Summary
The in vitro celle invasjon analysen brukes til å måle potensialet av kreft metastasering ved kvantifisere mobilnettet potensialet for invasjon og migrasjon ved hjelp cellekultur innsatser som inneholder protein matrise. Celler blir utfordret til å migrere gjennom protein matrise og en porøs membran, mot en chemoattractant, og deretter kvantifisert av lys mikroskopi.
Abstract
The in vitro invasjon analysen bruker en protein-rik matrise i en Boyden kammer for å måle evnen til kultivert celler til å passere gjennom matrisen og en porøs membran i en prosess analog til de første trinnene av kreftcelle metastasering. De testede cellene kan endres for genuttrykket eller behandles med hemmere for å teste for endringer i invasjons potensialet. Dette eksperimentet tester den aggressive fenotype av musen melke tumorceller til å oppdage og karakterisere potensialet oncogenes som fremmer celle invasjon. Denne teknikken kan imidlertid være allsidig og tilpasset mange forskjellige bruksområder. Eksperimentet i seg selv kan gjøres på en dag og resultatene er ervervet av lys mikroskopi på mindre enn en dag. Resultatene inkluderer tellinger av antall invaderende celler for sammenligning og analyse. The in vitro invasjon analysen er en rask, billig og entydig metode for å bestemme celle atferd i en kultur som kan brukes som en innledende vurdering før mer involvert i vivo analyser.
Introduction
The in vitro invasjon analysen kan være et nyttig verktøy når måle en celle evne til å migrere gjennom en protein-belagt membran, analoge til de første trinnene i metastasering. En viktig funksjon av ondartede kreftceller er deres evne til å migrere gjennom og invadere nærliggende vev. Kreft som har spredt eller metastasized utgjør mer behandling utfordringer og har lavere priser på lang tids overlevelse, mens lokaliserte svulster er lettere å behandle og har høyere forekomst av langsiktig overlevelse. For å metastase, må kreftceller forlate den primære svulst og migrere til sirkulasjons-eller lymfesystemet, en prosess som krever passerer gjennom ekstracellulære matrise og kjeller membran1. I prosessen kalt epitel mesenchymal overgang (EMT), må tumorceller bryte celle-celle kontakter, migrere directionally, og invadere nærliggende blod eller lymfe fartøy. De første trinnene i denne metastasering Cascade er av stor interesse siden disse trinnene er hva som kan gjøre kreft dødeligere. De genetiske og epigenetic faktorene som er involvert i de tidlige trinnene i metastasering er fokuset for en stor mengde forskning, men nøyaktige og pålitelige eksperimentelle verktøy er nødvendig for å teste disse tidlige trinnene både in vivo og in vitro.
Verktøy for å måle endringer i celle migrasjon som sår helbredelse (scratch) analyser eller vekst i 3D-miljøer som myke agar analyser kan delvis adressen behovet for eksperimentelle metoder for å måle tidlige trinn av metastasering, men en analyse for å måle invasjonen er mer utfordrende siden prosessen skjer i kroppen innenfor en kompleks svulst mikromiljøet. Ved anvendelsen av screening narkotika eller gen endringer for å fastslå viktige faktorer i invasjon og metastasering, et system som kan brukes in vitro med kultivert celler og etterligne de utfordringene som møter metastatisk celler in vivo er invasjonen analysen2, 3i denne. Brystkreft er den hyppigst diagnostisert type kreft hos kvinner og den andre ledende årsak til kreft død hos kvinner, så forstå gener ansvarlig for brystkreft celle invasjon og metastasering er kritisk viktig for folkehelsen. Videre er muse celler et nyttig modell system for å studere brystkreft og dens progresjon.
The in vitro invasjonen analysen er basert på Boyden Chamber forsamlingen der to kamre av vekst Media er adskilt av en porøs membran3. For å etterligne svulsten mikromiljøet, en protein-rik gel er også inkludert for å skille celler i ett kammer fra en chemoattractant i den andre og fungere som en kjeller membran barriere. For å migrere mot chemoattractant, må cellene først passere gjennom protein-rik barriere deretter passere gjennom den porøse membranen-en prosess som tilsvarer hvordan metastatisk celler migrere gjennom stroma. Den protein rike gel kan endres basert på behovene til eksperimentet, men vanligvis består av kollagen, eller kjeller membran ekstrakt (f. eks, Matrigel)4. Det er en kompleks blanding av proteiner, proteoglycans og vekstfaktorer, men hovedsakelig består av laminins og kollagen IV 4,5. Celler må da passere gjennom en porøs membran vanligvis laget av polykarbonat, polyester, eller polytetrafluoretylen (PTFE). Membraner kan kjøpes kommersielt med eller uten en protein gel (vanligvis kollagen), eller gel kan kjøpes separat og lagt til. Størrelsen på porene kan justeres basert på cellestørrelsen. Mens pore størrelser er tilgjengelige fra 0,4-8,0 μm, bare porene fra 3,0-8,0 μm er store nok for celle migrasjon. Invasjonen analysen har blitt brukt til å bestemme effektiviteten av hemmere på evnen til cellene til å migrere og invadere. Mens mangler den eksakte tumor mikromiljøet som er til stede i Vivo, in vitro invasjon analysen er gunstig på screening mange forhold på kort tid samtidig minimere behovet for dyremodeller. Målet med disse eksperimentene er å sammenligne genuttrykk for mistenkte oncogenes og bestemme virkningene på kreftcelle atferd og sykdom aggressivitet bruker in vitro invasjon analysen og andre tester. Samlet, invasjonen analysen gir konsistent, kvantitative og raske resultater for å bestemme metastatisk potensial samtidig være en relativt billig, grei, og tilpasningsdyktig metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og metoder ble utført som autorisert av Villanova University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. Gene uttrykk i kultivert Mouse melke tumor celler
- Først klargjør du cellelinjene som skal testes.
-
Bruk en avl koloni av BALB/cV mus. Disse musene bære BALB/cV stamme av mus melke tumor virus, overføres til valper i melk6,7. 50 prosent av avl kvinner utvikler brystkreft svulster med 10 måneders alder.
- Å etablere en svulst cellelinje, ofre en svulst bærende demning ved hjelp av en IACUC-godkjent protokoll. Sug mage huden i 70% EtOH og fjern svulsten under sterile forhold i en laminær strømnings hette. Svulster er subkutan, så pass på å unngå punktering peritoneum.
- Plasser tumor fragmenter fra ikke-nekrotisk områder i en Petri parabol med en liten mengde sterile Hanks balansert Saline Solution (HBSS) og hakke veldig fint med en steril barberhøvel blad.
- Overfør de spredte celle klumper til en T25 cellekultur kolbe som inneholder 5 mL Dulbecco ' s modifisert Eagle medium eller DMEM (4,5 g/L glukose, fenol rød, og L-glutamin) supplert med 50% fosterets storfe serum eller FBS og 1% antibiotika/antimykotisk løsning. Vokse celler i behandlet cellekulturflasker i en inkubator med 5% CO2 og 100% fuktighet ved 37 ° c.
- Vask av ikke-tilhenger celler etter 24-48 h og erstatte DMEM med 50% FBS og 1% antibiotika/antimykotisk løsning. Returner cellene til inkubator.
- Erstatt flytende kultur Media hver 3 dager.
- Del eller passasje cellene når de er 90% confluent. Fjern kultur medier og vask tilhenger celler med HBSS (uten kalsium eller magnesium). Ruge celler med 0,25% Trypsin-EDTA løsning for 1-5 min ved 37 ° c til cellene er avrundet og løsrevet. Fortynne celler 1:10 i fersk kultur Media og legge til en ny kolbe. En T-25 cellekultur kolbe krever 5-8 mL kultur Media, 5 mL HBSS å vaske, og 1 mL Trypsin-EDTA til passasje. Returner flasken til inkubator.
- Reduser FBS konsentrasjon til 40% etter den første passasjen, deretter 30% etter den andre passasjen, deretter 20% etter den tredje passasjen, og til slutt 10% for alle etterfølgende passasjer. Prosessen med å etablere vekst i standard DMEM medium med 10% FBS krever fire passasjer og 2-8 måneder.
-
Når cellelinjen (e) er etablert, endre uttrykket av mistenkte oncogenes ved transfeksjoner av shRNA målretting mRNA eller CRISPR for ikke-essensielle gener.
- Etablere antibiotika-resistente stabile cellelinjer med individuelle kloner som er verifisert av Western Blot og/eller RT-qPCR for konsistente resultater, men forbigående transfections kan fungere så godt siden analysen bare krever 22 h. Kontroller cellelinjer med Det kreves også ikke-spesifikke mål sekvenser.
2. i vitro Invasion-analysen
- Grow tilhenger mus melke tumorceller i en T25 kolbe til 70-90% confluent for dag 1 av eksperimentet.
Merk: Andre cellelinjer eller eksperimentelle forhold kan kreve ulike cellekultur medier. For eksempel, hvis hormon-responsive brystkreftceller blir testet, trekull-filtrert serum kan være nødvendig å fjerne forbindelser som aktiverer østrogen eller andre hormon reseptorer. - Forbered Boyden kammer innsatser ved å varme dem til romtemperatur (fra-20 ° c lagring) i ca 20 min i en cellekultur hette. Unngå fryse-tine sykluser for ubrukte innsatser. Bruk tre innsettinger (replikerer) til å generere statistisk gyldige data for hver cellelinje for hvert eksperiment.
- Legg til pre-varmet 37 ° c serum fritt DMEM Media til brønnen og deretter innsatsen. For innsatser designet for 24-brønn retter, tilsett 500 μL av serum fri DMEM til brønnen og deretter 500 μL av serum fri DMEM til innsatsen, slik at den porøse membranen og gelen er hydrert på begge sider.
Merk: For større innsatser designet for en 6-brønn, bruk 2 mL serum fri DMEM på begge sider.
- Legg til pre-varmet 37 ° c serum fritt DMEM Media til brønnen og deretter innsatsen. For innsatser designet for 24-brønn retter, tilsett 500 μL av serum fri DMEM til brønnen og deretter 500 μL av serum fri DMEM til innsatsen, slik at den porøse membranen og gelen er hydrert på begge sider.
- Plasser fatet med inserts i en 37 ° c cellekultur inkubator med 5% CO2 og 100% fuktighet i minst 2 t for å grundig hydrere og acclimate.
- Forbered celler ved å fjerne vekst mediene og skylle cellene med 5 mL HBSS.
- Fjern HBSS og tilsett 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA-løsning for 1-5 min ved 37 ° c eller til cellene vises avrundet eller Vis tegn på løsgjøring fra flasken.
- Trykk forsiktig på flasken for å løsne alle cellene. Resuspend cellene i 5 mL DMEM + 10% FBS og Overfør til et sterilt 15 mL sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 1 000 x g i 5 min for å forsiktig pellet cellene. Fjern mediene og Bytt ut med 5 mL serum fri DMEM for å resuspend cellene.
- Gjenta sentrifugering og suspensjonen i serum frie medier to ganger for totalt 3 vasker.
- Grundig resuspend cellene i siste 5 mL serum fri DMEM og sikre at det ikke er noen klumper av celler.
- Bestem celle konsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer. Count bare levedyktige celler. Fortynne celle fjæringen til 5 x 104 celler/ml i 5 ml serum fri DMEM.
Merk: Denne konsentrasjonen gir 2 500 celler per sett i en 24-brønn. Dette antallet celler er nok for aggressive kreftceller med høy forekomst av migrasjon og invasjon. Mindre aggressive cellelinjer kan kreve flere celler, opptil 10 000 celler per INSERT for Observer invaderende celler. Hvis redusert celle invasjon er forventet, vurdere å maksimere invaderende celler ved å øke celle nummer. Hvis det forventes økt celle invasjon, begynner du med færre celler. - Fjern cellekultur parabolen fra inkubator og forsiktig aspirer Media fra innsatsen. Løft innsatsen og aspirer utskriftsmaterialet fra brønnen. Arbeid raskt, tilsett chemoattractant til nedre kammeret. For en 24-god tallerken, tilsett 750 μL av DMEM med 5% FBS.
- Plasser innsatsen i brønnen og Legg cellene til innsatsen. For en 24-god tallerken, bruk 500 μL av celle fjæring. For en 6-Well parabolen sette inn, bruk 2,5 mL chemoattract og 2 mL celler. Sørg for at det ikke finnes bobler av luft på hver side av membranen.
- Returner parabolen til cellen kultur inkubator for 22 h.
- Etter 22 h, fikse og beis cellene. Forbered en løsning på 1% paraformaldehyde i 1x fosfat bufret saltvann (PBS) for fiksering.
- I en ren 24-brønn cellekultur parabol, tilsett 1 mL bindemiddel til individuelle brønner så det er en brønn for hver innsats.
- Forbered farging løsning (ferskt gjort) av 0,1% krystall fiolett (w/v) i en løsning av PBS med 10% etanol (v/v). På samme måte, tilsett 1 mL farge løsning på en ren brønn i en 24-brønn kultur rett for hver innsats.
- Fjern hver sette en om gangen med tang og plassere en steril bomullspinne inne i innsatsen og tørk den øvre siden av membranen for å fjerne unmigrated celler.
- Gjenta med en ekstra bomullspinne. Membranen er ganske sterk, så forsiktig trykk mens skure ikke kompromiss integriteten av membranen.
- Fjern eventuelle gjenværende medier fra innsiden av innsatsen og tilsett 750 μL av PBS for å vaske bort frittliggende celler.
- Fjern PBS og gjenta vasken. Plasser innsatsen i en brønn som inneholder bindemiddel for å fikse de overførte cellene på undersiden av membranen. Gjenta for alle innsettinger.
- Fest innsatsene i 15 minutter ved romtemperatur.
- Etter fiksering fjerne innsatsen. Vask innsatsen igjen med 750 μL PBS.
- Plasser innsatsen i brønnen med farge løsningen for å fargelegger alle overførte og faste celler. Stain cellene i 15 min ved romtemperatur.
Merk: For 6-vel parabolen inserts, bruk 2 mL bindemiddel løsning, 2 mL farge løsning, og 2 mL PBS vask.
- Bruk et beger med destillert vann for å destain inn. Fjern inserts og dypp i destillert vann til vannet renner av innsatsen er klar.
- Fjern eventuelle overskytende vanndråper og plassere inserts på et filter papir sidelengs til lufttørke (vanligvis over natten).
- Forbered membranen for Imaging ved å merke et rent glass mikroskop lysbilde for hver innsats og plassere en liten dråpe mikroskop nedsenking olje i midten av lysbildet.
- Løsne membranen fra innsatsen ved hjelp av en skalpell å skjære rundt omkretsen av membranen på innsiden av plast innsatsen.
- Fjern membranen ved hjelp av pinsett og plasser på toppen av olje dråpe på lysbildet for å holde den på plass.
Merk: Membraner er svært tynne og svært lette, slik at de lett kan gå tapt ved skånsom luftstrøm.
3. Imaging og analyse
- Siden de porøse membraner er klare og flekker celler med krystall fiolett gi dem kontrast, bruk en sammensatt lys mikroskop for å vise cellene. Bruk et kamera og/eller programvare for å kvantifisere for mange eksempler, men er ikke nødvendig. Vis celler med 5x, 10x eller 20x forstørrelse. For kvantifisering, bruk mangfoldig, ingen-overlappe profilen for 10x forstørrelsen. Alternativt kan du telle alle overførte celler på membranen ved 10x forstørrelse.
- Bestem totalt antall invaderende celler eller celler per område for alle prøvene. For hvert eksperiment, utføre hver tilstand i analysen med tre replikere innsettinger og gjenta flere ganger for statistisk nyttige resultater.
- Når du sammenligner ulike cellelinjer med ulike vekstrater og migrasjon priser, gjør et parallelt eksperiment for å sammenligne celler som invaderer gjennom en protein matrise og sammenligne med en Boyden Chamber forsamlingen uten protein matrise (migrert celler bare). Beregn prosent invasjon for hver cellelinje (antall invadert celler/Antall overførte celler x 100%).
Merk: Denne tilnærmingen kan bidra til å sammenligne invasjonen rate til migrasjon priser. Hvis sammenligning av ulike betingelser gjelder for samme cellelinje, er beregning av bare invasjon mer relevante beregninger. Den ytre kanten av membranen har noen ganger et høyere antall celler enn de sentrale områdene og er derfor mindre nøyaktig. Hvis dette skjer, utelater du disse cellene fra kvantifisering og sørger for at alle cellene fjernes av en bomullspinne i et gjentatt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden for in vitro invasjon gjennom et protein matrise ble brukt til å vurdere den aggressive fenotyper og kreftfremkallende celle atferd av mus melke tumorceller med endrede uttrykk for sink finger protein ZC3H88. I forbindelse med andre tilnærminger som også undersøker celle migrasjon og vekst i 3D-miljøer, ble det funnet at høyere nivåer av uttrykk for Zc3h8 i tumor cellelinjer, eller av promoter-mediert uttrykk fra en plasmider, resulterte i rask forekomst av celle spredning, rask migrasjon, vekst i 3D-miljøer, og økt invasjonen i in vitro invasjonen analysen8. I motsatt fall resulterte redusert uttrykk ved shRNA konstruksjoner i mindre aggressiv spredning, migrasjon og invasjon8. Disse resultatene ble bekreftet i vivo der høyere uttrykk for Zc3h8 produsert større svulster som dukket opp raskt, mens redusert uttrykk produsert færre svulster som var mindre og mindre hyppige8.
For å utvide dette arbeidet, uttrykket plasmider som kan redde shRNA-mediert knockdown av Zc3h8 uttrykk var stabilt transfekterte i mus melke celler å vurdere om aggressiv cellevekst og atferd kan gjenopprettes i disse cellene. Alle knockdown og redning av uttrykkene ble verifisert av Western Blot eller RT-qPCR8. En invasjon analysen ble brukt med 5 000 celler per kammer i en 24-vel parabol og dokumentert med fotografier som vist i figur 1 og figur 2. Figur 3 viser resultatene av invasjonen analysen som viser hvordan celle invasjon redusert på shRNA knockdown av Zc3h8 uttrykk, men at invasjonen er reddet når uttrykket er reddet. Disse dataene viser at invasjonen analysen kan gi en rask metode for å teste cellelinjer in vitro før du tar fatt på dyrere og lange tilnærminger.
Figur 1: invasjon analysen komponenter. (A) Boyden Chamber inn for en 24-brønn vev kultur parabolen. (B) en 24-brønn vev kultur parabolen brukes til fiksering, farging, og vasking etter 22 h inkubasjons med celler. Tallene 1, 2 og 3 er replikeres av en enkelt cellelinje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: invasjon analysen flytdiagram med tidsskalaen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sample invasjonen analysen resultatene av en mus melke tumorceller endret for uttrykk for Zc3h8, som endrer kreftfremkallende fenotype. (A, B) Celler isolert fra mus melke svulster var stabilt transfekterte med shRNA målretting en kontroll sekvens av mRNA eller målretting Zc3h8 mRNA. (C) den senere cellelinjen ble deretter reddet ved å uttrykke rekombinant Zc3h8 designet for å være upåvirket av shRNA. Cellene er farget med krystall fiolett og fanget ved 10x forstørrelse ved hjelp av et lett mikroskop. Scale bar = 500 μm. (D) kvantifisering viser at redusert uttrykk for Zc3h8 redusert antall invaderende celler og metastasering potensialet. Redning av genuttrykk redder høyere forekomst av celle invasjon. Verdier representerer det totale antall invaderende celler fra en 24-brønn invasjon analysen sette inn. For hver replikere i eksperimentet ble gjennomsnittlig antall invaderende celler beregnet. Dette ble gjentatt for tre eksperimenter. Feilfelt angir standard feil i gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The in vitro invasjon analysen er en billig, rask, kvantitativ, og grei metode for å studere faktorene fremme kreftcelle invasjon. Brystkreft er den hyppigst diagnostisert kreft blant kvinner. Av de tre store undergrupper av brystkreft, trippel negativ, (eller ER-, PR-, HER2/Neu-), er den mest aggressive, mest sannsynlig metastase, og de fleste dødelige9. Derfor forstå gener og uttrykk som resulterer i metastasering kan bidra til å finne nye terapeutiske mål og genetiske markører for sykdommen. Mens mange av genene viktig for kreftcelle invasjon og metastasering har blitt identifisert og karakterisert, kan uttrykks nivåer og aktivitet av metastasering sjåfører versus metastasering Suppressors være en kritisk del av sykdomsprogresjon9, 10i.
Utover Gene Expression, in vitro invasjon analysen har også blitt brukt til å studere rollen som microRNA og andre regulatorer i enten fremme eller forebygge kreftcelle invasjonen11,12. The in vitro invasjon oppsettmetoden kan brukes for studiet av hemmere, multi-celle type tumor miljøer, CRISPR-redigerte celler, eller kortsiktige endringer i cellulære vekst miljøer. Allsidigheten og tilpasningsdyktighet gjør denne analysen svært fordelaktig.
Invasjonen analysen kan brukes i et første skritt i analysen av gener og faktorer som bidrar til eller forebygge tumorprogresjon. For eksempel, Yan et al. (2010) brukte in vitro invasjonen analysene å definere rollen som GATA-3 i undertrykke EMT av den svært aggressive brystkreft cellelinje MDA-MB 23113. De var da i stand til å vise at denne undertrykkelse korrelert med en redusert evne til å danne metastaser i en in vivo-analysen13. Potensielle terapeutiske strategier kan være i utgangspunktet preget av evnen til veien hemmere å begrense invasjonen gjennom Matrigel, også samkjøre med effekten av disse hemmere på tumor dannelse i dyremodeller. I vitro invasjon analysen kan brukes til mer inngående analyse av kjente og potensielle oncogenes og samarbeidspartnere. For eksempel kan molekylær Disseksjon av kjente funksjonelle motiver av en oncoprotein eller rask analyse av mutasjoner gjøres med in vitro invasjon analysen som en første skjerm eller vurdering av betydning. Dette kan gi verdifull innsikt i kritiske domener, samt en funksjonell forståelse av celle fenotyper på molekylnivå.
Mens Boyden Chamber invasjonen analysen har mange fordeler, det er begrensninger. For eksempel, invasjonen analysen bare ser på intravasation, en av de første trinnene i metastasering, men ikke de senere skritt når kreftceller kolonisere sekundære steder. Derfor kan bare en delvis visning av det metastasering potensialet avsluttes. Den 22 h lengden av analysen, mens fleksibel, kan ikke utelukke noen celle divisjon som kan skew subtile endringer i måling invasjon av asynkron celle populasjoner. Hemmere som Mitomycin C kan brukes til å hindre celledeling i tilfelle av raskt dykking celler. Til slutt vil bruk av 5% FBS løsning for chemotaxis langsomt diffus over tid og likevekt mellom både øvre og nedre kamre. Tettheten av protein gel bremser denne diffusjon og presenterer cellene med mulighet for å migrere sideveis over gel og membran (haplotaxis) eller gjennom protein matrise og gjennom porene mot høyere konsentrasjoner av FBS (chemotaxis). Alternative chemotaxis midler kan erstattes eller kortere tid kvoter for invasjon kan brukes til å måle bare de cellene som invaderte før likevekts. Det er fleksibiliteten, ikke stivhet, av in vitro invasjon analysen som gjør det mulig for tilpasning som gjør denne analysen så nyttig. Fremtidige tilpasninger av denne analysen inkluderer en storstilt screening av forbindelser, genuttrykk endringer, og vurdering av allel-spesifikke narkotika effektivitet. Videre kan et dobbelt kammer system med sirkulerende Media utfordre celler til å invadere gjennom et protein matrise, krysse et flytende miljø, og gjenopprette på en annen protein matrise på et sekundært sted. Endelig, en mer utfordrende membran kan brukes med in vitro invasjon analysen system som en monolag av ikke-invasiv celler som ville være vanskeligere for kreftceller å krysse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend R15CA169978 fra National Institutes of Health. Ytterligere finansiering kom fra Villanova University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
