Summary
In vitro celle invasion assay bruges til at måle potentialet i kræft metastaser ved at kvantificere det cellulære potentiale for invasion og migration ved hjælp af cellekultur indsætter indeholder protein matrix. Celler udfordres til at migrere gennem protein matrixen og en porøs membran, mod en kemoattraktant, og derefter kvantificeres ved let mikroskopi.
Abstract
In vitro invasion assay bruger en protein-rige matrix i en BoyDen kammer til at måle evnen af dyrkede celler til at passere gennem matrixen og en porøs membran i en proces, der svarer til de første skridt af cancer celle metastaser. De testede celler kan ændres for genekspression eller behandles med inhibitorer for at teste for ændringer i invasions potentialet. Dette eksperiment tester den aggressive fænotype af musen brysttumor celler til at opdage og karakterisere de potentielle onkogener, der fremmer celle invasion. Denne teknik kan dog være alsidig og tilpasset til mange forskellige applikationer. Eksperimentet i sig selv kan gøres på én dag, og resultaterne er erhvervet ved lys mikroskopi i mindre end en dag. Resultaterne omfatter optællinger af antallet af invaderende celler til sammenligning og analyse. In vitro invasion assay er en hurtig, billig, og klar-cut metode til bestemmelse af celle adfærd i en kultur, der kan bruges som en indledende vurdering før mere involveret i vivo assays.
Introduction
In vitro invasion assay kan være et nyttigt værktøj, når man måler en celles evne til at migrere gennem en protein-belagt membran, analogt med de første skridt i metastase. En vigtig funktion af maligne kræftceller er deres evne til at migrere gennem og invaderer nærliggende væv. Kræft, der har spredt eller stase udgør mere behandling udfordringer og har lavere satser for langvarig overlevelse, mens lokaliserede tumorer er lettere at behandle og har højere satser for langsigtet overlevelse. For at metastasize, kræftceller skal forlade den primære tumor og migrere ind i kredsløbssygdomme eller lymfesystem, en proces, der kræver passerer gennem ekstracellulære matrix og kælder membran1. I processen kaldet epitelial mesenchymal Transition (EMT), tumorcellerne skal bryde celle-celle kontakter, migrere direktionelt, og invaderer nærliggende blod eller lymfeknuder fartøjer. De første skridt i denne metastase kaskade er af stor interesse, da disse trin er, hvad der kan gøre kræft deadlier. De genetiske og epigenetiske faktorer, der er involveret i de tidlige faser af metastase er fokus for en stor mængde forskning, men nøjagtige og pålidelige eksperimentelle værktøjer er nødvendige for at teste disse tidlige trin både in vivo og in vitro.
Værktøjer til at måle ændringer i celle migration såsom sårheling (scratch) assays eller vækst i 3D-miljøer såsom bløde agar-analyser kan delvist løse behovet for eksperimentelle metoder til måling af tidlige trin af metastase, men en analyse til måling af invasion er mere udfordrende, da processen sker i kroppen inden for en kompleks tumor mikromiljø. Med henblik på screening af stoffer eller genændringer for at bestemme vigtige faktorer i invasion og metastase, et system, der kan bruges in vitro med dyrkede celler og efterligne de udfordringer, som metastatiske celler in vivo er invasion assay2, 3. Brystkræft er den mest almindeligt diagnosticeret type kræft i kvinder og den anden førende årsag til kræft død i kvinder, så forstå de gener, der er ansvarlige for brystkræft celle invasion og metastase er kritisk vigtigt for folkesundheden. Desuden er museceller et nyttigt model system til at studere brystkræft og dens progression.
In vitro-invasions analysen er baseret på BoyDen-kammer samlingen, hvor to kamre af vækstmedier adskilles af en porøs membran3. For at efterligne tumor mikromiljøet, en protein-rige gel er også inkluderet for at adskille celler i et kammer fra en chemoattraktant i den anden og fungere som en kælder membran barriere. For at migrere mod chemoattraktant skal cellerne først passere gennem den proteinrige barriere og derefter passere gennem den porøse membran-en proces svarende til, hvordan metastatiske celler migrerer gennem stroma. Den proteinholdige gel kan ændres baseret på eksperimentets behov, men består normalt af kollagen eller kælder membran ekstrakt (f. eks. Matrigel)4. Det er en kompleks blanding af proteiner, proteoglycaner og vækstfaktorer, men for det meste består af lamininer og kollagen IV 4,5. Cellerne skal derefter passere gennem en porøs membran, der typisk er fremstillet af polycarbonat, polyester eller polytetrafluorethylen (PTFE). Membraner kan købes kommercielt med eller uden en Proteingel (typisk collagens), eller gelen kan købes separat og tilsættes. Porestørrelsen kan justeres ud fra cellestørrelsen. Mens porestørrelser er tilgængelige fra 0,4-8,0 μm, er kun porer fra 3,0-8,0 μm store nok til celle migrering. Invasionen analyse er blevet brugt til at bestemme effektiviteten af inhibitorer på evnen af celler til at migrere og invade. Mens mangler den nøjagtige tumor mikromiljø, der er til stede in vivo, in vitro invasion assay er gavnlig på screening mange betingelser på kort tid samtidig minimere behovet for dyremodeller. Målet med disse eksperimenter er at sammenligne genekspression af formodede onkogener og bestemme virkningerne på cancer celle adfærd og sygdoms aggressivitet ved hjælp af in vitro invasion assay og andre tests. Samlet set, invasionen analyse giver konsistente, kvantitative, og hurtige resultater til bestemmelse af metastatisk potentiale samtidig også være en relativt billig, ligetil, og tilpasselig metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og metoder blev udført som autoriseret af Villanova University institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC).
1. genekspression i kulturperler mus mammary tumor celler
- Forbered først de cellelinjer, der skal testes.
-
Brug en avls koloni af BALB/cV-mus. Disse mus bære Balb/cV stamme af mus brysttumor virus, overføres til pup i mælk6,7. 50 procent af avls hunnerne udvikler brysttumorer med 10 måneders alderen.
- At etablere en tumor cellelinje, ofrer en tumor-bærende dæmning ved hjælp af en IACUC-godkendt protokol. Suge abdominal huden i 70% EtOH og fjerne tumoren under sterile forhold i en laminar flow hætte. Tumorer er subkutane, så vær forsigtig for at undgå punktering af peritoneum.
- Placer tumor fragmenter fra ikke-nekrotiske områder i en petriskål med en lille mængde sterile Hanks afbalanceret saltvandsopløsning (HBSS) og hakke meget fint med en steril barberkniv.
- De dispergerede celle klumper overføres til en T25-cellekultur kolbe indeholdende 5 mL Dulbecco's modificerede Eagle medium eller DMEM (4,5 g/L glucose, phenol rød og L-glutamin) suppleret med 50% føtal bovint serum eller FBS og 1% antibiotika/antimykotisk opløsning. Dyrk celler i behandlede cellekultur kolber i en inkubator med 5% CO2 og 100% fugtighed ved 37 °c.
- Vask ikke-klæber celler efter 24-48 h og Udskift DMEM med 50% FBS og 1% antibiotika/antimykotisk opløsning. Vend cellerne tilbage til inkubator.
- Udskift flydende kultur medier hver 3.
- Opdel eller passage cellerne, når de er 90% konflydende. Fjern kultur medier og vask vedlige celler med HBSS (uden calcium eller magnesium). Inkuber celler med 0,25% trypsin-EDTA opløsning i 1-5 min ved 37 °C, indtil cellerne er afrundede og løsrevet. Fortyndes cellerne 1:10 i friske dyrkningsmedier og tilsættes til en ny kolbe. En T-25-celle dyrknings kolbe kræver 5-8 mL kultur medier, 5 mL HBSS til vask og 1 mL trypsin-EDTA til passage. Kolben returneres til inkubator.
- Reducer FBS koncentrationen til 40% efter den første passage, derefter 30% efter den anden passage, derefter 20% efter den tredje passage, og endelig 10% for alle efterfølgende passager. Processen med at skabe vækst i standard DMEM medium med 10% FBS kræver fire passager og 2-8 måneder.
-
Når celle linjen (-erne) er etableret, ændre ekspression af formodede onkogener ved transfektering af shrna målretning mRNA eller crispr for ikke-essentielle gener.
- Etablere antibiotika-resistente stabile cellelinjer med individuelle kloner, der er verificeret af Western blot og/eller RT-qPCR for ensartede resultater, men, forbigående transfections kan arbejde så godt, da analysen kun kræver 22 h. kontrol cellelinjer med der kræves også ikke-specifikke målsekvenser.
2. in vitro-invasion analyse
- Vokse over siddende mus brysttumor celler i en T25 kolbe indtil 70-90% flydende for dag 1 af forsøget.
Bemærk: Andre cellelinjer eller eksperimentelle betingelser kan kræve forskellige cellekultur medier. For eksempel, hvis hormon-lydhør brystkræft celler testes, trækul-filtreret serum kan være nødvendig for at fjerne forbindelser, der aktiverer østrogen eller andre hormonreceptorer. - Forbered BoyDen kammer skær ved at varme dem til stuetemperatur (fra-20 ° c opbevaring) for omkring 20 min i en cellekultur hætte. Undgå frost-tø cyklusser for ubrugte skær. Brug tre skær (replikater) til at generere statistisk gyldige data for hver cellelinje for hvert eksperiment.
- Tilsæt pre-warmed 37 °C serumfrit DMEM-medie til brønden og derefter skæret. For skær, der er designet til 24-brønden, tilsættes 500 μL serumfrit DMEM til brønden og derefter 500 μL af serumfrit DMEM til skæret, så porøs membran og gel hydreres på begge sider.
Bemærk: For større skær, der er designet til en 6-brønd skål, skal du bruge 2 mL serumfrit DMEM på begge sider.
- Tilsæt pre-warmed 37 °C serumfrit DMEM-medie til brønden og derefter skæret. For skær, der er designet til 24-brønden, tilsættes 500 μL serumfrit DMEM til brønden og derefter 500 μL af serumfrit DMEM til skæret, så porøs membran og gel hydreres på begge sider.
- Placer skålen med skær i en 37 °C cellekultur inkubator med 5% CO2 og 100% fugtighed i mindst 2 timer for at fugte og akkliere grundigt.
- Forbered cellerne ved at fjerne vækstmediet og skylle cellerne med 5 mL HBSS.
- Fjern HBU'ERNE, og tilsæt 1 mL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning i 1-5 min ved 37 °C, eller indtil cellerne er afrundede eller viser tegn på løsrivelse fra kolben.
- Tap forsigtigt på kolben for at fjerne alle cellerne. Cellerne opslæmmes i 5 mL DMEM + 10% FBS og overføres til et sterilt 15 mL centrifugeglas.
- Centrifuger cellerne ved 1.000 x g i 5 minutter for at pille cellerne forsigtigt. Fjern mediet, og Udskift det med 5 mL serumfrit DMEM for at resuspendere cellerne.
- Gentag Centrifugerings-og affjedringen i serum frie medier to gange mere for i alt 3 skyller.
- Cellerne opslæmmes grundigt i de sidste 5 mL serum frie DMEM, og der er ingen klumper af celler.
- Bestemme celle koncentrationen ved hjælp af en hemocytometer. Tæl kun levedygtige celler. Cellesuspensionen fortyndes til 5 x 104 celler/ml i 5 ml SERUMFRIT DMEM.
Bemærk: Denne koncentration giver 2.500 celler pr. skær i en 24-brønd skål. Dette antal celler er nok til aggressive kræftceller med høje satser for migration og invasion. Mindre aggressive cellelinjer kan kræve flere celler, op til 10.000 celler per INSERT for observerbare invaderende celler. Hvis reduceret celle invasion forventes, Overvej at maksimere invaderende celler ved at øge celle nummeret. Hvis øget celle invasion forventes, begynde med færre celler. - Fjern cellekultur skålen fra inkubatoren, og Aspirér forsigtigt mediet fra skæret. Løft indsatsen og Aspirer mediet fra brønden. Arbejde hurtigt, tilsæt chemoattraktant til det nedre kammer. For en 24-brønd skål tilsættes 750 μL DMEM med 5% FBS.
- Placer indsatsen i brønden og tilsæt cellerne til skæret. For en 24-brønd skål, brug 500 μL cellesuspension. For en 6-brønd skål Indsæt, brug 2,5 mL chemoattract og 2 mL celler. Sørg for, at der ikke er luftbobler på hver side af membranen.
- Returner skålen til celle kulturinkubator i 22 timer.
- Efter 22 h, fix og plette cellerne. Der forberedes en opløsning af 1% PARAFORMALDEHYD i 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) til fiksering.
- I en ren 24-brønd cellekultur skål tilsættes 1 mL fixativ til individuelle brønde, så der er en brønd for hver indsats.
- Tilbered Farvningsopløsningen (frisklavet) af 0,1% krystalviolet (w/v) i en opløsning af PBS med 10% ethanol (v/v). Tilsvarende tilsættes 1 mL farvningsopløsning til en ren brønd i en 24-brønd kultur skål for hver indsats.
- Fjern hvert skær en ad gangen med pincet og Placer en steril vatpind inde i skæret og svaber over siden af membranen for at fjerne ikke-migrerede celler.
- Gentag med en ekstra vatpind. Membranen er temmelig stærk, så blid pres, mens konstante ikke kompromitterer integriteten af membranen.
- Fjern eventuelle resterende medier fra indersiden af skæret og tilsæt 750 μL PBS for at vaske væk løsrevne celler.
- Fjern PBS og Gentag vask. Placer skæret i en brønd indeholdende fixativ for at fastsætte de migrerede celler på undersiden af membranen. Gentag for alle skær.
- Fastgør indsatserne i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Efter fiksering fjernes indsatsen. Skær igen med 750 μL PBS.
- Placer skæret i brønden med Farvningsopløsningen for at plette alle migrerede og faste celler. Pletter cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: For 6-Well Dish-skær anvendes 2 mL fiktionativ opløsning, 2 mL farvningsopløsning og 2 mL PBS-vask.
- Brug et bægerglas med destilleret vand til at deplette skær. Fjern skær og dyp i det destillerede vand, indtil vandet løber ud af indsatsen er klar.
- Fjern eventuelle overskydende vanddråber, og Placer skærene på et filtrerpapir på siden, så det er luft tørt (normalt overnight).
- Forbered membranen til billeddannelse ved at mærkning et rent glas mikroskop slide for hver indsats og placere en lille dråbe mikroskop nedsænkning olie i midten af diaset.
- Løstag membranen fra skæret ved hjælp af en skalpel, der skærer rundt om membranens omkreds på indersiden af plastik indsatsen.
- Fjern membranen med tang, og Placer den på toppen af olie faldet på sliden for at holde den på plads.
Bemærk: Membranerne er meget tynde og meget lette, så de let kan gå tabt ved blid luftstrøm.
3. billeddannelse og analyse
- Da de porøse membraner er klare og farvnings celler med krystalviolet give dem kontrast, bruge et sammensat lys mikroskop til at se cellerne. Brug et kamera og/eller software til at kvantificere for mange prøver, men er ikke nødvendig. Vis celler ved 5x, 10x eller 20x forstørrelse. For kvantificering, bruge flere, ikke-overlappende billeder ved 10x forstørrelse. Alternativt tælle alle migrerede celler på membranen ved 10x forstørrelse.
- Bestem det samlede antal invaderende celler eller celler pr. område for alle prøver. For hvert eksperiment skal du udføre hver betingelse i analysen med tre replikat skær og gentage flere gange for statistisk brugbare resultater.
- Når du sammenligner forskellige cellelinjer med forskellige vækstrater og migrations hastigheder, skal du udføre et parallelt eksperiment for at sammenligne celler, der invaderer gennem en protein matrix og sammenlignes med en BoyDen-kammer samling uden protein matrix (kun migrerede celler). Beregn procent invasion for hver cellelinje (antal invaderede celler/antal overførte celler x 100%).
Bemærk: Denne fremgangsmåde kan hjælpe med at sammenligne invasions raten med migrations raterne. Hvis man sammenligner forskellige betingelser, der anvendes på den samme cellelinje, beregning af invasion alene er mere relevante beregninger. Membranens yderkant har sommetider et højere antal celler end de centrale områder og er derfor mindre præcis. Hvis dette sker, skal du udelukke disse celler fra kvantificeringen og sikre, at alle celler fjernes af en vatpind i et gentagelses eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode til in vitro-invasion gennem en protein matrix blev brugt til at vurdere de aggressive fænotyper og onkogene celle adfærd af mus brysttumor celler med ændret udtryk for zink finger protein ZC3H88. I forbindelse med andre tilgange, der også undersøger celle migration og vækst i 3D-miljøer, blev det konstateret, at højere niveauer af ekspression af Zc3h8 i tumorcellelinjer, eller ved promotor-medieret udtryk fra en plasmid, resulterede i hurtige rater af celle spredning, hurtig migration, vækst i 3D-miljøer, og øget invasion i in vitro invasion assay8. Omvendt resulterede nedsat ekspression ved shRNA-konstruktioner i mindre aggressiv spredning, migration og invasion8. Disse resultater blev bekræftet in vivo, hvor højere ekspression af Zc3h8 producerede større tumorer, der dukkede hurtigt, mens nedsat udtryk Produceret færre tumorer, der var mindre og mindre hyppige8.
For at udvide, at dette arbejde, udtryk plasmider kan redde shrna-mediated Knockdown af Zc3h8 udtryk var stabilt transficeret i mus bryst celler til at evaluere, om aggressiv cellevækst og adfærd kunne genetableres i disse celler. Alle Knockdown og redning af udtryk blev verificeret af Western blot eller RT-qPCR8. En invasion analyse blev brugt med 5.000 celler pr kammer i en 24-brønd skål og dokumenteret med fotografier som vist i figur 1 og figur 2. Figur 3 viser resultaterne af invasionen analyse, der viser, hvordan celle invasion faldt på shrna Knockdown af Zc3h8 udtryk, men at invasionen er reddet, når udtrykket er reddet. Disse data viser, at invasionen analyse kan give en hurtig metode til afprøvning af cellelinjer in vitro, før der påbegyndes dyrere og langvarige tilgange.
Figur 1: invasion analysekomponenter. (A) BoyDen kammer skær til en 24-brønd vævskultur skål. B) en 24-brønd vævskultur skål, der anvendes til fiksering, farvning og vask efter 22 timers inkubation med celler. Tal 1, 2 og 3 replikater af en enkelt cellelinje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en invasion-analyse rutediagram med tids skalaen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: prøve invasion analyseresultater af en mus brysttumor celler ændret for ekspression af Zc3h8, som ændrer onkogene fænotype. (A, B) Celler isoleret fra mus brysttumorer var stabilt transficeret med shrna rettet mod en kontrol sekvens af mRNA eller målretning Zc3h8 mRNA. (C) den senere cellelinje blev derefter reddet ved at udtrykke rekombinant Zc3h8 designet til at være upåvirket af shrna. Celler er farvet med krystalviolet og fanget ved 10x forstørrelse ved hjælp af et let mikroskop. Scale bar = 500 μm.D) kvantificering, der viser, at reduceret ekspression af Zc3h8 reducerede antallet af invaderende celler og metastase potentialet. Redning af genekspression redder højere rater af celle invasion. Værdier repræsenterer det samlede antal invaderende celler fra en 24-brønd invasion analyse INSERT. For hver replikat i forsøget blev det gennemsnitlige antal invaderende celler beregnet. Dette blev gentaget for tre eksperimenter. Fejllinjer indikerer en standardfejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro invasion assay er en billig, hurtig, kvantitativ, og ligetil metode til at studere de faktorer, der fremmer kræft celle invasion. Brystkræft er den mest almindeligt diagnosticeret kræft blandt kvinder. Af de tre store undertyper af brystkræft, Triple negative, (eller ER-, PR-, HER2/Neu-), er den mest aggressive, mest sandsynligt at metastasize, og mest dødbringende9. Derfor, forstå de gener og udtryk, der resulterer i metastase kan hjælpe med at finde nye terapeutiske mål og genetiske markører for sygdommen. Mens mange af de gener, der er vigtige for kræft celle invasion og metastase er blevet identificeret og karakteriseret, ekspressionsniveauer og aktivitet af metastase chauffører versus metastase suppressorer kan være et kritisk aspekt af sygdomsprogression9, 10.
Beyond genekspression, in vitro invasion assay er også blevet brugt til at studere rollen som MicroRNA og andre regulatorer i enten fremme eller forebygge kræft celle invasion11,12. Den in vitro invasion setup metode kan bruges til studiet af hæmmere, multi-celletype tumor miljøer, CRISPR-redigerede celler, eller kortsigtede ændringer til cellulære vækst miljøer. Alsidigheden og tilpasningsevnen gør denne analyse meget fordelagtig.
Invasionen analyse kan anvendes i et første skridt i analysen af gener og faktorer, der bidrager til eller forhindre tumorprogression. For eksempel, Yan et al. (2010) brugte in vitro invasion assays at definere rollen som GATA-3 i undertrykke EMT af den meget aggressive brystkræft cellelinje MDA-MB 23113. De blev derefter i stand til at påvise, at denne undertrykkelse korrelerede med en nedsat evne til at danne metastaser i en in vivo-analyse13. Potentielle terapeutiske strategier kan i første omgang karakteriseret ved evnen af pathway hæmmere til at begrænse invasion gennem Matrigel, også korrelation med effekten af disse hæmmere på tumordannelse i dyremodeller. In vitro invasion assay kan bruges til mere dybtgående analyse af kendte og potentielle onkogener og interagerende partnere. For eksempel, molekylære dissektion af kendte funktionelle motiver af en oncoprotein eller hurtig analyse af mutationer kan gøres med in vitro invasion assay som en indledende skærm eller vurdering af betydning. Dette kan give værdifuld indsigt i kritiske domæner samt en funktionel forståelse af celle fænotyper på molekyleniveau.
Mens BoyDen Chamber invasion assay har mange fordele, der er begrænsninger. For eksempel, invasionen analyse ser kun på intravasation, en af de første skridt metastase, men ikke de senere trin, når kræftceller kolonisere sekundære steder. Der kan derfor kun indgås en delvis visning af metastase potentialet. Den 22 h længde af analysen, mens fleksibel, kan ikke udelukke nogle celle division, der kunne skråtstille subtile ændringer i målingen invasion af asynkrone cellepopulationer. Hæmmere såsom Mitomycin C kan bruges til at forhindre celledeling i tilfælde af hurtigt dykker celler. Endelig vil brugen af 5% FBS opløsning til chemotaxis langsomt diffus over tid og ligevægt mellem både øvre og nedre kamre. Tætheden af protein gel bremser denne diffusion og præsenterer cellerne med mulighed for at migrere sideværts over gelen og membranen (haplotaxier) eller gennem protein matrixen og gennem porerne mod de højere koncentrationer af FBS (chemotaxis). Alternative chemotaxis agenter kan substitueres eller kortere tid kvoter for invasion kan bruges til at måle kun de celler, der invaderede forud for ligevægt. Det er fleksibiliteten, ikke stivheden, af in vitro invasion assay, der giver mulighed for tilpasning, der gør denne analyse så nyttig. Fremtidige tilpasninger af denne analyse omfatter en storstilet screening af forbindelser, genekspressions ændringer og vurdering af allel-specifik lægemiddel effektivitet. Desuden kan et dobbelt kammer system med cirkulerende medier udfordre celler til at invadere gennem en protein matrix, krydse et flydende miljø og genetablere på en anden protein matrix på et sekundært sted. Endelig, en mere udfordrende membran kan bruges med in vitro invasion assay system såsom en enkeltlags af ikke-invasive celler, der ville være vanskeligere for kræftceller til at krydse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Grant R15CA169978 fra National Institutes of Health. Yderligere finansiering kom fra Villanova University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
