Summary
Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.
Abstract
Organelas celulares, como mitocôndrias e retículo endoplasmático (er), criam uma rede para realizar uma variedade de funções. Estas estruturas altamente curvas são dobradas em várias formas para formar uma rede dinâmica, dependendo das condições celulares. A visualização desta rede entre mitocôndria e ER foi tentada usando a imagem latente e a microscopia de luz super-resolution da fluorescência; no entanto, a resolução limitada é insuficiente para observar as membranas entre as mitocôndrias e ER em detalhes. A microscopia eletrônica de transmissão proporciona um bom contraste de membrana e uma resolução de escala nanométrica para a observação de organelas celulares; no entanto, é excepcionalmente demorado ao avaliar a estrutura tridimensional (3D) de organelas altamente curvadas. Conseqüentemente, nós observamos a morfologia das mitocôndrias e do ER através da microscopia correlativa da luz-elétron (CLEM) e das técnicas da microscopia de elétron do volume usando a peroxidase realçada 2 do ascorbato e a mancha da peroxidase do rábano. Um método de coloração em bloco, o corte de série ultrafinos (tomografia de matriz) e a microscopia eletrônica de volume foram aplicados para observar a estrutura 3D. Neste protocolo, nós sugerimos uma combinação de CLEM e de microscopia de elétron 3D para executar estudos estruturais detalhados das mitocôndria e do ER.
Introduction
As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas1. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz2; Entretanto, a microscopia recente da super-definição3 e a microscopia de elétron (em)4 estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específica. EM é uma técnica apropriada para alcançar um contraste suficientemente de alta resolução para estudos estruturais das conexões entre mitocôndria e ER. Entretanto, uma desvantagem é a informação limitada do eixo z porque as seções finas devem ser aproximadamente 60 nanômetro ou mais finas para a microscopia de elétron convencional da transmissão (TEM). Para uma imagem EM z-axis suficiente, a microscopia eletrônica tridimensional (3DEM) pode ser usada5. No entanto, isso envolve a preparação de centenas de seções seriais finas de células inteiras, o que é um trabalho muito complicado que apenas alguns tecnólogos qualificados têm dominado. Estas seções finas são coletadas em grades de um furo de um buraco com revestimento de película de formvar frágil. Se a película quebra em um Gird, a imagem latente de série e a reconstrução do volume não são possíveis. A microscopia eletrônica de varredura do bloco-cara de série (SBEM) é uma técnica popular para 3DEM que use o corte destrutivo do bloco do en dentro da câmara de vácuo do microscópio de elétron da varredura (SEM) com uma faca do diamante (Dik-SBEM) ou um feixe focalizado do íon (FIB-SEM) 6. no entanto, porque essas técnicas não estão disponíveis em todas as instalações, sugerimos tomografia de matriz7 usando corte Serial e sem. No tomography da disposição, as seções de série cortadas usando um ultramicrotome são transferidas a um lamela de vidro em vez de uma grade de tem e visualizadas através da microscopia de luz e do sem8. Para aumentar o sinal para a imagem latente do elétron do backscatter (BSE), nós utilizamos um en Bloc em que mancha o protocolo que emprega o tetróxido do ósmio (Oso4)-pilhas fixas com thiocarbohydrazide osmiophilic (tch)9, permitindo que nós obtenhamos imagens sem coloração dupla pós-incorporação.
Adicionalmente, o marcador mitocondrial SCO1 (citocromo c oxidase assembly protein 1) – ascorbato peroxidase 2 (APEX2)10 molecular tag foi usado para visualizar mitocôndria no nível de em. APEX2 é de aproximadamente 28 kDa e é derivado de ascorbato de soja peroxidase11. Foi desenvolvida para mostrar a posição detalhada de proteínas específicas no nível do em da mesma maneira que a proteína proteína-etiquetada fluorescente verde é usada na microscopia de luz. APEX2 converte 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB) em um polímero osmiofílico insolúvel no local da tag na presença do peróxido de hidrogênio cofator (H2o2). APEX2 pode ser usado como uma alternativa à rotulagem tradicional do anticorpo no em, com uma localização da proteína durante todo a profundidade da pilha inteira. Em outras palavras, a proteína APEX2-etiquetada pode ser visualizada pelo osmication específico11 sem rotulagem immunogold e permeabilização após ultra-cryosectioning. A peroxidase de rábano (HRP) também é uma marca sensível que catalisa a polimerização de H2o2dependente de DAB em um precipitado localizado, proporcionando contraste em em após o tratamento com Oso4. A sequência do peptídeo alvo de ER HRP-KDEL (Lys-Asp-Glu-leu)12 foi aplicada para visualizar er dentro de uma célula inteira. Para avaliar nosso protocolo de utilização de Tags genéticas e de coloração em bloco com ósmio reduzido e TCH (método rOTO), utilizando o efeito de osmicação ao mesmo tempo, comparamos o contraste da membrana com e sem o uso de cada tag genético na mancha de rOTO en Bloc. Embora 3DEM com tomografia de matriz e coloração DAB com APEX e HRP tenham, respectivamente, sido utilizados para outros fins, nosso protocolo é único porque temos combinado tomografia de matriz para 3DEM e DAB coloração para mitocôndria e ER rotulagem. Especificamente, nós mostramos cinco pilhas com e sem os genes APEX-etiquetados na mesma seção, que ajudada em investigar o efeito da modificação genética em pilhas.
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Protocol
1. cultura de pilha com o transfection modelado do prato e da pilha da cultura da grade com SCO1-APEX2 e vetor do plasmídeo de HRP-KDEL
- Semente 1 x 105 HEK293T células, colocando-os em 35-mm de vidro grade-fundo pratos de cultura em uma atmosfera humidificada contendo 5% co2 a 37 ° c em Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino, 100 U/ml penicilina e 100 U/mL de estreptomicina.
- O dia após a semeadura das células, quando eles cresceram para 50%-60% confluência, introduzir o SCO1-APEX210 e HRP-KDEL12 plasmídeo para as células usando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + DNA de plasmídeo HRP-KDEL 0,5 μg por 3 μL de reagente de transfecção).
2. fotomicroscopia de células que crescem em pratos de cultura estampados e coloração DAB para APEX2 e HRP
- A 16-24 h após a transfecção, retire todos os meios de cultura e adicione imediatamente 250 μL de solução de fixação morna (30-37 ° c) (tabela 1) por pipetagem suave. Retire imediatamente a solução de fixação e substitua-a por 1,5 mL de solução de fixação fresca. Incubar no gelo por 60 min, e depois lave três vezes por 10 min cada em 1 ml de tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M de gelo-frio (tabela 1).
Cuidado: os vapores de aldeído são extremamente tóxicos. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações. - Adicionar 1 ml de solução de glicina fria (0-4 ° c) 20 mm e incubar durante 10 min no gelo seguido de três lavas de 5 min cada em 1 ml de tampão de cacodilato de sódio a frio 0,1 M.
- Prepare uma solução nova de 1x DAB (3,33 ml de solução de cacodilato de 0,3 M + 10 μL de 30% H2O2 + 5,67 ml de água fria + 1 ml de solução de 10x DAB).
- Adicionar 500 μL da solução de 1x DAB recém-preparada (passo 2,3) e incubar no gelo por aproximadamente 5-45 min até que uma mancha marrom clara seja visível um microscópio de luz invertido (Figura 1a).
- Retire suavemente a solução DAB e enxague três vezes com 1 ml de tampão de cacodilato de sódio a frio de 0,1 M durante 10 min cada.
- Use um microscópio invertido de contraste de fase (ou um microscópio de luz de campo brilhante) para visualizar a coloração DAB em uma ampliação de 100x ou superior. Use uma caneta marcador para marcar a parte inferior do vidro onde a região de interesse (ROI) está localizada (Figura 1b, C).
3. preparação da amostra para o bloco EM
- Realize a cultura de células e a coloração DAB conforme descrito nas etapas 2.1-2.6.
- Post-Fix as amostras com 1 mL de 2% reduziu OsO4 para 1 h a 4 ° c.
PRECAUÇÃO: os fumos OsO4 são altamente tóxicos. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações. - Prepare uma nova solução TCH (tabela 1) durante a etapa 3,2 e passe por um filtro de 0,22 μm.
Cuidado: as emanações de TCH são altamente tóxicas. Realize todo o trabalho uma capa ventilada das emanações. - Retire o fixador e enxague três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min a cada temperatura ambiente (RT).
- Coloque as células em 1 mL de solução de TCH previamente preparada e filtrada por 20 min em RT.
- Enxague as células três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
- Expor as células uma segunda vez a 1 mL de 2% de tetroxida de ósmio em água destilada por 30 min em RT.
- Retire o fixador e enxague três vezes com 1 ml de água destilada durante 5 min cada na RT. Adicione 1 ml de acetato de uranilo a 1% (aquoso) e deixe durante a noite a 4 ° c no escuro.
- Lave as células três vezes em 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
- Solução de aspartato de chumbo de Walton pré-quente (tabela 1) em forno a 60 ° c por 30 min.
- Manchar as células com a solução de aspartato de chumbo de Walton adicionando 1 mL da solução de aspartato de chumbo pré-aquecido e, em seguida, coloque em um forno por 30 min a 60 ° c.
- Enxague as células três vezes com 1 mL de água destilada durante 5 min cada na RT.
- Incubar em uma série graduada de alíquotas de 2 mL de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 20 min cada em RT.
- Decantar o etanol e incubar por 30 min em 1 mL de 3:1 etanol: meio de mistura de baixa viscosidade incorporação em RT.
- Retire o meio e adicione 1 mL de 1:1 etanol: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Incubar por 30 min em RT.
- Retire o meio e adicione 1 mL de 1:3 etanol: meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Incubar por 30 min em RT.
- Retire o meio e adicione 1 mL de 100% de baixa viscosidade de incorporação de médio e incubar durante a noite.
- Incorporar a amostra em 100% baixa-viscosidade incorporação de mistura e incubar para 24 h em 60 ° c.
- Prepare 90-nm seções grossas usando um ultramicrotome.
- Observe a grelha em TEM a 200 kV.
4. serial seccionamento e montagem em indium-Tin-óxido revestido COVERSLIP para SEM imagem
-
Preparação do substrato
- Limpe o indium-estanho-óxido (ITO)-COVERSLIP de vidro revestido (22 milímetros x 22 milímetros) pela agitação delicada no isopropanol para 30-60 s.
- Retire as coberturas, drenar o excesso de isopropanol, e deixar em um ambiente livre de poeira até secar.
- Trate as coberturas de vidro revestidas com ITO por descarga de brilho usando um coater de plasma por 1 min.
Nota: a activação plasmática confere uma propriedade hidrófila na superfície do substrato. Cria uma película muito fina da água na carcaça para impedir a formação do enrugamento nas seções quando a seção é unida ao substrato. - Insira as coberturas de vidro revestidas com ITO no suporte do substrato e coloque-a no barco da faca.
-
Aparar o bloco de amostra e o corte Serial
- Insira o bloco de amostra no suporte da amostra do ultramicrotome e coloque-o no bloco de corte.
- Use uma lâmina de barbear para aparar todo o excesso de resina em torno da posição alvo (identificado na etapa 2,6, Figura 1D-G). A forma da face do bloco deve ser trapezoide ou retangular. A aresta principal e a borda à direita devem ser absolutamente paralelas (Figura 1h, I).
- Insira o suporte da amostra no braço do ultramicrotome e coloque a faca de diamante no porta-navalha. Insira as coberturas de vidro ITO no suporte da fita e prenda o transportador com a pega (Figura 1J). Coloque o suporte da fita no barco da faca e encha o barco da faca com água destilada filtrada (Figura 1K).
- Ajuste a posição da transportadora com o slide da faca, empurrando cuidadosamente a alça do suporte para definir a borda do vidro ITO perto da faca (Figura 1L).
- Depois de cortar a seção, parar o processo de corte, e lentamente abrir o parafuso de aperto do tubo e drenar o barco de água (taxa de fluxo de uma gota de água por segundo).
- Depois de completar o processo de coleta de fita, retire o substrato com a alça do dispositivo de aperto e seque a fita (Figura 1m).
5. imagem no SEM e alinhamento da pilha de imagens SEM
- Monte o lamela Ito-revestido em esboços de alumínio com fita adesiva do carbono. Selar a superfície de vidro e a superfície no topo com fita adesiva de carbono, e depois casaco com uma camada de carbono de 10 nm de espessura (Figura 1N).
- Observe a cobertura com cobertura de ITO em uma emissão de campo SEM com uma baixa tensão de aceleração de 5 kV e uma distância de trabalho adequada para a eficiente coleta de BSEs.
- Importe as imagens seriais para o software Image J (Fiji)13 usando a opção de pilha virtual. Abra um novo TrakEM14e importe a pilha de imagens para o trakem. Clique no botão direito do mouse e escolha o menu alinhar .
- Em seguida, selecione o intervalo de imagem (da primeira imagem para a última imagem). Conclua o alinhamento automático, salve o conjunto de dados alinhado e escolha Exportar para compilar uma imagem plana do intervalo de imagens selecionado (da primeira imagem para a última imagem). Por fim, salve os dados de imagem simples no formato AVI no menu principal do Image J.
Nota: suplementar filme 1 e suplementar filme 2 mostram a pilha de imagens sem e cortada pilha de imagens, respectivamente.
6. segmentação de mitocôndrias e ER de imagens seriais
- Inicie o 3dmod no software IMOD15 e abra arquivos de imagem.
- Na janela ZaP, desenhe o contorno das mitocôndrias e ER usando o botão do meio do mouse.
- Para visualizar o volume segmentado, abra a janela de visualização do modelo (filme suplementar 3).
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Representative Results
A Figura 1 descreve a agenda e o fluxo de trabalho para este protocolo. O protocolo requer 7 dias; no entanto, dependendo do tempo gasto na imagem SEM, isso pode aumentar. Para o transfection da pilha, a confluência das pilhas deve ser controlada de modo a para não cobrir a parte inferior da placa de grade inteira (Figura 1a). Uma densidade elevada da pilha poderia impedir a identificação da pilha do interesse durante o microscópio claro e a observação de EM. Nós usamos plasmídeos genetically etiquetados que expressaram APEX2 e HRP para selecionar eficientemente pilhas transfected entre as pilhas cultivadas numerosas no prato da cultura. Nós cultivou HEK293T pilhas e confirmamos a expressão de APEX2 SCO1-lig (espaço intermembranmitochondrial [IMS]) e de HRP-conjugated KDEL (ER) em pilhas co-transfected. microscopia de luz, as células APEX2-transfectadas foram manchadas de cor castanha, enquanto as células sem transfecção permaneceram não manchados (Figura 1a e Figura 2). Isso permitiu a identificação das células-alvo transfectadas, que foram então utilizadas para microscopia eletrônica de luz correlativa (CLEM), utilizando coloração DAB em uma população de células cultivadas (Figura 3D-F e Figura 4B). Foi útil marcar o fundo de vidro (Figura 1b, C) para facilitar a identificação da localização da célula alvo durante a etapa de incorporação plana (Figura 1e, F). Quando as células HEK293T foram tratadas com um protocolo de coloração "Osmium duplo" aprimorado (rOTO), as células inteiras foram manchadas de cor escura (Figura 1D). Depois de retirar a lamínula do prato de cultura, identificamos o local alvo na superfície do bloco um microscópio estéreo (Figura 1G). Nós aparamos as células no ROI em uma forma trapezoide, e as bordas principais e à direita foram feitas paralelas (Figura 1h, I). Para implementar a mitocôndria e reconstrução da rede ER, utilizou-se uma grande faca diamantada com um grande barco de água para a seção serialmente SCO1-APEX2 e HRP-KDEL-expressando células HEK293T (Figura 1J-L). As seções grossas da fita 90-nm de série foram unidas com sucesso ao lamela de vidro Ito-revestido (Figura 1m), e a superfície foi revestida com o carbono grosso de 10 nanômetro para a observação através de sem (Figura 1N).
As proteínas SCO1-APEX2 e HRP-KDEL geram sinais eletrônicos altamente densos derivados da conversão de DAB que são detectáveis em Met (Figura 3) e sem (Figura 4). A mancha escura gerada pelo SCO1-APEX2 foi observada exclusivamente no IMS e não no espaço matricial das mitocôndrias (Figura 3D). As pilhas co-transfected (a pilha esquerda na Figura 3D, e) com os plasmídeos de SCO1-APEX2 e de HRP-KDEL expressaram um sinal altamente denso do elétron em IMS mitochondrial e em er; Entretanto, não observamos nenhuma coloração de ER nas células que foram transfectadas apenas com SCO1-APEX2 (a célula direita na Figura 3D, F). Para imagens seriais usando SEM, primeiro, criamos uma visão geral de toda a imagem da matriz usando o detector de BSE em uma grande área (figura 4a). Em segundo lugar, o ROI foi colocado na primeira seção e propagado para todas as outras seções (Figura 4B). Por fim, visualizamos o ROI contendo cinco células-alvo com pixels de imagem de 5 Nm (Figura 4C). As imagens ampliadas revelaram estruturas subcelulares detalhadas (Figura 4D), como o aparelho de Golgi, mitocôndria, núcleos e er. As imagens seriais mostraram claramente que os contatos de ER-mitocôndria estavam ocorrendo em diferentes planos-z (filme suplementar 2 e filme suplementar 3).
Figura 1 : S amplo fluxo de trabalho de preparação para sem e tem. (A) um prato de cultura contendo coberturas em grelha foi semeado com células e manchado com DAB. (B,C) Após a coloração DAB, uma caneta marcador foi usada para marcar a parte inferior do vidro onde as células-alvo foram localizadas. (D) após oso4 que mancha, as pilhas transformam-se uma cor escura. (E, F) Os tubos da reacção EM cadeia do polymerase (PCR) (ou qualquer tipo de cápsulas de incorporação) foram usados para fazer facilmente um bloco do EM que conteve as posições marcadas. (E) vista superior. (F) Vista inferior. (G) uma imagem de microscopia estéreo de baixa ampliação da superfície de um bloco em. (H) o ROI está no meio da superfície plana. (I) uma imagem de microscopia estéreo de maior ampliação do ROI retangular. (J) as coberturas de vidro revestidas com Ito (asterisco branco) são inseridas no suporte da fita (seta azul), e o transportador é apertado girando o punho no sentido horário. (K, L) O punho do suporte é empurrado com cuidado, e o portador é ajustado para posicionar a borda do lamela de vidro Ito-revestido perto da faca deslizando. (M) as fitas são unidas às coberturas de vidro Ito-revestidas. (N) as coberturas de vidro revestidas com Ito são anexadas aos STUBS de sem, e o vidro residual é selado com fita adesiva de carbono e revestido com uma camada de rosca de carbono de 10 nm. Os asteriscos brancos indicam a lamínula de vidro revestida com ITO e os asteriscos pretos indicam a fita de carbono. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem de microscopia de contraste de fase invertida de células cultivadas HEK293T coradas com DAB. (A) coloração das células com DAB apenas (sem oso4 coloração). As setas brancas indicam as células não manchadas e as setas pretas indicam células com coloração DAB. (B) maior-imagem de ampliação do ROI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem latente de tem de pilhas HEK293T que exibem o IMS mitochondrial alvejado (SCO1-APEX2) e o er (HRP-KDEL). (A-C) Células HEK293T não transfectadas mostrando a dupla membrana das mitocôndrias (M) e retículo endoplasmático (er). (D-F) APEX2 e HRP catalisam a polimerização da DAB em um precipitado local, que é posteriormente manchado com OsO4de elétrons-denso. Um contraste escuro é aparente no IMS mitocondrial (ponta de flecha preta) e ER (seta preta); Entretanto, as pilhas que não foram transfected com HRP-KDEL exibem o ER não manchado (seta branca). Barras de escala: 1 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagem sem serial de células HEK293T exibindo o IMS mitocondrial alvo (SCO1-APEX2) e er (HRP-KDEL). (A) visão geral das fitas de secção serial observadas com o detector BSE. (B) correlação da imagem de baixa ampliação (Inset) com imagem de alta ampliação de BSE (caixa de linha pontilhada branca indica o ROI de células manchadas DAB). (C) alta ampliação das células alvo de ROI com pixels de imagem de 5 nm. (D, E) Um contraste escuro é aparente no IMS e no ER mitochondrial mas não no instrumento de Golgi. (F-I) Os contatos de ER-mitocôndria (seta branca) ocorrem em diferentes planos z. N, núcleo; M, mitocôndria; ER, Reticulum endoplasmático; G, aparelho de Golgi. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: receitas de soluções.
Suplementar filme 1: pilha de imagens sem. Fiji13 com trakem14 software foi usado para alinhar 91 imagens. O conjunto de dados alinhado original é 11 GB. Para reduzir o tamanho da pilha, o conjunto de imagens redimensionados e recortados foi usado. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme suplementar 2: pilha de imagens cortadas. Para visualizar as mitocôndrias, ER e seus sites de contato em detalhes, as imagens foram cortadas do conjunto de dados original (5 Nm/pixel). Barras de escala: 1 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Suplementar filme 3: reconstrução 3D de mitocôndria e er. Para visualização 3D, o contorno das mitocôndrias e ER foi segmentado e visualizado com o uso do software IMOD15 . As mitocôndrias foram visualizadas como estruturas tubulares longas (vermelhas), e as redes de ER (verde) mostraram sua morfologia complicada. O amarelo representou uma grande área de superfície do local do contato entre mitocôndria e ER em z-aviões diferentes. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Determinar a localização celular de proteínas específicas em uma resolução de nanômetro usando EM é crucial para compreender as funções celulares das proteínas. Geralmente, existem duas técnicas para estudar a localização de uma proteína alvo via EM. Uma delas é a técnica imunogantiga, que tem sido usada em em desde 1960, e a outra é uma técnica utilizando Tags geneticamente codificadas recentemente desenvolvidas16. As técnicas immunogold tradicionais empregaram partículas de ouro anticorpo-conjugated ou pontos quânticos para mostrar a posição da proteína etiquetada. No entanto, devido à exigência de anticorpos de alta qualidade e à eficiência de penetração dos anticorpos afetados pela resina e fixativa, esta técnica é significativamente limitada17. Especificamente, porque a rotulagem imunogold é predominantemente restrita à superfície de uma seção ultrafinos sem mancha de metal en Bloc e fixação de ósmio forte, esta técnica não é diretamente aplicável ao moderno 3dem18. Para usar os métodos recentes do 3DEM, incluindo o SBEM e o tomography da disposição, com rotulagem da proteína, nós utilizamos etiquetas geneticamente codificadas do em neste protocolo. As etiquetas geneticamente codificadas não necessitam de permeabilização, de ultra critilização tecnicamente exigente e de imunocoloração de secções individuais, pois localizam-se no local de interesse antes da fixação.
Os procedimentos para a preparação da amostra em 3DEM geralmente incluem uma combinação de fixação química comum e métodos de coloração de metais pesados porque as células são compostas principalmente de C, H, O e N, exigindo coloração com metais pesados para adquirir contraste EM9 . Conseqüentemente, nós empregamos a fixação reduzida do ósmio e a mancha do metal para realçar o contraste e a condutibilidade para a imagem latente de série. O procedimento para manchar amostras antes do corte, sabido como a mancha do en Bloc, foi relatado como uma etapa essencial para os métodos 3DEM tais como SBEM e FIB-SEM19. Nós confirmamos que as pilhas en Bloc-manchadas em nosso protocolo demonstraram o contraste desobstruído de SCO1-APEX2 e de HRP-KDEL em exclusivamente no IMS mitochondrial e no ER, respectivamente, em TEM (Figura 3). Além disso, as imagens de SEM das seções seriais 90-nm revelaram um contraste claro em ambas as organelas (Figura 4). Notavelmente, o contraste aprimorado pela coloração en Bloc foi distintamente distinguível do sinal DAB, e o contraste e a condutividade resultaram em imagens seriais de boa qualidade (Figura 4). Além disso, esse alto contraste auxilia na facilitação de tarefas subsequentes, como alinhamento e segmentação com software de imagem tridimensional (3D).
Nos últimos anos, as técnicas de microscopia eletrônica de volume (Dik-SBEM, FIB-SEM e tomografia de matriz) responderam a perguntas biológicas que exigiam a observação de um grande campo de visão e uma visão 3D. Dik-SBEM e FIB-SEM não envolvem a manipulação física das seções, assim que demorado para o alinhamento das imagens pode ser reduzido. No entanto, a amostra deve ser destruída para obter imagens seriais, e o campo de visão é menor do que o da tomografia de matriz. A imagem SEM série usando o tomography da disposição é empregada cada vez mais como uma alternativa ao seccionamento de série de TEM, e a vantagem principal desta técnica é sua maneira não-destrutiva e grande campo de visão. Ao contrário de outras técnicas 3DEM tais como Dik-SBEM e FIB-SEM, as seções podem ser armazenadas em um COVERSLIP, em um COVERSLIP ITO-revestido, em um wafer do silicone, ou em uma fita e podem repetidamente ser imaged7.
APEX2 é fácil de usar e pode dar uma ampla gama de densidades de coloração sem equipamento especial, ao contrário do mini gerador de oxigênio singlet20 ou proteínas fluorescentes21 técnicas, gerando precipitação DAB através de uma fotooxidação. Sua aplicação variável foi testada em diversas organelas celulares que incluem o núcleo, a membrana do plasma, a matriz das mitocôndria, os cristae mitochondrial, o ER, o tubulin, e o actina em COS 7 e HEK293T a pilha22. No entanto, existem algumas limitações e vários pontos de verificação para o uso de marcação geneticamente codificada em micrografias de elétrons. Os níveis da expressão dos genes exógenos devem ser controlados para conseguir a mancha razoável no nível do em porque se a expressão da etiqueta genética é demasiado elevada, pode induzir sinais falso-positivos e perturbe o ultraestrutura das pilhas através da ruptura da membrana e agregação da organela subcelular23. Outro problema possível é a supercoloração DAB, que foi relatado para causar desfoque e destruição de membrana22. Para garantir a expressão adequada dos genes, as células com coloração DAB foram comparadas com células não manchadas, utilizando tanto a microscopia de luz quanto a EM (Figura 2 e Figura 3). Adicionalmente, o nível de fixação deve ser bem regulado para garantir que as oxidases endógenas estejam totalmente inativas. Para evitar quaisquer artefatos de oxidases endógenas durante o processamento, corrigimos uma monocamada de células em vez de usar células separadas e peletizadas24. Isso também ajudou a identificar as células de interesse quando verificamos o sinal DAB microscopia de luz. Assim, nossos resultados indicam que a coloração e a fixação de monocamadas celulares são úteis para CLEM utilizando coloração DAB (Figura 2). As imagens seriais com tomografia de matriz e modelo 3D revelaram que os sites de contato de ER-mitocôndria ocorrem em diferentes planos-z (filme suplementar 2 e filme suplementar 3). A imagem produz uma visualização 3D completa das redes mitocondrial e ER em células inteiras (filme suplementar 1). Sugere a análise do volume 3D é essencial para a comparação quantitativa de contatos do ER-mitocôndria. Ao estudar as complexas redes de organelas intracelulares, esta é uma técnica excepcionalmente útil.
Em conclusão, este protocolo foi uma combinação eficiente de técnicas CLEM e 3DEM que permitiram a investigação de células inteiras no nível de EM. Notavelmente, duas marcas diferentes ao mesmo tempo e sinais DAB em duas organelas diferentes eram visíveis em uma célula inteira. Além disso, células rotuladas e células sem rótulo na mesma seção podem ser comparadas, por causa do EM em grande escala. Neste protocolo, a mancha da coligação do en e os sinais do DAB das etiquetas genetically codificadas eram úteis investigar a interação entre organelas membranous em pilhas inteiras. Esta pode ser uma aplicação adequada para EM EM larga escala para investigar outras interações celulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa básica de KBRI através do Instituto de pesquisa do cérebro de Coreia financiado pelo Ministry da ciência e das TIC (19-BR-01-08), e pela Fundação Nacional da pesquisa da concessão de Coreia (NRF) financiada pelo governo de Coreia (MSIT) (no. 2019r1a2c1010634). SCO1-APEX2 e HRP-KDEL plasmídeos foram gentilmente fornecidos por Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Os dados do TEM foram adquiridos nas instalações do núcleo de pesquisa cerebral da KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
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