते हैं। किसी भी घटना में, वहाँ एक साथ समय अंतराल है कि महत्वपूर्ण तनाव संक्रमण अवधि के दौरान घंटे के लिए 10 सेकंड से भिन्न हो सकते हैं पर कई radiolabeled जीवाणु संस्कृतियों की निगरानी की जरूरत है. यह प्रोटोकॉल इस तकनीकी चुनौती को संबोधित करता है. विधि तापमान का लाभ लेता है- और शेकर नियंत्रित microtiter पकवान इनक्यूबेटर कि विकास के समानांतर निगरानी की अनुमति (अवशोषण) और समान रूप से फॉस्फेट-radiolabeled संस्कृतियों के तेजी से नमूने को हल करने और मात्रात न्यूक्लिओटाइड पूल द्वारा पीई-सेलूलोज़ पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी। विश्लेषण के कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति के लिए नमूने की छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है। जटिल विकास संक्रमण, जैसे कि डाइऑक्सिक वृद्धि और तेजी से (पी) पीपीजीपी कारोबार दरों को इस विधि द्वारा मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।

Introduction

(च) पीपीजीपी दूसरा दूत एक वैश्विक नियामक है जो राइबोसोम और एमिनो अम्ल1,2के संश्लेषित करने के लिए जीनों सहित बड़ी संख्या में जीनों की अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करता है। यद्यपि प्रारंभ में एस्चेरीचिया कोली3में खोज की गई थी , (च) पीपीजीपीपी ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया तथा पादप क्लोरोप्लास्ट4,5दोनों में पाया जा सकता है । ई. कोलाई और अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए, (च) पीपीजीपी दोअलग-अलग स्थलों 6,7,8पर आरएनए पॉलिमरेज के साथ सीधे सूचना का आदान-देना करता है। ग्राम पॉजीटिव्स में,(च) पीपीजीपी जी.टी.पी. बहुतायत को रोकता है, जिसे कोडी द्वारा महसूस किया जाता है, जीन-विशिष्ट डीएनए मान्यता रूपांकनों के साथ एक जीटीपी-बाध्यकारी प्रोटीन जो विनियमन9,10का नेतृत्व करता है। (च) पी.पी.जी.पी.पी. विभिन्न पोषक तत्वों और तनाव की स्थितियों के लिएभुखमरी के प्रत्युत्तर में जमा होता है, जिसके परिणामस्वरूप धीमी वृद्धि और जीन अभिव्यक्ति का समायोजन होता है जिससे अनुकूलन 11,12पर दबाव डालसकत है।

ppGpp संचित की शुद्ध राशि synthetase और hydrolase गतिविधियों के बीच एक संतुलन को दर्शाता है. ई. कोलाई RelA में एक मजबूत synthetase है और SpoT द्विआयामी है, एक मजबूत hydrolase और एक कमजोर synthetase के साथ, जिनमें से प्रत्येक एक तनाव निर्भर तरीके से अलग ढंग से विनियमित किया जा सकता है. मजबूत RelA सिंथेटाज सक्रिय है जब codon-निर्दिष्ट आरोप लगाया tRNA की उपलब्धता ribosomal ए साइट के लिए बाध्य जब यह प्रोटीन संश्लेषण की मांग के साथ रखने में विफल रहता है13,14,15. कमजोर SpoT (पी) ppGpp synthetase सक्रिय है, जबकि मजबूत (पी) ppGpp hydrolase अन्य तनाव की स्थिति के जवाब में और अन्य तंत्र के माध्यम से बाधित है. कुछ परिस्थितियों में एसीपी या रु.डी जैसे प्रोटीन स्पोट से बाँध सकते हैं, जो हाइड्रोलिसिस और संश्लेषण16,17के बीच का संतुलन भी बदल सकते हैं. ग्राम पॉजिटिव में, संश्लेषण और हाइड्रोलिसिस मजबूत संश्लेषण और hydrolysis गतिविधियों के साथ एक एकल RelA SpoT homolog (RSH) प्रोटीनके साथ ही छोटे hydrolases और /

(पी) पीपीजीपी न्यूक्लिओटाइड को पहले असामान्य 32पी लेबल स्पॉट के रूप में खोजा गया था जो एमिनो एसिड भुखमरीसे प्रेरित कड़ी प्रतिक्रिया के दौरान पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) के ऑटोरेडियोग्राम पर दिखाई दिया था। अधिक विस्तृत लेबलिंग प्रोटोकॉल की समीक्षा कीगई है . यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (चित्र 1) इन प्रोटोकॉलों का एक संशोधन है जो माइक्रोटिटर प्लेटों पर एकाधिक नमूनों के विकास की निगरानी की अनुमति देता है। यह (पी) पीपीजीपी बहुतायत परिवर्तन के कई जैविक और तकनीकी अनुमानों को सुविधाजनक बनाने और शुरू में diauxic बदलाव19के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. की लेबलिंग (पी) ppGpp 32पी और टीएलसी द्वारा पता लगाने के साथ भी की माप की अनुमति देता है (पी) ppGpp गिरावट दर. वैकल्पिक तरीकों को निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है (पी) ppGpp स्तर जैसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, HPLC20, फ्लोरोसेंट chemosensors21,22, और GFP जीन संलयन ppGpp23से प्रभावित प्रमोटरों के लिए, 24. फ्लोरोसेंट कीमोसेन्सर वर्तमान में बाइंडिंग पीपीजीपीपी के बाद छोटे वर्णक्रमीय बदलावों के साथ-साथ पीपीजीपी और पीपीपीपीपी21के बीच अंतर करने वाली समस्याओं के कारण सीमित उपयोग होता है . इस विधि का पता लगाने के लिए कुशल है (p) ppGpp इन विट्रो में, लेकिन सेलुलर अर्क में नहीं. HPLC शामिल तरीकों में सुधार किया गया है20 लेकिन महंगा उपकरणों की आवश्यकता होती है और अच्छी तरह से उच्च के माध्यम से डाल करने के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं. अंत में, GFP संलयन ppGpp निर्भर सक्रियण या निषेध का एक अनुमान दे सकते हैं, लेकिन ppGpp ही उपाय नहीं है. जबकि इन वैकल्पिक तरीकों में से प्रत्येक मूल्यवान हैं, वे महंगा उपकरण या पर्याप्त हाथ समय पर की आवश्यकता होती है, या वे अन्यथा कई गतिज नमूना और बाद में प्रसंस्करण के लिए अनुकूल नहीं हैं. विधि यहाँ वर्णित के साथ, 96 नमूने के बारे में में छह टीएलसी प्लेटों के लिए लागू किया जा सकता 20 मिनट (प्रति प्लेट 18 नमूने), घंटे के एक जोड़े से भी कम समय में टीएलसी विकास द्वारा हल, मात्रात्मक डेटा के साथ कई घंटे या रात भर के बाद प्राप्त की, लेबलिंग के आधार पर तीव्रता.

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Protocol

1. मीडिया तैयारी

  1. MOPS के लिए (3-(N-morpholino)propanesulfonic एसिड) मीडिया25, 10x MOPS लवण के 1/10 मात्रा का उपयोग करें, 100x माइक्रोन्यूट्रेंट्स समाधान के 1/100 मात्रा, रात भर संस्कृतियों के लिए 3 एम सोडियम फॉस्फेट या 32पी के साथ वर्दी लेबलिंग के लिए 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट, 0.2% ग्लूकोज और 1 $g/एमएल थायमिन (विटामिन बी 1)। यदि आवश्यक हो तो 40 ग्राम/एमएल पर एमिनो अम्ल जोड़ें।
    1. एमओपीएस लवणों के लिए 400 एमएम एमओपीएस, 40 एमएम ट्राइसीन, 0.1 एमएम फेसो4,95एमएम एनएच4सीएल, 2.6 एमएम के2 एसओ4,5 डिग्री एम सी सीएल2,10.56 एमएम एमजीसीएल2और 500 एमएम नैकल का उपयोग करें। वर्षण से बचने के लिए लिखे गए क्रम में विभिन्न घटकजोड़ें. KOH के साथ पीएच 7.4 करने के लिए समायोजित करें और निस्पंदन द्वारा बाँझ।
    2. 100x सूक्ष्म पोषक घोल के लिए 3 डिग्री एम (एनएच4)6(एमओ7)24,0.4 एम एम एच3बो4, 30 डिग्री सेल्सियस ब्युस 2 , 10 डिग्री सेल्सियस क्यूएसओ4, 80 जेडएम एम एम एम सीएल2, और 10 डिग्री एम एन एस ओ4का उपयोग करें . ऑटोक्लेव द्वारा बंध्याकरण।
    3. ग्लूकोज के लिए (20%) और सोडियम फॉस्फेट (300 एमएम) समाधान, autoclaving द्वारा अलग 100x स्टॉक के रूप में बाँझ. निस्पंदन द्वारा थायमिन और एमिनो एसिड मिश्रण के 100x स्टॉक स्टरलाइज़ करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए बाँझ स्टॉक समाधान से नए मीडिया तैयार करें।

2. 32पी के साथ लेबलिंग

  1. 3 एमएम सोडियम फॉस्फेट के साथ MOPS मीडिया में रातोंरात संस्कृतियों हो जाना.
  2. एक 24 अच्छी प्लेट में, एमओपीएस मीडिया के 550 डिग्री एल में 0.2 एम एम सोडियम फॉस्फेट वाहक और प्रत्येक बैक्टीरियल इनोकुलम (डिल्यूशन 1/ यह ओओडी600nm 0.1 के एक प्रारंभिक inoculum का उत्पादन होगा. एक बाँझपन नियंत्रण के रूप में ताजा मीडिया के साथ एक अच्छी तरह से प्रयोग करें.
  3. प्लेट को 30 मिनट के लिए 900 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए प्लेट को रखें। संस्कृति को नीचे से गर्म किया जाता है और मिलाते हुए वातन प्रदान करता है। झुकाव या फैल से बचने के लिए टेप के साथ मजबूती से प्लेट संलग्न करें। विकास की निगरानी मीडिया में समानांतर में एक प्रतिकृति प्लेट के साथ की जा सकती है जिसमें 32पी की कमी होती है जिसमें प्लेट रीडर का उपयोग किया जाता है और एक ही परिस्थितियों में इनक्यूबेटिंग की जाती है।
  4. 32पी ऑर्थोफॉस्फेट (20 डिग्री सेल्सियस से 5 mCi/mL स्टॉक) के प्रत्येक कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    नोट: रेडियोधर्मिता की मात्रा भी प्रयोगात्मक जरूरतों को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. कम बेसल स्तर के लिए 100 0.2 लाख वाहक फॉस्फेट के साथ अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन मापने के लिए (पीजीपीपी स्तर है कि GTP पूल के बराबर बनने की उम्मीद कर रहे हैं, लेबल करने के लिए गिरा दिया जा सकता है 25 या 50 $Ci. 0.2 मीटर से नीचे वाहक फॉस्फेट को कम करने के लिए फॉस्फेट के स्तर को विकास के लिए सीमित बनने से बचने के लिए अनुशंसित नहीं है।
    चेतावनी: 32पी एक $ उत्सर्जन आइसोटोप है तो सुरक्षा के लिए निर्दिष्ट उचित परिरक्षण का उपयोग करें. सभी रेडियोधर्मी सामग्री सभी संभव सावधानियों को ध्यान में रखते हुए ठीक से निपटा जाना चाहिए।
  5. तनाव को प्रेरित करने से पहले बाह्य लेबल को इंट्रासेल्यूलर न्यूक्लिओटाइड पूल के साथ काफी हद तक बराबर करने की अनुमति देने के लिए 1 से 2 दोहरीकरण (1 ज या उससे अधिक) के लिए मिलाते हुए इनक्यूबेटर में आगे बढ़ें।

3. तनाव या भुखमरी का प्रेरण

  1. अपने को चुनने की एक विधि का उपयोग कर तनाव को प्रेरित, तनाव का अध्ययन की तरह के आधार पर, जैसे चयापचय मार्ग inhibitors जोड़ने, तापमान बदलने, आवश्यक पोषक तत्वों थकाऊ, osmolarity बदलाव स्थानांतरण, ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित, विषाक्त पदार्थों को जोड़ने, आदि.
    1. उदाहरण के लिए, ई. कोलाई K-12 उपभेदों में isoleucine भुखमरी प्रेरित करने के लिए 100 g/mL L-valine जोड़ें. ppGpp के स्तर में वृद्धि प्रेरण के 5 मिनट के बाद मनाया जाएगा.

4. नमूना और ppGpp निष्कर्षण

  1. 0ण्2 एमएल पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक लेबल वाले सेल नमूने का 20 डिग्री सेल्सियल मिलाकर बर्फ की ठंड 6 एम फोर्मिक अम्ल का 20 डिग्री सेल्सियस होना शामिल है।
  2. नमूनों को तुरंत सूखी बर्फ में रखें।
  3. ठंड और thawing के 3 चक्र से सेलुलर निष्कर्षण दक्षता में वृद्धि.
  4. बस पाई सेलूलोज़ पतली परत क्रोमैटोग्राम को स्पॉट करने से पहले, अधिकतम गति पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज के नमूने गोली सेल मलबे के लिए यह क्रोमैटोग्राम पर खोलना से बचने के लिए।

5. पतली परत क्रोमैटोग्राफी

  1. एक नरम पेंसिल के साथ, कैंची के साथ शीर्ष से 5 सेमी हटा दिया गया है कि 20 सेमी x 20 सेमी PEI-Cellulose टीएलसी प्लेट के किनारे से एक मूल लाइन 1 सेमी चिह्नित करें। प्रत्येक नमूने के लिए PEI सतह में एक छोटी बूंद के रूप में 5 $L लागू करें। इस स्थान को सूखने की अनुमति दिए बिना आरोही विकास शुरू करें, जो धारियों को कम करके संकल्प में सुधार करते हैं।
  2. 1.5 M KH2PO4 (pH 3.4) समाधान इतना उथले इतना है कि तरल मूल नमूना स्थान को छूने नहीं करता है की एक परत के साथ एक टैंक में आरोही विकास करते हैं। एक हवा तंग सील के साथ टैंक कवर और छंटनी की चादर, 15 सेमी के शीर्ष करने के लिए तरल चढ़ाई की अनुमति देते हैं। 1.5 M KH2PO4 समाधान के लिए पीएच 3.4 प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है H3PO4के अलावा पीएच समायोजित करें।
  3. कमरे के तापमान पर पूरी तरह से विकसित क्रोमैटोग्राम और हवा सूखी निकालें।
  4. रेडियोएक्टिव कचरे में फ्री 32पी युक्त क्रोमैटोग्राम के ऊपर (पीएच फ्रंट) भाग को काटकर छोड़ दें। इस भाग चित्रा 2 में पीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है और आसानी से यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की है. यदि केवल (p)ppGpp न्यूक्लिओटाइड जो जीटीपी की तुलना में धीमी गति से स्थानांतरित करते हैं, तो यह एक यूवी-दृश्य जीटीपी मानक को चलाने और फिर एक बड़े ऊपरी हिस्से को काटने और छोड़ने की सिफारिश की जाती है (जीटीपी के ऊपर कुछ भी, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है)।
  5. एक फॉस्फोर स्क्रीन के साथ रात भर autoradiographic फिल्मों का पर्दाफाश.
  6. फिल्म का विकास करना। फॉस्फोइमेजर के साथ फॉस्फोर स्क्रीन सिग्नल को कैप्चर और परिमाणित करें।

6. (च) पीपीजीपी की मात्रा

  1. छवि J26,27के साथ क्वांटिट रेडियोधर्मी धब्बे .
    नोट: (च) पीपीजीपी की मात्रा को प्रत्येक नमूने में पाए गए जी न्यूक्लियोटाइडों की कुल मात्रा में सामान्यीकृत किया जा सकता है (चित्र2)। यदि पृष्ठभूमि की मात्रा सजातीय है, तो पृष्ठभूमि के लिए सही करने के लिए एक एकल रिक्त (चित्र 2से बॉक्स 4) घटाया जा सकता है। कुल जी GTP + ppGpp + pppGpp का पता लगाया का योग है. यह सामान्यीकरण मानता है कि जीएमपी और सकल घरेलू उत्पाद का स्तर नगण्य है, जो ई. कोलाईके लिए सच है। दिए गए न्यूक्लिओटाइड का योग जी का अनुपात अनुप्रयुक्त प्रतिदर्श आयतन की विविधताओं को ठीक करने का एक महत्वपूर्ण तरीका प्रदान करता है।

7. पीपीजीपी क्षय की दर का मापन

नोट: इस प्रोटोकॉल का एक संशोधन ppGpp क्षय दरों की माप की अनुमति देता है.

  1. एक समय के लिए तनाव या भुखमरी उत्तेजक के बाद पर्याप्त ppGpp संचय की अनुमति देने के लिए (चरण 3), तनाव रिवर्स क्रम में जारी ppGpp संश्लेषण ब्लॉक करने के लिए, जो hydrolytic दरों का पता लगाने की अनुमति देता है. उत्क्रमण के लिए प्रक्रिया तनाव पर निर्भर करेगा. उदाहरण के लिए, किसी भी एमिनो एसिड भुखमरी को उलटने के लिए क्लोरएम्फेनिकॉल का 200 ग्राम/एमएल जोड़ें।
  2. क्षय दर आमतौर पर तेजी से कर रहे हैं, लेकिन भिन्न हो सकते हैं, तो नमूने ले हर 20-30 एस अप करने के लिए 2 मिनट. चरण 4 में के रूप में प्रक्रिया के नमूने.
  3. एक बार टीएलसी विकसित किया जाता है (चरण 5 में के रूप में) और समय पाठ्यक्रम के दौरान प्राप्त ppGpp के स्तर, एक अर्द्ध लघुगणक साजिश बनाम समय पर अवशिष्ट ppGpp सामग्री साजिश क्षय के शून्य आदेश दरों के दृश्य की अनुमति देने के लिए, एक सीधी रेखा के रूप में, और ppGpp आधा जीवन का अनुमान.

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Representative Results

ई. कोलाई K-12 उपभेदों में, valine के अलावा isoleucine के एक अंतर्जात भुखमरी भड़काती है, जो 5 मिनट3के बाद ppGpp के स्तर की वृद्धि का परिणाम है. आई एल वी को छोड़कर सभी अमीनो अम्लों वाले एमओपी में उगाए गए कोशिकाओं को चित्र 1में दर्शाए अनुसार 32च के साथ लेबल किया गया था। एक बार लेबल किए जाने पर, 10 मिलीग्राम/एमएल एल-वेलीन (100 ग्राम/एमएल अंतिम सांद्रता) का 6 डिग्री एल आइसोल्यूसीन भुखमरी उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया था। नमूने valine के अलावा के बाद 0 और 5 मिनट लिया गया. 5 मिनट के बाद (चित्र 3A),एक 2 और 2.5 गुना ppGpp और pppGpp के स्तर में वृद्धि हुई. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक सेल मुक्त लेबल नमूना संभव यौगिकों कि 32पी स्रोत में ऑर्थोफॉस्फेट नहीं थे का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ppGpp कमी तनाव सहित (relA ]spoT) स्थानों की बेहतर पहचान में मदद कर सकता है.

isoleucine भुखमरी के रिवर्सल chloramphenicol, प्रोटीन संश्लेषण के एक अवरोधकरनेवाला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो आरोप लगाया ile-tRNA की खपत कम कर देता है और बदले में, uncharged tRNA करने के लिए चार्ज के उच्च अनुपात पुनर्स्थापित करता है. मजबूत RelA-मध्यस्थ ppGpp synthetase के सक्रियण समाप्त कर दिया है, जो अवशिष्ट संश्लेषण द्वारा unperturbed ppGpp गिरावट के एक उपाय की अनुमति देता है. इसलिए, भूखे संस्कृतियों में 200 ग्राम/एमएल क्लोरएम्फेनिकॉल जोड़ा गया और उसके बाद 20 अंतराल ों पर नमूने लिए गए। इस स्थिति में, पीपीजीपीपी लगभग 64 एस के आधे जीवन के साथ क्षय हो गया (चित्र 3ख)।

Figure 1
चित्र 1: TLC वर्कफ़्लो द्वारा ppGpp का मापन. प्रोटोकॉल के Schematic प्रतिनिधित्व ppGpp निकालने के लिए जीवाणु संस्कृतियों फार्म और टीएलसी द्वारा इसके पीछे का पता लगाने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि टीएलसी विश्लेषण. ऑटोरेडियोग्राफी और फॉस्फोर स्क्रीन के बाद प्राप्त परिणामों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व टीएलसी के साथ रात भर। मापा जा करने के लिए स्पॉट लाल रंग में दिखाए जाते हैं। ppGpp के आंशिक राशि की गणना करने के लिए सूत्र भी दिखाया गया है. कुल G GTP + ppGpp + pppGpp नमूना में पता चला की कुल राशि को संदर्भित करता है. पीले बैंड यूवी प्रकाश के तहत दिखाई पीएच सामने प्रतिनिधित्व करते हैं। कैंची संकेत मिलता है जहां हम रेडियोधर्मिता के अधिकांश discarding के लिए क्रोमैटोग्राम काटने की सलाह देते हैं. तीर 1.5 एम फॉस्फेट बफर के साथ आरोही विकास के दौरान प्रवाह की दिशा को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीपीजीपी के संश्लेषण और क्षय का माप। (क) नमूने के लिए टीएलसी द्वारा पीपीजीपीपी की जांच 0 और 5 मिनट के लिए valine के अलावा के बाद. जीटीपी, पीपीपीपी और पीपीपीपी से संबंधित स्पॉट चिह्नित किए गए हैं। एक सेल मुक्त संस्कृति नकारात्मक नियंत्रण (सी) के रूप में शामिल किया गया था. (बी) एमिनो एसिड भुखमरी को रिवर्स करने के लिए क्लोरामफेनिकॉल के अलावा पीपीजीपी का क्षय। ppGpp आधा जीवन डॉटेड लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व घातीय क्षय दर से निर्धारित किया जाता है. त्रुटि पट्टियाँ SD डुप्लिकेट से प्रतिबिंबित करें। Y-अक्ष एक अर्ध-लघुविज्ञान (लॉग2) पैमाने में प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कोशिकाओं की समान लेबलिंग के निकट प्राप्त करना इस प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, परिभाषित मीडिया, जैसे MOPS या Tris मीडिया का उपयोग, वाहक फॉस्फेट सांद्रता और विशिष्ट गतिविधि की भिन्नता की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है. फॉस्फेट बफ़र मीडिया, जैसे M9 या मीडिया A, का उपयोग नहीं किया जा सकता. अधिकांश अपरिभाषित मीडिया में फॉस्फेट की चर मात्रा होती है, जैसे एलबी, ट्रिप्टोन और कासमिनो एसिड। फॉस्फेट आइसोटोप 33पी एक कमजोर उत्सर्जक है जिसे प्रतिस्थापन के 32पी लाभ के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यह सुरक्षित है और 32पी के लिए 14 दिनों के बजाय 25 दिनों का आधा जीवन है। हालांकि, 32पी के अधिक ऊर्जावान उत्सर्जन काफी पता लगाने संवेदनशीलता में वृद्धि. आइसोटोप के साथ काम करने के खतरों और उचित परिरक्षण सुरक्षा और निपटान का उपयोग करने के महत्व पर जोर देना महत्वपूर्ण है। एक riboswitch की हाल ही में खोज विशेष रूप से ppGpp28 का पता लगाने में सक्षम किसी दिन एक सुरक्षित तरीका इन विट्रो में और विवो में ppGpp का पता लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, अन्य विधियाँ मौजूद हैं, यद्यपि फॉस्फेट लेबलिंग का उपयोग जीवाणु (पीजीपीपी के साथ-साथ अन्य फॉस्फेट लेबल वाले यौगिकों, जैसे रिबो- या के माध्यम से माप के लिए एक संवेदनशील, प्रत्यक्ष और त्वरित दृष्टिकोण बना हुआ है deoxyribo-NTP पूल, पीआरपीपी, पीपीआई या चीनी फॉस्फेट।

एक अन्य महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि समानांतर संस्कृतियों (शेकिंग इनक्यूबेटर और प्लेट रीडर) का विकास समान है। पोषक तत्व थकावट का अध्ययन करते समय, जैसे डाइऑक्सिक शिफ्ट19,संस्कृतियों के बीच तुल्यकालन महत्वपूर्ण है। लेबल और unlabeled प्लेटों पर विकास की तुलनीयता अन्यथा रेडियोधर्मी प्लेट पर एक unlabeled अच्छी तरह से OD600 माप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. परीक्षण नमूनों की संख्या बढ़ाने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता 19, लेकिन वाष्पीकरण को कम करने के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा संस्कृति वातन कम हो जाएगा. (च) ppGpp के बेसल स्तर कम वातन के कारण एक 24 अच्छी तरह से थाली की तुलना में एक 96 अच्छी तरह से थाली में वृद्धि के दौरान थोड़ा अधिक हो जाएगा. इसलिए, बेसल के स्तर को मापने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली विकास की सिफारिश की है. अधिक दृढ़ता से प्रेरित (पी) ppGpp स्तर की विविधताओं को मापने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली पसंद किया जाता है. 24 और 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों के बीच चुनाव प्रयोगात्मक लक्ष्य पर निर्भर करता है.

इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों में तनाव की विभिन्न स्थितियों के लिए कई संभावित अनुप्रयोग होते हैं। हाल ही में हम इसे ग्लूकोज से लैक्टोज करने के लिए और अन्य वैकल्पिक शर्करा के लिए शास्त्रीय diauxic बदलाव के दौरान ppGpp के संचय और क्षय को मापने के लिए लागू किया है. इन अध्ययनों से पता चला है कि ग्लूकोज भुखमरी और एमिनो एसिड भुखमरी दोनों की भागीदारी19. यहाँ हम एक सरल और अच्छी तरह से अध्ययन तनाव की स्थिति3के रूप में ई. कोलाई K12 उपभेदों में valine द्वारा प्रेरित एमिनो एसिड भुखमरी का वर्णन 3 . इस उदाहरण के और अधिक जटिल भुखमरी स्थितियों प्रदर्शन करने से पहले एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एमिनो एसिड भुखमरी एक आवश्यक एमिनो एसिड है कि विकास के दौरान समाप्त हो जाता है की सीमित मात्रा में जोड़कर उकसाया जा सकता है; tRNA एमिनोऐसिअलेशन या संश्लेषण (सीरीन हाइड्रेक्सामेट, मपिरोसिन, या 3-aminotriazole) के एक अवरोधक जोड़ने या ई. कोलाई K12 के लिए isoleucine की अनुपस्थिति में valine जोड़ने). Serine hydroxamate अक्सर tRNASer aminoacylation को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन उच्च सांद्रता की आवश्यकता है, जो अन्य यौगिकों के साथ hydroxamate प्रतिक्रिया के कारण समस्याओं का कारण हो सकता है. serine hydroxamate प्रभाव की एक बड़ी मात्रा में जोड़ने के द्वारा रिवर्सल गैर वांछित प्रभाव हो सकताहै 1. हालांकि SHX ppGpp उत्पादन के एक नैदानिक के रूप में प्रभावी साबित हो गया है, हम शारीरिक अध्ययन के लिए इसके उपयोग की सिफारिश नहीं एमिनो एसिड भुखमरी का उत्पादन, क्योंकि सामान्य (पीजीपीपी प्रतिक्रिया तंत्र समाप्त कर रहे हैं, जैसे शारीरिक परिणामों के रूप में अनावश्यक गतिविधियों को कम करने लेकिन तनाव अस्तित्व नियामक सर्किट के सक्रियण की अनुमति.

यहाँ वर्णित टीएलसी प्रक्रियाओं के संशोधन के लिए ठीक से noncanonical नियामक न्यूक्लिओटाइड अलग करने के लिए आवश्यक हैं, जैसे (पी) ppApp29,के साथ मिश्रित नमूनों से (पी)ppGpp. यह दिखाया गया है कि pppApp इन विट्रो30,31में PPP के लिए एक विरोधी भूमिका है ; इसलिए, भविष्य के अध्ययन के लिए दोनों यौगिकों के बेहतर पृथक्करण की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध Intramural अनुसंधान कार्यक्रम, यूनिस कैनेडी Shriver राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान, NIH का समर्थन किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)6(MO7)24 Fisher Scientifics A-674
Autoradiography film Denville scientific inc. E3218
CaCl2 J.T.Baker 1-1309
Chloramphenicol RPI C61000-25.0
CoCl2 Fisher Scientifics C-371
CuSO4 J.T.Baker 1843
FeSO4 Fisher Scientifics I-146
Formic acid Fisher Biotech BP1215-500
Glucose Macron 4912-12
H3BO4 Macron 2549-04
H3PO4 J.T.Baker 0260-02
K2SO4 Sigma P9458-250G
KH2PO4 Fisher Biotech BP362-500
L-Valine Sigma V-6504
MgCl2 Fisher Scientifics FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT Biotek Synergy HT
MnCl2 Sigma M-9522
MOPS Sigma M1254-1KG
Na2HPO4 Mallinckrodt 7892
NaCl J.T.Baker 3624-01
NaH2PO4 Mallinckrodt 7917
NH4Cl Sigma A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) Perkin Elmer NEX053005MC
Storage phosphor screen Kodak So230
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Thiamine Sigma T-4625
TLC PEI Cellulose F Merk-Millipore 1.05579.0001
Tricine RPI T2400-500.0
Typhoon 9400 imager GE Healthcare
ZnSO4 Fisher Scientifics Z-68

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References

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जीव विज्ञान अंक 148 (पी)पीपीजीपी पतली परत क्रोमैटोग्राफी 32पी Escherichia कोलाई उच्च थ्रूपुट दूसरा दूत
<em>Escherichia कोलाई</em> (पी) ppGpp के कई में Vivo माप के लिए Microtiter डिश Radiolabeling का उपयोग पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया
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Fernández-Coll, L., Cashel, M.… More

Fernández-Coll, L., Cashel, M. Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (148), e59595, doi:10.3791/59595 (2019).

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