Summary
Vi viser en metode for obduksjon og Disseksjon av mus prostata kreft modeller, med fokus på prostata svulst disseksjon. En steg-for-trinn protokoll for generering av mus prostata tumor organoids er også presentert.
Abstract
Metoder basert på homologe rekombinasjon å modifisere gener har signifikant fremmet biologisk forskning. Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er en streng metode for å studere pattedyr utvikling og sykdom. Vårt laboratorium har utviklet flere GEMMs av prostatakreft (PCa) som mangler uttrykk for en eller flere tumor Suppressor gener ved hjelp av nettstedet-spesifikke grobunn-loxP recombinase system og en prostata-spesifikk promoter. I denne artikkelen beskriver vi vår metode for obduksjon av disse PCa GEMMs, primært med fokus på Disseksjon av mus prostata svulster. Nye metoder utviklet i løpet av det siste tiåret har muliggjort kulturen av epitel-avledet celler til modell organsystemer in vitro i tre dimensjoner. Vi har også detalj en 3D cellekultur metode for å generere tumor organoids fra musen PCa GEMMs. Pre-klinisk kreftforskning har vært dominert av 2D cellekultur og cellelinje-avledet eller pasient-avledet xenograft modeller. Disse metodene mangler tumor mikromiljøet, en begrensning av å bruke disse teknikkene i pre-kliniske studier. GEMMs er mer fysiologisk-relevant for å forstå tumorigenesis og kreft progresjon. Tumor organoid kultur er en in vitro modell system som viser tumor arkitektur og celle avstamning egenskaper. I tillegg 3D cellekultur metoder tillater vekst av normale celler for sammenligning til tumor cellekulturer, sjelden mulig å bruke 2D cellekultur teknikker. I kombinasjon, bruk av GEMMs og 3D cellekultur i pre-kliniske studier har potensial til å forbedre vår forståelse av kreft biologi.
Introduction
Siden slutten av 1980-tallet, har evnen til å endre gener ved homologe rekombinasjon sterkt avanserte studiet av biologiske systemer1. Induserbart, vevs-, eller celle spesifikke Promotor systemer og områdespesifikke recombinases, slik som grobunn loxP, har avanserte genetiske studier ved å tilrettelegge kontroll over genetiske modifikasjoner både timelig og romlig2,3, firetil. Kombinasjonen av disse genetiske strategiene har skapt et bredt spekter av eksperimentelle modellsystemer5,6,7.
Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er et integrert verktøy for å vurdere hvordan enkelte gener eller grupper av gener påvirker pattedyr utvikling og sykdom. I pre-klinisk kreftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og streng metode for å studere kreftutvikling, progresjon, og behandling8. Vårt laboratorium har spesialisert seg på generering og karakteriserer av kreft GEMMs.
Den mest diagnostisert ikke-hud kreft blant menn i USA er prostatakreft (PCa). Flertallet av pasientene med PCa har lav risiko sykdom og høy sannsynlighet for overlevelse, men overlevelsesraten avtar drastisk når sykdommen diagnostiseres ved avanserte stadier, eller hvis målrettet hormonell behandling induserer progresjon til aggressiv, ikke-kureres PCa under typer9,10. Vårt laboratorium har utviklet GEMMs som utnytter floxed alleler av en eller flere tumor Suppressor gener. Rekombinasjon og tap av tumor Suppressor genuttrykk forekommer spesielt i prostata fordi vi har innført en transgene med grobunn recombinase nedstrøms av probasin arrangøren aktiveres bare i prostata epitelceller11, 12. we har også avlet vår GEMMs å inneholde en grobunn reporter transgene kalt mT/mG, som induserer tomat fluorescerende protein uttrykk i celler mangler grobunn og grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk i celler med grobunn13. Mens presentasjonen av denne metoden og våre representative resultater viser GEMMs vi studerer i laboratoriet vårt, kan denne protokollen brukes til å generere prostatakreft organoids fra alle musemodell. Men, som diskutert i detalj i våre representative resultater delen, har vi observert at visse tumor egenskaper er optimale for prostatakreft organoid generasjon.
I det siste tiåret har nye metoder for dyrking celler fra vev av epitel opprinnelse ført til betydelige fremskritt i vår evne til å modellere organsystemer i vitro14,15. Begrepet "3D cellekultur" har blitt tilskrevet teknikker involvert i etablering og vedlikehold organoids, som kan være generelt definert som strukturer består av celler som monterer sekundær arkitektur drevet av organ-spesifikk celle avstamning egenskaper16. Disse nye metodene er forskjellige fra klassisk 2D cellekultur i at cellene ikke krever transformasjon eller immortalization for langsiktig vekst; Dermed kan 3D-kulturer av normale celler sammenlignes med syke celler. Dette er spesielt verdifullt i kreftforskning hvor normal cellekontroll kulturer har vanligvis ikke vært tilgjengelig. I tillegg organoids spontant danne sekundære vev arkitekturer med riktig differensiert celletyper, noe som gjør dem til et bedre modell system for å forstå kreft in vitro enn 2D cellelinjer17. Vårt laboratorium har skapt 3D organoid linjer fra tumor problemet isolert fra vår PCa GEMMs å utfylle våre in vivo data og utføre eksperimenter som ikke ville være gjennomførbart i GEMMs.
I denne artikkelen presenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette obduksjon av PCa GEMMs, inkludert Disseksjon av distinkte mus prostata fliker og metastatisk lesjoner. Vi beskriver og viser en trinnvis metode for å generere organoids fra mus prostata svulster basert på en protokoll tidligere utgitt av Drost et al. for avledet organoids fra normal mus prostata epitel vev18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr prosedyrer beskrevet her ble utført med godkjenning av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Institutt for laboratorium Animal Resources, Roswell Park omfattende Cancer Center, Buffalo, New York.
Merk: Mannlige mus skal dissekert å isolere prostates eller prostata svulster for generering av organoids bør ha minst nådd alder av seksuell modenhet-ca 8-10 ukers alder. Spesifikke alder av mus kan variere mellom studier. Noen faktorer å vurdere når du velger alder inkluderer alder-avhengige endringer i prostata celle populasjoner, alder-avhengige uttrykk for spesifikke promoter-drevet grobunn transgenes, og frekvensen av prostata tumorprogresjon i en bestemt GEMM.
1. disseksjon og Imaging av mus ProstateTumor og metastatisk svulster
- Forberedelser
- Skaff nødvendige sterile disseksjon verktøy. Stage disseksjon område på ren steril overflate med en 15 cm linjal, presisjon balanse, analytisk balanse, spray flaske med 70% etanol, fosfat-bufret saltvann (PBS), og papirhåndklær.
-
Utarbeidelse av bindemiddel løsninger for visceral organer og bein ikke skal brukes til organoid generasjon
- For visceral organer: Forbered 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS. For en mus, lage 20 mL 4% PFA, alikvot inn 2 15 mL koniske rør og holde ved romtemperatur til bruk.
- For lange bein: Alikvot 10 mL pre-laget 10% nøytral bufret formalin (NBF) i 1 15 mL konisk rør og holde ved romtemperatur til bruk.
- Få tak i ubehandlede 10 cm retter og fyll med ikke-sterile PBS — disse vil fungere som midlertidige beholdere for organer under fin disseksjon ved hjelp av et disseksjon mikroskop.
Merk: Sterile verktøy brukes for dissekere vev for å generere organoids. Ikke-sterile verktøy brukes for første snitt og Disseksjon av bakbena.
- Døds aktiv og innledende snitt
- Euthanize musen ved CO2 kvelning ved hjelp av en 2,0 L/min strømningshastighet på 5 min. Fjern musen fra buret og utfør cervical forvridning. Bruk presisjon balanse for å måle musen kroppsvekt og rekord.
- Plasser musen på toppen av et papir håndkle og orientere på disseksjon overflaten ventrale side opp med musen hodet vendt bort fra etterforsker. Fest musa til styret ved å strekke ut sine lemmer og piercing hver av forepaws og hind poter med en engangsnål.
- Ved hjelp av en spray flaske, slukke musen er pels med 70% etanol. Ved hjelp av ikke-sterile disseksjon saks og rett tang, knip like over musen penis og gjøre et lite snitt gjennom pelsen bare.
- Fortsett snittet midtlinjen opp til musen er halsen gjennom pelsen bare. Foreta bilaterale snitt fra det punktet av den første snitt gjennom musen er ventrale flyet gjennom pelsen bare.
- Ta tak i pelsen og trekk den forsiktig bort fra huden på musen. PIN ned pelsen til styret for å gi tilgang til både abdominal og bryst hulrom.
- Ekstraksjon av mannlig urogenitale system en blokk
- Ved hjelp av sterile disseksjon saks og rett tang, nøye skjære gjennom huden ca 0,75 cm over endetarmen. Fortsett snittet midtlinjen opp til brystkasse uten å forstyrre noen organer i bukhulen. Trekk huden forsiktig bort og fest til styret for å avdekke hele bukhulen.
Merk: Ikke la disse instrumentene berøre utsiden av musen eller noen overflate i staging-området, da disse vev vil bli brukt til å generere organoids. - Analysere urogenitale systemet og andre organer i henhold til diagrammet i figur 1A, med tall som indikerer rekkefølgen organene vil bli fjernet fra musen.
- Finn blæren, deretter ta tak i fett puten til enten venstre eller høyre og dra oppover for å avdekke testikkel. Forsiktig analysere bort testikkel fra resten av urogenitale regionen og satt til side. Gjør det samme prosedyre på den andre siden.
Merk: Oppnå optimal vev kvalitet og detaljert tumor karakterisering av prostata svulster krever at hele urogenitale regionen fjernes fra musen en blokk19. Det anbefales at urogenitale området fjernes først (figur 1A). - Ta tak i blæren og forsiktig trekke opp slik at urogenitale regionen heiser sammen, utsette urinrøret under. Mens du holder blæren, orientere saksen slik at de er mot undersiden av rygg prostata og kutt urinrøret. Hele urogenitale regionen vil da løsne fra bukhulen.
- Sett urogenitale regionen i en 10 cm parabol fylt med PBS. Hvis fortsatt fylt med urin, avløp blæren ved å lage et lite snitt. Ved hjelp av analytisk balanse, veie urogenitale systemet og posten.
- Ved hjelp av sterile disseksjon saks og rett tang, nøye skjære gjennom huden ca 0,75 cm over endetarmen. Fortsett snittet midtlinjen opp til brystkasse uten å forstyrre noen organer i bukhulen. Trekk huden forsiktig bort og fest til styret for å avdekke hele bukhulen.
- Utvinning av bekken lymfeknuter, milt, lever, nyre, lunge, Tibia, og femur
- Fjerne urogenitale systemet eksponerer bekken lymfeknuter, plassert rett bak urogenitale systemet (figur 1A) og på hver side av ryggraden. Lymfeknuter vil bare være synlig hvis de inneholder metastatisk lesjoner eller om det er lokal betennelse. Orientere den rettetang under lymfe noden og trekk opp for å fjerne lymfe noden. Gjør det samme prosedyre på den andre siden.
- Ta tak i endetarmen med den rettetang og kutt. Trekk på endetarmen for å løse hele tykktarmen og tynntarmen, på jakt etter metastatisk lesjoner i chrezbryzheechno lymfeknuter. Når hele ileum er fjernet, fortsetter du å dra i tolvfingertarmen for å eksponere magen. Skjær spiserøret til helt fjerne magen og kast. Hvis noen metastatisk lesjoner i lymfeknuter er observert, nøye analysere vekk fra tarmen og lagre i en 10 cm parabolen av PBS.
- Å utsette og fjerne magen vil trekke milten fra rygg siden av magen (figur 1A). Fjern milten og plasser i 4% PFA. Milten fungerer som en fargekontroll for hemotoxylin som det er svært mobilnettet.
Merk: Visceral vev som ikke skal brukes til organoid generasjon vil bli fikset over natten i 4% PFA, vasket med PBS, og deretter plassert i 70% etanol. - Fjern leveren i øvre del av buken (figur 1A). Basert på metastatisk belastning i leveren, kan individuelle fliker være dissekert, eller hele leveren kan fjernes ved å skjære forsiktig langs membranen. (Ikke skjær gjennom membranen på dette tidspunktet). Plasser leveren i en 10 cm rett av PBS.
- Fjerne leveren vil fullt utsette nyrene på hver side av ryggraden (figur 1A). Fjern nyrene-sammen med renal lymfeknuter, hvis nodene har metastatisk lesjoner-ved å plassere den rettetang under nyrene og trekke opp. Gjør det samme prosedyre for den andre siden.
- For å avdekke bryst hulen, kutt membranen forsiktig langs brystkasse. Piercing i membranen vil løsne det negative trykket i bryst hulen og avdekke hjerte og lunger (figur 1A).
- Ta tak i brystbenet og trekk opp for å åpne bryst hulen ytterligere. Observer ventrale ansikt av bryst hulrommet langs rib bur for metastatisk lesjoner i bryst lymfeknuter og analysere, hvis det finnes.
- Mens du fortsatt holder brystbenet, skjære bort ventrale ribbeinet buret for å få tilgang til hjerte og lunger. Ta tak i hjertet, trekk opp og skjær under lungene. For å fjerne hjerte og lunger en blokk, kutt alle fremre blodkar og luftrøret. Plasser vevet i PBS og forsiktig fjerne hjertet uten å skade lunge vev eller lunge metastatisk lesjoner.
- Ta den ikke-sterile rett tang og dissekere saks og skjær bak beinet på hodet av femur. Forsiktig ta tak i femur og fjerne bak beinet fra pelsen.
- Plasser bak benet på et papir håndkle og ta tak i bak beinet. Bruk singelen kanten barberblad til skrap/kuttet bort alle muskler og bindevev fra Tibia og femur. Fjern femur fra Tibia ved å kutte bakre til patella og fjerne Tibia ved å fjerne bak labben. Plasser Tibia og femur i 10% NBF. Gjør det samme prosedyre på den andre siden.
Merk: For å undersøke de lange bein av musen for metastatisk lesjoner, trenger fibula ikke å være intakt. Den lange bein vil bli løst i 10% NBF i en uke, deretter decalcified ved hjelp av nøytral EDTA løsning20. Etter tre uker, vil beina bli overført til 70% etanol. - Etter å ha fjernet bakbena, ta et øre eller hale skjæring for fremtidig genotyperingteknologi. Kast muse stammen og alle vev ikke skal festes eller brukes til organoid generasjon.
- Disseksjon av prostata svulst
Merk: Disseksjon av mus prostata fliker kan bare oppnås ved hjelp av en dissekere mikroskop19. Imidlertid kan prostata tumor belastningen være så høy at enkelte fliker ikke kan skilles, og disseksjon kan utføres uten mikroskop. Likevel er den fullstendige protokollen for Disseksjon av individuelle prostata fliker beskrevet nedenfor.- Plasser urogenitale regionen i en 10 cm rett av PBS under et dissekere mikroskop og orientere ventrale side opp med blæren og banebrytende blemmer vendt bort fra etterforsker. All manipulering av urogenitale regionen bør gjøres ved hjelp av sterile instrumenter.
- Vurdere den generelle fenotype av prostata tumor-mest sannsynlig vil enten en væske-fylt eller solid svulst observeres i PCa GEMMs (figur 2a, B).
Merk: Fluid-fylte svulster er ofte plassert i fremre prostata regionen (figur 2A). Fluid fylte svulster består av primært bindevev med lite epitel komponenter-dermed disse tumorer ikke er optimale for organoid generasjon på grunn av det lave antallet tumor epitelceller, som vil bli diskutert i representative resultater Delen. - Hvis Fluid fylte svulster er til stede, poke et lite hull i svulsten. Plasser urogenitale regionen i en ny 10 cm parabolen av PBS.
- Ta et par rettetang i den ikke-dominerende hånd og buet tang i den dominerende hånden. Vend urogenitale regionen til rygg flaten. Se etter proksimale prostata regionen (figur 1B), som kan identifiseres av rosa/rød farge i urinrøret. Ta tak i urinrøret og Hold fast så å manipulere urogenitale vev med den buede tang.
Merk: Under prostata disseksjon, alltid ta oppmerksom på blæren plassering, da dette er den enkleste måten å finne de enkelte prostata fliker (figur 1B).
- Fjerning av ikke-prostata vev fra urogenitale regionen
- Mens du fortsatt på rygg ansiktet til urogenitale regionen, finne bunnen av sæd vesicle. Forsiktig fjerne sæd vesicle og kast. Utfør samme prosedyre på motsatt side.
Merk: Unngå punktering av sæd vesicle, som det vil løslate klebrig og ugjennomsiktig sekretoriske væske som forstyrrer prostata disseksjon. Hvis sæd vesicle er punktert, overføre de resterende urogenitale regionen til nye 10 cm parabolen med frisk PBS. - Fjern og kast vas deferens og så mye fett og bindevev som mulig ved hjelp av den buede siden av tang.
- Mens du fortsatt fast holder urinrøret/proksimale prostata regionen, bruk et par fine, pekte saks for å fjerne blæren fra urinrøret.
- Mens du fortsatt på rygg ansiktet til urogenitale regionen, finne bunnen av sæd vesicle. Forsiktig fjerne sæd vesicle og kast. Utfør samme prosedyre på motsatt side.
- Isolering av individuelle prostata fliker
- Finn fremre prostata (figur 1B). Sørg for å holde fast i proksimale prostata regionen/urinrøret med den rettetang. Fjern fremre prostata regionen ved å ta direkte tak i vevet med den buede siden av tang og fast trekke den bort fra blæren og resten av prostata. Plasser vevet i PBS.
Merk: For alle prostata regioner, dissekere saks kan være nødvendig å fjerne vevet, avhengig av størrelsen på svulsten. - Finn ventrale prostata regionen (figur 1B). Fjern ventrale prostata regionen på samme måte som i trinn 1.5.7.
- På dette punktet i disseksjon, bare lateral og rygg prostata regioner bør være til stede, mens proksimale prostata regionen er fortsatt blir grepet av den rette pinsett. Vurder de laterale og rygg prostata regionene (figur 1B). Hvis den laterale regionen kan skilles fra rygg regionen, fjerne lateral prostata regionen som beskrevet i trinn 1.5.7. Gjør det samme prosedyre på motsatt side.
- Fjern rygg prostata regionen som beskrevet i trinn 1.5.7. Plasser proksimale prostata regionen i 4% PFA, som sin struktur i muskel vev i urinrøret gjør det uegnet for organoid generasjon.
- Finn fremre prostata (figur 1B). Sørg for å holde fast i proksimale prostata regionen/urinrøret med den rettetang. Fjern fremre prostata regionen ved å ta direkte tak i vevet med den buede siden av tang og fast trekke den bort fra blæren og resten av prostata. Plasser vevet i PBS.
2. generering av 3D Organoids fra prostata tumor tissue
Merk: Figur 3 viser en billedlig beskrivelse av prosedyren for generering av tumor organoids.
- Forberedelse
- Forbered mus prostata organoid medier i henhold til Drost et al.18 med følgende endringer. Bruk conditioned medium i stedet for rekombinant proteiner for noggin og R-Spondin og bruke en endelig konsentrasjon på 1% (v/v), i stedet for 10%, for både noggin-og R-Spondin-conditioned medium.
Merk: HEK293 celler stabilt transfekterte med HA-Mouse noggin-FC eller HA-Mouse Rspo1-FC brukes til å produsere noggin-eller R-Spondin-conditioned medium, henholdsvis. Disse cellelinjene var en gave fra Calvin Kuo Laboratory ved Stanford University. - Forbered fordøyelsen løsning i et 15 mL rør ved fortynning 20 mg/mL kollagenase II med Advanced DMEM/F12 (+ + +) medier til en endelig konsentrasjon på 5 mg/mL. Legg Y-27632 rock inhibitor til kollagenase II-løsningen ved en endelig konsentrasjon på 10 μM.
Merk: Forholdet mellom fordøyelsen buffer til vev er 1 mL til 50 mg, som vi bruker i henhold til Drost et al.18.
- Forbered mus prostata organoid medier i henhold til Drost et al.18 med følgende endringer. Bruk conditioned medium i stedet for rekombinant proteiner for noggin og R-Spondin og bruke en endelig konsentrasjon på 1% (v/v), i stedet for 10%, for både noggin-og R-Spondin-conditioned medium.
- Hakking og fordøyelse av tumor vev
- Inne cellen kulturen Hood, sted prostata svulst tissue inne en steril 10 cm kulturen fat, analysere og kaste nekrotisk tissue.
- Hakke de resterende prostata tumor vev i 1 mm3 kuber ved å holde vevet bitene med steril buet tang og skjæring med disseksjon saks.
- Plasser hakket svulst brikkene i 15 mL røret med fordøyelsen buffer ved scooping dem opp med den buede siden av tang. Fordøye tumorvevet ved 37 ° c med risting for 1,5 til 2 h. Sjekk fordøyelsen fremgang hver 20 min.
Merk: På denne tiden, ta ut minst 2 mL matrise fra-20 ° c lagring og tine på isen. 1 mL alikvoter av matrisen vil ta ca 3 h å tine. - Etter vevs fordøyelsen, sentrifugerør ved 175 x g i 5 min ved 4 ° c for å danne en celle pellet.
- Fjern supernatanten, flick røret å løsne cellen pellet, og resuspend cellen pellet i 1 mL pre-varmet Trypsin supplert med 10 μM Y-27632 rock inhibitor. Sett røret i et vannbad på 37 ° c i 5 minutter.
- Etter inkubasjons, pipette opp og ned 5 ganger med en standard P1000 spissen. Returner røret til 37 ° c vannbad for ytterligere 5 min og gjenta trinn 2.2.6.
Merk: På denne tiden i prosedyren, varm en steril 6-brønn cellekultur parabolen ved å sette den inn i en 55 ° c inkubator.
- Telle celler og blanding i matrisen
- Vask cellene ved å tilsette 9 mL kaldt AdDMEM/F12 (+ + +) og sentrifuger røret ved 175 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Etter sentrifugering, Fjern supernatanten, flick røret å løsne pellet, og vask cellene igjen ved å legge 10 mL kaldt AdDMEM/F12 (+ + +). Sentrifuger røret ved 175 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Etter sentrifugering, Fjern supernatanten, flick røret å løsne pellet, resuspend cellene i 1 mL AdDMEM/F12 (+ + +), og telle antall celler ved hjelp av en hemocytometer i henhold til standard prosedyre.
- Syv-til-åtte kupler passer i en brønn av en 6 brønn parabolen når organoids er belagt i matrisen via en drop-klok måte. Ca 200 μL av matrise vil produsere 7-8 kupler. Bestem hvor mange brønner av organoids er nødvendig for fremtidige eksperimentelle formål og beregne volumet av matrise kreves. Deretter beregner du volumet av celle-inneholdende løsning som trengs for å ha en endelig konsentrasjon av 1,0 x 106 celler/ml matrise.
- Etter telling celler, sentrifuge ved 175 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten, flick røret å løsne pellet, og resuspend cellene i volum av matrise beregnet i trinn 2.3.4.
Merk: Matrix forblir i flytende form bare ved 4 ° c; oppbevare matrise lager rør og matrise-cellen løsninger opp på isen til alle tider.
- Plating matrise kupler og anvendelse av Media
- Bland matrise-celle løsning med en P200 Pipet å jevnt distribuere cellene uten å innføre bobler. Fjern 6-brønn kultur parabolen fra 55 ° c inkubator.
- Pipetter med omhu 200 μL av matrise-celle løsning og slipp løsningen raskt inn i en brønn for å skape kupler.
- Gjenta trinn-2.4.2. til volumet av matrise-celle løsning er brukt. La kupler stivne i romtemperatur i 2 minutter.
- Vend 6-godt parabolen opp-ned og sette parabolen i en 37 ° c inkubator å fortsette herding i 20 min.
- Etter inkubasjons, tilsett 2 mL mus prostata organoid Media til hver brønn. Legg syntetisk androgen R1881 til hver brønn for en endelig konsentrasjon av 1 nM og Y-27632 rock inhibitor til en endelig konsentrasjon på 10 μM. Bland forsiktig og Plasser platen i en 37 ° c inkubator for dyrking.
Merk: Organoid kultur Media må suppleres med 10 μM Y-27632 rock inhibitor for bare 1 uke etter Organoid generasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative obduksjon bilder av en mus med en stor væske-fylt primære prostata svulst i fremre prostata regionen er vist i figur 2a. I kontrast, figur 2B, viser representative obduksjon bilder av en mus med en stor solid primære prostata svulst som enkelte prostata regioner er umulig å skille. Fluorescerende disseksjon bilder viser samme solide prostata svulst fra figur 2B uttrykker GFP, som indikerer at svulster cellene uttrykke grobunn (figur 2C). Vev som ikke uttrykker probasin, slik som blæren, uttrykker tomat og dermed ikke uttrykke grobunn (figur 2C). Leveren og lungene fra musen fra figur 2B har metastatisk svulster uttrykker GFP, viser at de stammer fra den primære prostata svulst, og er omgitt av normalt vev som uttrykker tomat (figur 2C ). Til slutt uttrykker bekken lymfe noden fra denne musen GFP og ikke Tomato, noe som indikerer at denne metastatisk svulst har passert dette organet og ingen normale vev forblir (figur 2C).
Vi viser bilder i Figur 4 av organoids vi har generert fra en solid prostata svulst. Ved dag 1 dannes små organoids, som vist i de representative fase kontrast bildene. Fluorescerende bilder på dag 1 viser at både tomat og GFP uttrykker celler er til stede i svulsten organoid kultur (piler). Men etter dag 7 når prostata tumor organoids har fullt dannet, disse organoids uttrykker GFP og ikke Tomato. Disse dataene tyder på at disse organoids har sin opprinnelse fra tumorceller som uttrykker grobunn og ikke fra normale epitelceller. Disse tumor organoids fortsetter å være bare GFP-positive som vi utvide vår kultur til passasje 1 og 2.
I figur 5, viser vi bilder av organoids vi har generert fra en væske fylt prostata svulst. På dag 1, små organoids er forming, og fluorescerende bilder viser at både tomat-og GFP-uttrykker celler er til stede i organoid kultur-ligner på vår observasjon på dag 1 for organoids generert fra en solid prostata svulst (Figur 4). Men organoids fra en væske fylt prostata svulst uttrykker enten GFP eller tomat på dag 7-indikerer at organoids har dannet fra celler som ikke uttrykker grobunn. Dette mønsteret fortsetter i passasje 1 og passasje 2, der kulturen har både tomat-og GFP-uttrykker organoids. Videre analyse av disse organoids er sterkt begrenset fordi linjen er en blanding av normal epitel organoids og tumor organoids. Vi tror at væske fylte prostata svulster er suboptimal i å generere tumor organoids bare fordi det er en større andel av normal prostata epitelceller. Siden både normal prostata epitelceller og prostata kreftceller danner organoids, linjene generert fra væske fylte prostata svulster er en blanding av normal og kreft organoids. Vi får ren tumor organoid linjer fra væske fylte prostata svulster ved flyt sortering for GFP-positive celler og genererer organoids fra at bestanden av celler. Solid prostata svulster er primært består av tumorceller, derfor organoids generert fra disse tumorer er en mer ren befolkning av kreft organoids uten forhånds sortering for GFP.
Figur 1 : Våre anbefalte disseksjon for prostatakreft (PCa) genetisk konstruerte musemodeller (GEMMs) og anatomi av musen prostata. (A) rekkefølgen vi anbefaler i vår protokoll for å dissekere de viktigste organene fra en PCa GEMM. 1. urogenitale regionen. 2. bekken lymfeknuter. 3. milt. 4. leveren. 5. nyrer. 6. lungene. 7. Tibia og femur. (B) kart over musen urogenitale regionen og prostata anatomi. Fluorescerende disseksjon bilder av en 12 ukers gammel mus uttrykker probasin-grobunn og mT/mG grobunn reporter transgene. Blære (BL), sæd blemmer (SV), fremre prostata (AP), ventrale prostata (VP), lateral prostata (LP), rygg prostata (DP), og proksimale prostata (PP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative disseksjon bilder av prostata kreft (PCa) genetisk konstruerte musemodeller (GEMMs). (A) bukhulen før fjerning av urogenitale regionen og urogenitale regionen med en væske fylt prostata svulst. (B) bukhulen før fjerning av urogenitale regionen og urogenitale regionen med en solid prostata svulst. (C) representative TOMAT og GFP fluorescerende bilder av en solid prostata svulst, lever, lunge, og bekken lymfeknuter fra en PCa GEMM som utvikler metastatisk lesjoner. Scale bar = 5 mm. blære (BL), fremre prostata (AP) og rygg prostata (DP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Flow diagram av protokollen for å generere prostata tumor organoids. Etter dissekere prostata svulst, hakke vevet inn i 1 mm stykker. Fordøye svulsten brikkene i kollagenase, samle cellene, og fordøye i Trypsin å få en enkelt celle suspensjon. Etter telling celler, resuspend i volum av matrise som kreves for en 1,0 x 106 celle/ml celle konsentrasjon. Tallerken kupler i parabolen ved hjelp av en drop-klok metode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative bilder fra generasjon av mus prostata tumor organoids fra en solid prostata svulst. Representative fase kontrast, tomat, og GFP fluorescerende bilder fra dag 1, dag 7, Passage 1, og Passage 2 av organoids generert fra en solid mus prostata svulst. Scale bar = 100 μm. piler viser enkeltceller i fluorescerende bilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representative bilder fra generering av mus prostata tumor organoids fra en væske-fylte svulst. Representative fase kontrast, tomat, og GFP fluorescerende bilder fra dag 1, dag 7, Passage 1, og Passage 2 av organoids generert fra en væske-fylt mus prostata svulst. Scale bar = 100 μm. piler viser enkeltceller i fluorescerende bilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske skritt i protokollen for prostata tumor disseksjon og organoid generasjon
Fjerning av ikke-prostata vev og fine Disseksjon av musen prostata tumor er avgjørende for den optimale generasjonen av kreft organoids siden både ikke-prostata epitelceller og normal prostata epitelceller vil generere organoids. For solid prostata svulster spesielt, er det avgjørende å isolere områder av levedyktig svulst for å fjerne forurensning med nekrotisk vev som ville redusere antall levedyktige celler. Under organoid generasjon bør vevs fordøyelsen med kollagenase overvåkes nøye, siden langvarig eksponering for kollagenase vil begrense celle levedyktighet. Med organoids avledet fra kreft GEMMs, er det avgjørende å fullt genotype hver linje for å sikre at alle transgenes og modifiserte alleler som ble utviklet i musen er til stede i organoids. Repetisjon av genotyperingteknologi etter langvarig passaging er også nødvendig for å sikre at genetiske modifikasjoner opprettholdes.
Modifikasjoner og feilsøking av prostata tumor disseksjon og organoid generasjon
Vi har observert mus til mus variasjon i prostata tumor egenskaper, selv blant dyr med samme genotype. Derfor kan spesifikke modifikasjoner av prostata disseksjon protokollen som er beskrevet her være nødvendig for hver mus. I tillegg er tilpasningsdyktighet nødvendig når dissekere metastatisk svulster siden det er vanskelig å forutsi alvorlighetsgraden av disse lesjoner før du starter disseksjon.
På et par anledninger, har vi observert overflødig forurensning av vår celle pellet med det som synes å være bindevev, selv etter fordøyelsen med både kollagenase og Trypsin. Når dette skjer, resuspend vi pellet i minst 2 mL AdDMEM F12 (+ + +) og bruke en 40 μm celle sil for å fjerne bindevev. Siden det er mye-til-parti variasjon i herding rate av matrisen, øke eller redusere tiden for kuppel herding kan være nødvendig før påføring av organoid Media.
Begrensninger ved bruk av GEMMs
Mens GEMMs er den strengeste metoden for pre-kliniske kreft studier, krever denne tilnærmingen betydelig tid, regning og trening. I tillegg kan musen til musen variasjoner, som i studiet av mennesker, komplisere tolkning av data.
Begrensninger ved bruk av 3D-cellekultur
Sammenlignet med 2D cellekultur, generere og vedlikeholde organoid linjer krever økt tid og kostnader. For eksempel, våre svulst organoid linjer er passert enhver 2-3 ukens, stund cellen linjer kan passert enhver 2-3 dager. Dette tregere vekstrate av organoids øker tiden det tar å fullføre eksperimenter betraktelig. Organoid kultur Media inneholder flere spesialiserte vekstfaktorer og reagenser, som kan være kostbart avhengig av kilde, og dermed generere og vedlikeholde organoids er dyrere enn tradisjonelle 2D cellelinjer. Til slutt, vårt laboratorium og andre har observert mye for mye forskjeller i matrise og andre reagenser-skape en utfordring for å opprettholde konsistens i organoid vekst for langsiktige eksperimenter.
Betydning i å bruke 3D cellekultur med hensyn til eksisterende/alternative metoder
Pre-klinisk kreftforskning har vært dominert av 2D cellekultur og cellelinje-avledet xenograft modeller. Cellevekst i 2D krever transformasjon/immortalization-dermed både in vitro og xenograft studier ved hjelp av 2D kulturer vanligvis ikke har uendret normal cellelinjer å tjene som ikke-kreft kontroller. Det siste tiåret av forskning i 3D organoid kultur av normal epitel-avledet vev har nå lov til vekst av ikke-kreft epitel vev som kan brukes til å sammenligne med analoge organoids avledet fra kreft vev. Cancer organoids kan også brukes til å etablere xenotransplantater å ytterligere forstå tumor utvikling. I tillegg kan ikke-kreft organoids brukes til å generere kontroll xenotransplantater-som ikke var mulig før 3D cellekultur metoder ble utviklet16.
Betydning i å bruke 3D cellekultur i prostata kreftforskning
I nyere studier, organoids har blitt brukt til å recapitulate GEMM prostata tumor egenskaper. Dardenne et al. viser at organoids generert ved hjelp av prostata svulster fra GEMMs som samtidig mangler tumor Suppressor Pten og Overekspresjon den MYCN diagnostisk hadde større vekstpotensial enn organoids generert ved hjelp prostates fra kontroll GEMMs. I tillegg, både sekvensering og immunhistokjemi viste at tumor organoids sammenfattet uttrykket profiler av prostata svulster både mangler Pten og overexpressing MYCN21. Blattner et al. viser at samtidig prostata overuttrykte av en kreftfremkallende mutant av speckle type BTB/POZ protein (SPOP) og sletting av Pten øker frekvensen av tumorigenesis i GEMMs. Når prostata organoids ble generert til overekspresjon mutant SPOP, deres spredning ble økt i forhold til kontroll prostata organoids og avstamning markør uttrykk sammenfattet opprinnelige prostata svulster22. Sammen viser disse studiene at organoids er en optimal modell for videre studier av prostata tumor egenskaper i GEMMS.
Organoid kultur har også blitt brukt som et verktøy for å vurdere individuelle subpopulasjoner av prostata tumorceller. Ved hjelp av GEMM svulster som mangler Pten og både Pten og Trp53 tumor Suppressors i prostata epitelceller, Agarwal et al. fraksjonert celler i basal og luminal forfedre, spredte disse subpopulasjoner som organoids, og ytterligere preget deres spesifikke fenotyper23. Dermed bruker 3D cellekultur, er det mulig å karakterisere subpopulasjoner av tumorceller som kan være begrenset i overflod i prostata svulster selv.
Som beskrevet ovenfor, 3D cellekultur teknikker tillater vekst av normale epitelceller. Derved, prostata organoids generert fra GEMMs mangler en grobunn driver gir en unik modell for sanntids overvåking av tumorigenesis ved induksjon av grobunn recombinase in vitro. Faktisk vurderte Dardenne et al. hvordan NMYC overuttrykte påvirker vekstpotensialet i sammenheng med Pten tap over tid ved jektopicheski å uttrykke ERT2-grobunn og behandle med Tamoxifen21. I tillegg, effekten av NMYC overuttrykte på androgen RESEPTOR (AR), det store målet for terapi for prostatakreft, ble vurdert etter induksjon av grobunn recombinase i organoids generert fra GEMMs21. Det samme induserbart grobunn systemet ble brukt av Blattner et al. i prostata organoids å måle hvordan overuttrykte av mutant SPOP påvirker prostata kreftcelle SPREDNING og AR uttrykk22. Spesielt, eksperimenter inducing grobunn uttrykk in vitro har en innebygd ikke-kreft kontroll med kjøretøy-behandlet organoids.
Spesifikke begrensninger i bruk av 3D cellekultur i prostata kreftforskning
Mens organoid vekst av normale epitelceller er en fordel med å bruke 3D cellekultur teknikker, evne til å vokse normal organoids har også presentert en utfordring i prostatakreft forskningsstudier. Som vist i vår representative resultater delen, har vi observert utvekst av normal prostata organoids i linjer generert fra prostata svulster som er mindre aggressive (figur 5). En måte å løse dette fenomenet er å generere organoids fra GEMMs uttrykke en grobunn reporter transgene, som mT/mG. Fluorescerende mikroskopi kan brukes til å vurdere den relative forholdet mellom normal til tumor organoids ved å observere uttrykk for tomat og GFP. I tillegg kan GFP uttrykk brukes til å flyte sortere organoid celler for å generere ren prostata tumor organoid linjer. Agarwal et al. Vis en sorteringsmetode for separasjon av normale epitelceller og kreftceller fra GEMM prostata svulster uten en grobunn reporter. De viser at epitel celle vedheft molekylær (EpCAM)-positive celler fra prostata svulster ikke skilles i subpopulasjoner når sorteres ved hjelp av enten CD24 eller SCA-1 celleoverflaten markører23 -dermed kan disse markører være ansatt for å utelukke normal prostata epitelceller fra GEMM prostata svulster før organoid generasjon. Vårt laboratorium og andre har observert at forholdene under hvilke prostata kreftceller danner organoids synes å enten velge for eller fremme avstamning spesifikke genuttrykk programmer karakteristisk for prostata basal epitelceller. Dette er en betydelig utfordring fordi prostata svulster i både mus og mennesker er primært luminal i naturen, uttrykker AR, CK8 og andre luminal markører, og sjelden uttrykker basal avstamning markører som p63 eller CK5. Selv om dette fenomenet ennå ikke er publisert i detalj, viser immunhistokjemi analyse at AR er redusert i Ptenf/+ organoids sammenlignet med Ptenf/+ prostates21. Utvekst av basal epitelceller i prostata kreft organoids kaller inn spørsmålet om disse linjene er virkelig en nøyaktig pre-klinisk modell av prostatakreft.
Mens prostatakreft organoids har blitt dokumentert å modellere svulsten som de er avledet bedre enn tradisjonelle 2D-kultur, er det potensial for organoids å gjennomgå genetiske endringer i kultur, spesielt etter flere passasjer. Foreløpig er vi ikke klar over noen publiserte studier som har dokumentert spontane genetiske mutasjoner, genetiske gevinster eller tap, eller epigenetic endringer som er vanlig etter forlenget passaging av prostata kreft organoids. For å begrense variasjonen som et resultat av genetiske eller epigenetic endringer som kan oppstå på grunn av langvarig passaging, bør eksperimenter utføres tidlig i organoids fra tidlige passasjer (< 10) så ofte som mulig.
Fremtidige anvendelser av 3D cellekultur
Mens det er umulig å forutsi alle fremtidige programmer som skal utvikles ved hjelp av 3D cellekultur i kreftforskning, er det flere veier som synes å ha størst potensial. Som med 2D cellelinjer, utføre in vitro genetisk modifisering er relativt enkel i organoids. Endre spesifikke gener i enten normal eller kreft organoids åpner opp mange muligheter i studiet av mekanismene som regulerer tumorigenesis, kreft progresjon, og behandling-spesielt når genetisk modifiserte organoids brukes til å generere organoid xenotransplantater. Genetisk modifisering av organoids er stor fordel når GEMMs ikke eksisterer for et bestemt gen eller etablering av en ny GEMM er utenfor omfanget av en bestemt studie.
Kreft organoid kultur har også mange potensielle søknader om klinisk forskning. Et bibliotek med relevante tumor under typer innenfor hvert organ system fra både pasienter og dyremodeller kan brukes til å raskt vurdere effekten av et nytt medikament eller en ny kombinasjon av eksisterende legemidler. Som 3D cellekultur blir mainstream og øker i effektivitet, genererer pasient-avledet organoids i den hensikt å personlig medisin har potensial til å skreddersy behandling for hver kreft pasient ved å teste alle tilgjengelige legemidler og kombinasjoner av narkotika ved hjelp av hans eller hennes individuelle organoid linje16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke økonomiske relasjoner til å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Calvin Kuo Laboratory ved Stanford University for å gi HEK293 celler stabilt transfekterte med enten HA-Mouse noggin-FC eller HA-Mouse Rspo1-FC. Vi vil også gjerne takke Dr. Dean tang for å la oss få tilgang til fluorescerende disseksjon mikroskop i laboratoriet hans. Dette arbeidet ble støttet av CA179907 til D.W.G. fra National Cancer Institute. Delte ressurser på Roswell Park Comprehensive Cancer Center ble støttet av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
