Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Biz bir plaka okuyucu kullanarak ince film koşullarında hava yolu yüzeyi sıvı pH dinamik ölçümler yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Son yıllarda, uçaklardaki mukozal yüzey pH 'Sı önemini hava yolu yüzey sıvı (ASL) hidrasyon, mukus viskozitesi ve antimikrobiyal peptidler aktivitesini düzenleyen yeteneği ile vurgulanır, doğuştan savunma dahil anahtar Parametreler Akciğer. Bu, bu parametrelerin disdüzenli olduğu kistik fibrozis (CF) gibi kronik solunum hastalıkları alanında birincil alaka şeklindedir. Farklı gruplar hem in vivo hem de vitro olarak ASL pH eğitimi alırken, yöntemleri, CF ve CF olmayan hücreler arasındaki pH farklılıkları ile ilgili olarak nispeten geniş bir yelpazede ASL pH değerleri ve hatta çelişkili bulgular bildirir. Ayrıca, protokoller her zaman yeniden üretilebilirliği sağlamak için yeterli ayrıntı sağlamaz, çoğu düşük verim ve pahalı ekipman veya uygulamak için özel bilgi gerektirir, onları zor çoğu laboratuvarlarda kurmak için yapma. Burada, ASL pH 'nin ince film koşullarında daha yakından in vivo durumuna benzeyen gerçek zamanlı ölçümünü sağlayan yarı otomatik floresan plaka okuyucu tahlili açıklanmaktadır. Bu teknik, birden fazla hava yolu kültüründen aynı anda birçok saat için istikrarlı ölçümler sağlar ve daha da önemlisi, agonistler ve İnhibitörlere yanıt olarak ASL pH 'daki dinamik değişiklikler izlenebilir. Bunu başarmak için, tam farklılaşmış primer insan hava yolu epitelyal hücrelerinin (hAECs) ASL, ince film koşullarını sağlamak için aşırı sıvının yeniden emilimini sağlayacak şekilde bir gece pH duyarlı bir boya ile lekelenmeli. Floresans agonistlerin varlığı veya yokluğunda izlendikten sonra, hacim ve boya konsantrasyonu için düzeltmek üzere situ içinde pH kalibrasyonu gerçekleştirilir. Tanımlanan yöntem, sonuçta Kişiselleştirilmiş tıp için bir ilaç keşif platformu olarak kullanılabilecek istikrarlı ve tekrarlanabilir ASL pH ölçümleri yapmak için gerekli kontrolleri sağlar, yanı sıra diğer epitelyal dokulara adapte ve deneysel enflamatuar ve/veya konak-patojen modelleri gibi koşullar.

Introduction

Hava yolu epiteli ince (~ 10 μm) sıvı tabakası ile kaplıdır hava yolu yüzey sıvı (ASL) olarak adlandırılır. Bu asl bileşimi ve derinliği (hidrasyon) sıkı bir şekilde düzenlenir ve mukociliary yürüyen merdiven1,2,3,4tarafından havayolu boşluğu verimliliğini kontrol eder. Son yıllarda, asl H+/HCO3- içeriğinin önemi, asl hidrasyon5, havayolu enflamasyonu6 ve enfeksiyon7' nin düzenlenmesi yeteneği nedeniyle farklı gruplar tarafından gösterilmiştir. 8 yanı sıra mukus viskozitesi8,9. Daha da önemlisi, bazı tartışmalar var olsa da, birçok çalışmada astım10,11,12, kod11gibi kronik hava yolu hastalıklarında havayolu pH disregülasyon bildirdi bronşektasis11, kronik rinosinüzit13,14 ve kistik fibrozis (CF)5,9,15,16,17, hangi ASL pH geri tedaviler kronik hava yolu hastalıkları birden fazla türde tedavi etmek için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. CF, Kafkas nüfusunun en sık görülen otozomal resesif genetik hastalığıdır ve CF transmembran iletkenlik regülatörü (CFTR) geni mutasyonlarından kaynaklanmaktadır. Bu gen, epitelia18arasında iyon ve sıvı taşımacılığı ve homeostazı açısından önemli bir rol oynayan bir anyon (HCO3- ve CL-) kanalını kodlar. CF Multi-organ hastalığı olmasına rağmen, akciğer patolojisi morbidite ve mortalitenin ana nedenidir19,20 ve CF birincil defekt dikkate alınarak CL- ve HCO3-, biri CF olmayan kişilere göre disdüzenli olacak CF ile insanlarda ekstrellüler sıvı pH hipotez olabilir. böylece, ASL pH ölçümü CF araştırma ve farklı grupların topikal bir alan olmuştur CF ASL pH ölçmek için teknikler geliştirdik Airways.

In vivo, havayolu pH farklı teknikler kullanılarak ölçülmüştür, mikro problar (fiber-optik, altın veya mobidium problar)5,21,22,23,24 pH ölçümleri için balgam sökhammalı malzeme veya ekshalalı nefes kondens (EBC)10,11,12,25,26,27. CF araştırma alanında pH, potansiyel klinik etkileri nedeniyle yaygın olarak incelenmektedir. Teorik olarak, hava yolları daha alkalin yapma bakteriyel öldürme artırabilir ve bir bütün olarak mukociliary boşluk ve havayolu homeostazı artırabilir. Ancak, In vivo/ex vivo çalışmalar pH değerleri geniş bir yelpazede rapor ve bugüne kadar, CF olmayan ve CF havayolları arasında pH farkı varlığı ile ilgili sonuçlar kesin değildir. 2000 ' lerin başlarında, farklı gruplar EBC pH bildirdi. Hastalıklı olmayan gruplarda, pH değerleri 4,6 ila 8,5 arasında değişmektedir ama ilginçtir ki, EBC pH, CF12,27olan insanlarda alevlenme sırasında daha fazla asidik bulundu. Daha Geçenlerde, CF insan ve hayvan modellerinde asl in vivo ölçümleri çakışan sonuçlar bildirdi16,17,21,22,23, 24 ve CF Airways olmayan CF Airways daha asidik ise hala belirsiz.

Düşük ASL pH in vivo ölçümü gibi hastalıklarda mukus fişleri hava yolları ve potansiyel varlığı astarlı sıvı çok az miktarda nedeniyle zor kanıtlanmıştır, birçok grup ASL pH ölçmek için in vitro deneyler döndü, özellikle üç farklı kullanarak Metodolojisi. İlk yaklaşım, ya doğrudan asl veya Perflorokarbon (PFC) denilen bir inert sıvı kullanarak, Kuru bir toz olarak eklenir dextran-bağlı hücre-ımperit pH duyarlı floresan boyalar kullanır5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32. ancak, bu teknik kültürlere eklenen boya tam miktarı üzerinde az kontrol sağlar ve boya toplamları ve örnekleri ve/veya deneyler arasında konsantrasyon büyük farklar ve hatta aynı örnek içinde bir risk sunar . Ayrıca genellikle uygulanabilirliği sınırlar ve birçok durumda, birden fazla numune ve kayıt koşullarında değişiklikler ayrıntılı izlenmesi önler bir Konfokal mikroskop ile yapılmıştır. Asl pH ölçmek için kullanılan ikinci yöntem pH duyarlı mikroelektrotlar5,15kullanımı. Bu nedenle ASL pH ölçümleri floresan boya konsantrasyonuna bağımlı değildir ve daha sağlam ve yeniden oluşturulabilir sonuçlar vermelidir. Ancak, bu yöntem ASL pH dinamik, gerçek zamanlı ölçümler için izin vermez, ne de farklı koşullarda birden fazla okuma yapmak kolay. Ayrıca, uzman ekipman (mikroelektrot imalat/elektrofizyolojik kayıt cihazları) ve sonraki pH ölçümü ve kalibrasyonu için numunelerin toplanması için eğitim gerektiren emek yoğun, kompleks, bir süreçtir. Dahası, bu iki teknikleri de tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için yeteneği bazı tutarsızlıkları göstermiştir: pH duyarlı floresan boya yöntemi kullanarak, Tang ve al. Non-CF asl için 7,35 bildirilen değerleri ve CF asl8 için 7,0 ise daha aynı gruptan son kağıt, ASL pH 6,9 ve 6,4 olmayan CF ve CF, sırasıyla17oldu. Benzer şekilde, microelektrot ölçümleri 200315 ' ten itibaren CF asl olmayan CF asl ve 6,1 6,4 değerleri verdi, aynı grup, 6,455' ten gelen bir çalışmada CF asl olmayan ve 2013 cf asl için 6,7 değerleri bildirdi. Son olarak, üçüncü yaklaşımda, araştırmacılar kültürlerin apikal (mukozal) yüzeyi üzerine zayıf tamponlu çözüm nispeten büyük bir hacim eklemek, böylece ince film koşulları yok ve ASL kompozisyon değiştirme, ve potansiyel olarak onun düzenleme. pH daha sonra pH duyarlı floresan boyalar kullanılarak ölçülür33, bir Ussing odasında bir pH-stat titrasyon yöntemi ile13,14, ya da bir pH kullanılarak ölçülen kültürler ve pH kaldırılması için seyreltilmiş asl gerektirir elektrot, analizör veya turnusol şeritler34. ASL pH doğru ölçümünde bir başka zorluk mümkün olduğunca hassas bir standart eğrisi kurulması. Nitekim, okumalar bir reçine ile elektrik potansiyelinin farkını ölçmek veya pH duyarlı floresan boyalar kullanarak bir elektrot ile gerçekleştirilir olsun, her iki bu yaklaşımlar numunelerin yerel mikroçevre etkilenecektir Ölçülen. Daha spesifik olarak, boyaların ayrışma Constant (KD) sıcaklığa, iyonik güce, viskoziteye ve proteinler ve potansiyel mukus gibi hücresel bileşenlerle boyaların potansiyel etkileşimlerine bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterebilir.

Bu teknik sorunların çoğunu üstesinden gelmek ve daha dinamik, daha basit ve daha yüksek bir verimlilik yöntemi geliştirmek için, birincil hAEC kültürlerinde ASL pH 'sını bir hücre geçirmez pH duyarlı kullanarak kaydeden bir in vitro tekniği kurduk. Standart bir ticari plaka-okuyucu floresan boya. Bu yöntem, ince film koşullarında tamamen farklılaşan 3D hücre kültürlerinin ASL pH 'Sında yeniden üretilebilen, dinamik, yarı otomatik, gerçek zamanlı ölçümler üretir. Bir çoklu-iyi plaka okuyucu kullanımı sayesinde, bu yarı otomatik tahlil kadar 24 koşulları üzerinde 12 h üzerinde pH aynı anda ölçümleri yakın yapabilir ve çeşitli agonistler veya inhibitörleri ekleme etkisini izleyebilirsiniz. Bu yazıda, metodolojisi ayrıntılı olarak tarif ederek, tekniği doğrulayan pozitif ve negatif kontrol koşullarında temsili sonuçları rapor ediyoruz.

Protocol

Birincil olmayan CF (n = 3 bağış, Yaş 34, 27 ve 23 yaşında) ve CF (n = 3 bağış, tüm F580del/F508del; yaş 40, 41, bilinmeyen) hAECs Dr Scott H. Randell (Marsico akciğer Enstitüsü, Chapel Hill, Amerika Birleşik Devletleri 'nde Kuzey Carolina Üniversitesi) bir tür hediye edildi ve obtai protokol #03 altında Ned-1396 Chapel Hill Biyomedikal kurumsal Inceleme kurulu Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmış. Hücreler, Fulcher ve Randell35,36tarafından açıklanan büyüme ve farklılaşma medyasını kullanarak daha önce yayımlanan yöntemlere göre büyüdü.

1. numune hazırlama

  1. Daha önce35,36açıklandığı gibi, en az 28 gün boyunca hava-sıvı arayüzünde 6,5 mm çapında yarı geçirgen destekler (malzeme tablosu) Primer haecs büyümek.
  2. Hazırlamak 50 HCO steril çözelti ml3- içeren Krebs tampon solüsyonu (HCO3- krb, konsantrasyonlarda mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCL (5), CAcl2 (1), MgCl2 (1), D-glikoz (5)) ve 0,2 μm şırınga filtresi kullanılarak filtre sterilize edilir.
  3. 1,135,36' da açıklandığı gibi, bazolateral orta olarak taze farklılaşma ortamına değiştirin.
    Not: Bu bazolateral glikoz konsantrasyonu asl pH33etkileyen gösterildi. Bu aşamada, bazolateral bölmesinin glikoz içeriği bilinen glikoz konsantrasyonlarının tamponlu çözümleri ile orta değiştirerek kontrol edilebilir.
  4. 37 °c, 5% Co2' de 20 dakika boyunca HCO3- krb ve inküye 150 μL ekleyerek hücrelerin apikal yüzeyini yıkayın.
  5. Steril cam Pasteur pipet ve toplama şişesinde bir vakum oluşturan aspirasyon pompasına bağlı steril bir P200 pipet ucu kullanarak, epitelyonu bozmadan apikal yıkama alanını dikkatle çıkarın. Bu aşamada, hava-sıvı arayüzünü geri yüklemek için mümkün olduğunca apikal yüzeyinde kalan az sıvı olmalıdır.
  6. 37 °C,% 5 CO2' de 30 dakika daha fazla hücre için inkübe.

2. arka plan ölçümü

  1. Plaka okuyucusunu ve bilgisayarı açın.
  2. Panoyu açın.
  3. Spark 10müzerine tıklayın, sıcaklık kontrolünü açın ve 37 °c ' ye ayarlayın. Gaz kontrolünü açın ve CO2 ' ye% 5 ' i ayarlayın.
  4. Sıcaklık ve CO2 hedeflerine ulaşıncaya kadar bekleyin.
  5. Plaka okuyucu çekmecesini açın, her tarafta 6 mL dH2O ile dolu nem kaseti takın. Plakanın kapağının ve alt parçasının temiz olduğundan emin olun – değilse, bir doku parçası üzerinde etanol% 70 ile temizleyin-ve plakayı nem kasetine yerleştirin.
    Not: deney boyunca, doku kültürü plaka kapağı plaka üzerinde tutulur ve sadece ilaçlar eklerken veya steril bir ortamda kültürler tutmak için bir doku kültürü laminar akış kaput gerçekleştirilen bazolateral orta, değişen kaldırılır.
  6. Spark yöntemi düzenleyicisini açın ve yazılımla ilgili parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
    1. Uygun plaka şablonunu seçin (6,5 mm çapı yarı geçirgen destekler için, 24 kuyu plakasını seçin) ve bu deney sırasında izlenecek kuyular.
    2. Bir sıcaklık ve CO2 kontrol paneli ekleyin ve sırasıyla 37 °c ve% 5 ' e ayarlayın. Sıcaklık/gaz kutularını bekleyin seçeneğini işaretleyin.
    3. Kinetik döngü paneli ekleyin ve döngü türü olarak süre seçin ve 5-10 dk olarak ayarlayın. sürekli okumayı etkinleştirmek için Aralık türü olarak tanımlanmamış 'Yı seçin.
      Not: sürekli okuma zamanlaması kuyuların/koşulların sayısına bağlıdır. 5 dk 6-12 kuyuları için yeterince uzun ise 24 koşulları içeren tam bir plaka sürekli ölçümler 10 dakika gerektirecektir.
    4. Kinetik döngü içinde, sırasıyla pH duyarlı ve pH duyarsız floresan boyalar için ayarlanacak sürükle ve bırak fonksiyonunu kullanarak, iki "floresan yoğunluğu" panelleri ekleyin. PH duyarlı boya ve 495 ve 520 nm için sırasıyla 560 ve 590 nm 'ye uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın.
    5. Her fluorophore için 33200 için yanıp sönen sayısını 30 ve z-konumuna ayarlayın.
      Not: z-konumu ve kazanç ayarları plaka okuyucunun özelliklerine bağlıdır. Bir agonistin eklenmesi, algılama aralığının dışında değerler oluşturamaz, böylece örnekleri arasındaki farklar, ancak yeterince düşük alacak kadar yüksek saymak verecek bir değere el ile kazanç ayarlayın.
    6. 4750 μm sınırına sahip 3 × 3 boyutunda bir daire türü olarak tanımlanan kullanıcıya iyi başına birden fazla okuma ayarlayın.
  7. Bir arka plan ölçümü yapmak için Başlat düğmesine tıklayın ve nem kasetinin kapağını yerine koyarak onaylamak için Tamam 'ı tıklatın.
  8. Ölçümünün sonunda, plaka okuyucu çekmecesini açın, plakayı çıkarın ve floresan boya karışımı çözeltisi hazırlarken inküvatörün içine hücre Pplace geri.
  9. 2 μL 1 mg/ml dextran-0,2 bağlı pH-sensitive (phsens) floresan boya ekleyerek floresan boya karışımı çözüm hazırlamak 10 mg/ml dextran-bağlantılı pH duyarlı (phins) floresan boya ve 0,8 μL steril HCO3- krb için son bir durum başına 3 μL hacmi.
    Not: 1 ve 10 numuneler arasında ise + 1 veya 11 ile 24 örnekleri arasında ise n Wells + 2 varsa, boya karışımı çözeltisi toplam hacmi n kuyuları için hazırlıklı olmalıdır. Dextran-bağlı boyalar, süzülmüş steril HCO3- krb solüsyonu ile yeniden oluşturulmuştur ve-20 °c ' de saklanır. Herhangi bir kimyasal bir 16-24 h inkübasyon süresi için bu aşamada eklenebilir37 apikal yüzeyi üzerinde. Kimyasallar 0.1 x olarak hazırlanmalı, son hacim olarak, kültür tarafından aşırı sıvının emiliminin ardından, 6,5 mm çapında yarı geçirgen destek için 0,3 μL civarında olacaktır.
  10. Hücrelerin apikal yüzeyine dikkatlice 3 μL boya karışımı (bkz. 2,8) ekleyin ve bir gecede 37 °c,% 5 Co2' de inküyeyin.

3. kinetik ölçüm

  1. Plaka okuyucusu hazırlamak için 2,4 2,1 adımları yineleyin.
  2. Açık simgesine tıklayın ve arka plan ölçümleri için kullanılan yöntem dosyasını seçin
  3. Kinetik döngü panelinde döngü tipini süre olarak saklayın ve 08 saate ayarlayın. Aralık türünü sabit olarak değiştirin ve 5 dakika olarak ayarlayın. Floresans yoğunluğu panellerini arka plan ölçümlerinde olduğu gibi saklayın
    Not: arka plan ölçümleri için Aralık türü sürekli okumaya izin vermek için "Tanımlanmamış" olarak ayarlanır. Kinetik ve kalibrasyon denemeleri için, Aralık türü 5 dakika aralıkla "sabit" olarak ayarlanmıştır. Bu, deney tasarımına ve koşul sayısına göre ayarlanabilir.
  4. Plaka okuyucu çekmecesini açın; her tarafında 6 mL dH2O ile dolu nem kaseti takın. Plakanın kapağının ve alt parçasının temiz olduğundan emin olun – değilse,% 70 etanol ile temiz bir doku parçası üzerinde-ve plakayı nem kaseti içinde, kapağı ile yerleştirin.
  5. Başlat'a tıklayarak floresan ölçümlerini başlatın. Nem kasetinin kapağını yerine yerleştirdikten sonra Tamam 'ı tıklatın.
  6. Sonra n döngüleri, genellikle arasında 12 ve 24, 1 ile 2 saat eşdeğerdir, deneme kesmek için Duraklat ' ı tıklatın. Plakayı çıkarın ve farklı örneklere basolaterally herhangi bir ilaç/agonistleri uygulayın.
    Not: hücreler plaka okuyucudan alındığında, CO2 kaçar ve bu pH duyarlı boya floresans bir damla tarafından gösterildiği gibi asl pH artışa neden olacaktır. Bu CO2kaynaklı pH değişimi, kültürleri plaka okuyucuya yerleştirdikten sonra 10-15 dk içinde tersine çevirir.
  7. Plakayı geri tepsi üzerindeki nem kasetine koyun, nem kaseti kapağını yeniden konumlandırın ve ASL pH 'yi daha fazla kaydetmek ve ilaçların/agonistlerin ASL pH üzerindeki etkisini izlemek için devam düğmesini tıklayın.

4. In situ pH kalibrasyonu

  1. Plaka okuyucudan plaka alın.
  2. Bazolateral orta/çözelti aspirate.
  3. Sırasıyla bazolateral bölme ve apikal yüzeye 750 μL ve 1 μL Yüksek tamponlu standart eğri çözeltileri ekleyin.
    Not: Yüksek tamponlu standart eğrisi çözümleri (mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NAHEPES veya mes veya Tris (100 mm) içerir. PH 7-7.5 ve pH 8 çözeltisi için Tris çözeltileri için 7 ' den düşük pH, NaHEPES ile çözeltileri arabellek için MES kullanın. HCl kullanarak pH 'ya istenilen değere kelepçe atın.
  4. CO2 ' i plaka okuyucuda değiştirin veya% 0,1 olarak ayarlayın ve plakayı nem kasetine geri yerleştirin.
  5. Plaka okuyucusu daha önce açıklandığı gibi aynı parametrelerle ayarlayın ama hiçbir CO2 gibi adım 3,2.
  6. Flüoresan okumaları, 1-1,5 saat için her 5 dakikada bir başlayın.

5. boya konsantrasyonu ve süspansiyon hacminin kalibrasyon verilerine etkisinin değerlendirilmesi

  1. Floresans 3 farklı hacimde en az 4 farklı pH değerine kadar kaydetmek için yeterli pH duyarlı ve duyarsız boya karışımı hazırlayın.
    Not: burada, Mix 1, 26 μL pH duyarlı (1 mg/mL) ve 2,6 μL pH duyarlı (10 mg/mL) ve Mix 2 ile 13 μL pH duyarlı (1 mg/mL) ve 1,3 μL pH duyarlı (10 mg/mL) ile hazırlanmıştır.
  2. 2,2 μL veya 1,1 μL karışımı 1 veya Mix 2 ' ye sırasıyla, 96 kuyu plakasının 12 kuyuya dağıtın ve 50, 100 veya 200 μL son hacimleri elde etmek için yeterli kalibrasyon çözümleri ekleyin ve iyi karıştırın.
    Not: Bu ayarda, floresan sayar 5 μg/mL (200 μL), 10 μg/mL (100 veya 200 μL), 20 μg/ml (50 veya 100 μL) veya 40 μg/ml (50 μL) boyaların konsantrasyonları için kaydedilecektir.
  3. Plaka okuyucuyu açın, sıcaklığı 37 °C ' ye ayarlayın ve plakayı plaka okuyucuya takın. CO2 kumandasını açmayın.
    Not: Bu kısa bir deney olduğu ve sadece sıcaklık dengeleme için yeterli zaman gerektirdiğinden, nem kaseti gerekli değildir.
  4. Z-konumunu ayarlayın ve 96 iyi plaka için kazanç ve yarı geçirgen desteklerde yapılan deney için aynı parametreleri kullanın.

6. veri analizi

  1. Tüm verileri elektronik tablolara kaydedin ve yeni bir dosya oluşturun.
  2. Arka plan dosyasında, her iki dalga boyu için her örnek/koşul için tüm ortalama verileri seçin, yeni dosyaya kopyalayın ve yapıştırın. Her iyi ve her dalga boyu için Ortalama arka plan hesaplayın.
  3. Bunu kalibrasyon ve kinetik verilerle tekrarlayın ve her dalga boyu için her veri noktasından arka planı çıkarın.
  4. Her zaman noktası ve her örnek için, pH duyarlı ve pH duyarlı floresans arasındaki oranı hesaplayın
  5. Tüm numuneler bireysel bir donörden elde edildiyseniz, kalibrasyon eğrisinin her zaman noktasında oranlarının ortalamasını hesaplayın
    Not: bağış veya bazolateral çözümler olarak birçok kalibrasyon eğrileri oluşturmak için önemlidir. Nitekim, bu parametreler arka plan okumaları veya sıvı emilimi oranını etkileyebilir, hangi sırayla boya konsantrasyonu ve bu nedenle hesaplanan pH etkileyecektir.
  6. Her zaman noktası için, x ekseni üzerinde bilinen pH değerlerini ve y eksenindeki oranları çizerek oranlarda standart bir eğri oluşturun.
  7. Oranlarının kararlı olduğu zaman noktasını belirleyin, doğrusal regresyon çizgisini sığdırın ve bu satırın denklemini alın.
  8. Kinetik verilerden, her zaman noktası için pH hesaplamak ve y ekseni ve zaman x ekseni üzerinde pH Arsa
    Not: dinlenme/bazal pH, herhangi bir agonist veya başka bir müdahale eklenmeden önce pH istikrarlı ölçümü üzerinden veri noktaları ortalaması ile hesaplanabilir. Bir agonist etkisi önce ve sonra pH farkı hesaplanmasıyla karakterize edilebilir (belirli bir süre) tedavi veya doğrudan müdahale sonra veri noktalarına doğrusal olmayan bir eğri sığdırma. Bu t1/2 ve maksimal değeri hakkında ek bilgi verecektir. Son olarak, asitleştirme veya alkali oranları da müdahalenin ardından ilk noktalara takılan düz bir çizgi eğimi elde edilebilir.

Representative Results

Yukarıda açıklanan teknik, 24 ayrı primer hAECs kültüründe ASL pH 'nin dinamik ölçümünü sağlar. Şekil 1 , ana adımların ve ekipman ayarlarının bir şematiği gösterir. Gece yüklü hücreler, bir CO2 ve sıcaklık kontrollü plaka okuyucuya yerleştirilir ve bu da dextran bağlantılı pH duyarlı ve pH duyarsız boyaların her 5 dakikada bir kaydedilmesine neden olur.

Figure 1
Şekil 1: ASL pH ölçüm yönteminin şeması. Kültürlerin yıkandıktan ve arka planda okunduktan sonra, primer insan hava yolu epitelyal hücreleri (haecs) asl, 37 °c, 5% Co2' de bir gecede dekstran birleştiğinde pH duyarlı ve pH duyarsız boya karışımı ile yüklenir. Ertesi gün, plaka bir sıcaklığa aktarılır ve CO2kontrollü plaka okuyucu ve floresan her iki boya zaman içinde kaydedilir. Deneyden sonra, bir in situ kalibrasyonu gerçekleştirilir ve veri analiz edilir ve zamanla ASL pH olarak sunulmuştur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

İlk olarak, farklı hacimlerin ve boya konsantrasyonlarının floresan sayılarında ve bu nedenle 560/495 oranındaki etkisini araştırdık. Aslında, pH duyarlı boya pH duyarsız ekleme amacı, ASL yükleme değişkenlik için düzeltmek için. Ancak, bu varsayımı test etmek ve biz tüm deneyler ve hücre türleri için bir 96 iyi plaka hücrelerde yokluğunda gerçekleştirilen standart bir kalibrasyon eğrisi kullanabiliyorsanız değerlendirmek önemliydi. 5, 10, 20 veya 6,5 μg/mL boya içeren 50, 100 veya 200 μL kalibrasyon çözümlerinin (pH 5,5, 40, 7 veya 8 ' de) 1 saat üzerinde floresan sayımlarını takip ettik. Sonuçlar Şekil 2a-C' d e sunulmuştur ve aynı pH ve aynı boya konsantrasyonu için, bildirilen phsens/phins emisyon oranı (y ekseni üzerinde 560/495) hacmine bağlı olarak farklılık gösterir (Şekil 2a). Ayrıca aynı pH ve aynı hacimde farklı boya konsantrasyonları farklı oran değerleri sağlar (Şekil 2B). Bu nedenle, hacim veya boya konsantrasyonunda değişiklikler emisyon oranından hesaplanan pH mutlak değerini etkileyecektir. Şekil 2C sıcaklık dengelenmesi için gereken süreyi yaklaşık 15-20 dk olduğunu gösterir. Boya konsantrasyonu ve hacminin emisyon oranlarında etkisini onaylamak için, birincil olmayan CF ve CF hAECs in situ ile ASL 'de yüklenmiş olan boyaların floresans kaydetmiştir. Daha sonra, kalibrasyonu gerçekleştirdik ve sonuçları (1) tüm örneklerden bir küresel standart eğrisi üreten veya (2) her hücre tipi için iki bağımsız standart eğri oluşturarak (CF ve CF olmayan) analiz ettik. Her iki hücre türünden de ASL pH zaman (Şekil 3A, B) ve ortalamalı (Şekil 3c) karşı çizilir. Tek bir küresel standart Eğriden elde edilen asl pH değerleri, CF ve CF olmayan kültürler arasında önemli bir fark göstermiştir (Şekil 3A, C) ancak pH hesaplanırken, CF ve CF olmayan haecs arasında asl pH önemli ölçüde farklı değildi bağımsız standart eğrileri (Şekil 3B, C). Bu sonuçlar, her deneme için ve deney içinde, her bağış örneği için bağımsız kalibrasyon eğrileri oluşturmanın önemini gösterirken, kalibrasyon eğrileri birlikte ortalamalı olduktan sonra, CF kültürlerinde daha yüksek pHsens/pHins oranı değerleri bulundu , daha asidik pH (Şekil 3c) gösterir.

Figure 2
Şekil 2: pH kalibrasyonunun in vitro optimizasyonu. Bilinen pH çözümlerinin farklı hacimleri ve farklı boya konsantrasyonları içeren bir 96 iyi plaka üzerine yüklendi ve floresans 1 h üzerinde kaydedildi. hacminin (a) ve boya konsantrasyonunun (B) Floresan oranlarında etkisi. Zaman noktası 24 dk. (C), pH 'ye karşı oranlarda çizilmiş ve her çözüm için her bir çözelti için hesaplanan ve zaman (min) bir fonksiyon olarak çizilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Primer hAECs in situ üzerinde pH kalibrasyonunun analizinin optimizasyonu. (A) tek bir standart Eğriden elde EDILEN ve CF olmayan ve CF kültürlerinden veri ortalaması alan asl pH temsilcisi izleri. (B) CF veya CF olmayan kültürlerde gerçekleştirilen bağımsız standart Eğriden elde edilen asl pH temsilcisi izleri. Her veri kümesi kendi kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır. (C) kalibrasyonun nasıl gerçekleştirildiği bir fonksiyon olarak, CF ve CF olmayan kültürler arasında asl pH farklılıklarının değerlendirilmesi. Veriler n = 3 deneylerden ortalama ± SEM, 2 yönlü ANOVA, Sidak 'ın çoklu karşılaştırmalar testi) temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Daha sonra bizim tekniği doğrulamak için, daha sonra teknik bir ' beklenen ' ASL pH değişikliği tespit yeteneğine sahip olduğunu göstermek için olumlu bir kontrol gereklidir. CF hücrelerinde daha asidik asl varlığı hala tartışmalı olduğu gibi, biz, bir olumlu kontrol durumu olarak Camp agonist Forskolin kullanılan CFTR aracılığıyla HCO3- salgılanmasını uyarmak için. Beklenen sonuçlar, mutasyonların şiddetine bağlı olarak CF hücrelerinde büyük ölçüde azalacak veya kaldırılabilecek CF olmayan hücrelerde ASL 'nin Forskolin kaynaklı bir alkali alkalinasyonunu gösterecekti. Şekil 4A , zaman içinde CF olmayan ve CF HÜCRELERINDE asl pH 'nin temsili izlerini gösterir ve Şekil 4b her iki hücre tipindeki Forskolin ile tedavi öncesi ve sonrası asl pH ortalama verilerini gösterir. Bu sonuçlardan farklı bilgiler elde edebilirsiniz. İlk olarak, Şekil 3B, C'de görüldüğü gibi, dinlenme asl pH 'sı CF ve CF olmayan epitelia arasında farklı değildi. İkinci olarak, ilk 3-4 zaman-puanlar Forskolin ile hücreleri tedavi etmek için deneme duraklattıktan sonra, pH içinde kurtarılan büyük bir artış gösterdi ~ 15 dakika. Bu plaka okuyucu (% 5) arasında CO2 konsantrasyon düşüş nedeniyle oldu ve doku kültürü güvenlik kabini (~ 0%). Henderson hasselbalch denklemine göre,% 5 Co2 ortamında 7 ' lik pH, HCO3- of ~ 9,3 mm konsantrasyonuna eşittir. Hücreler plaka okuyucudan çıkarıldıktan sonra, CO2 konsantrasyonu% 0 ' a düşmesine teorik olarak ≫ 8 pH artışa yol açacaktır. Şekil 4A bu asl pH artış gösterir ~ 7,8 hangi süre plaka okuyucu (yani, bir 5% Co2 ortamda) plaka yeniden konumlandırmak zaman atlama ile açıklanabilir. Son olarak, tahmin edildiği gibi, bazolateral 10 μM Forskolin eklenmesi (FSK) sadece CF olmayan kültürlerde asl pH değerini önemli ölçüde artırmıştır. CF ve CF olmayan epitelia arasında sabit devlet ASL pH 'de bir fark var farklı gruplar tarafından gösterilen olduğu gibi, biz de bizim deneyler ve CFTR rolü bir pH farkı belirgin yokluğunda araştırmak istedik. Bunu yapmak için özel CFTR inhibitörü, CFTRinh172 (172) ile CF olmayan kültürlere önceden inkübe edilmiştir. 2,8 protokol bölümünde belirtildiği gibi, boya karışımı yukarıda belirtildiği gibi hazırlanır ve inhibitör 0.1 X = 2 μM konsantrasyonuna eklenmiştir. Literatüre göre, CF olmayan hücrelerin ASL yüksekliği yaklaşık 10 μm ' dir. 6,5 mm çapında yarı geçirgen bir destek olarak, ASL teorik hacmi bu nedenle π × 3,252 = 0,3 μL. 2 μM ' de 3 μL boya + 172 ekleyerek, inhibitör konsantrasyonu, aşırı sıvının emiliminin ardından, teorik olarak 20 μM (1x, istenilen konsantrasyon) olacaktır. Figure 4c 'de temsili Izler ve Şekil 4d 'de ortalama Özet, 172 dinlenme asl pH 'sını AZALTMADı, ancak asl pH 'sında Forskolin kaynaklı artışa engel olmadı, böylece CF VERSUS CF 'den elde edilen sonuçlarımızı teyit etti kültürler ve daha da teknik doğrulama.

Figure 4
Şekil 4: Forskolin tarafından CFTR aktivasyonuna yanıt olarak dinamik ASL pH ölçümü. (A) CF ve CF haecs 'de zaman içinde asl pH kinetiği üzerinde Forskolin (FSK, 10 μM) ' nın etkisi ile ilgili temsili izler. Veri n = 3 deneylerden ortalama ± SEM temsil eder. (B) FSK 'in CF ve CF olmayan KÜLTÜRLERDE asl pH üzerindeki etkisinin Özeti. Veri n = 69 CF olmayan kültürler ve 35 CF kültürlerinden (2 yönlü ANOVA, Sidak 'ın çoklu karşılaştırmalar testi) ortalama ± SD 'yi temsil eder. (C) CFTRInh172 (172 μM) ' nin, CF haecs 'de asl pH 'da FSK kaynaklı artışa etkisi ile ilgili temsilci izleri. Veriler n = 5 deneylerinden ortalama ± SEM temsil eder. (D) 172 'nin CF olmayan KÜLTÜRLERDE asl 'Nin FSK kaynaklı alkali alkalinizasyonu üzerine etkisinin Özeti. Veriler n = 5 deneylerinden (2 yönlü ANOVA, Sidak 'ın çoklu karşılaştırma testi) ortalama ± SEM 'i temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Son olarak, protokol bölümünde belirtildiği gibi 6,8, asitleştirme/alkali oranları müdahalenin ardından ilk zaman noktalarına doğrusal bir regresyon sığdırarak hesaplanabilir. Şekil 5A , bazolateral HCO3 içeren çözeltinin (HCO3- krb) kaldırılması ve bir HEPES tamponlu çözeltisi ile değiştirilmesi, Co2yokluğunda, asl işaretli asitleştirme indüklenen gösterir. Bu HCO eksikliği ile tutarlı3- inhibe transepitelyal HCO3- salgılanması, bu hava yolu hücreleri tarafından kurucu proton salgılanması sürekli asl pH azaltmak için sağlar15, 17. İlginçtir ki, CF olmayan hücrelerin asidifasyon ilk oranı CF kültürlerinden önemli ölçüde yavaştı (Şekil 5B).

Figure 5
Şekil 5: HCO3' e yanıt olarak asl pH 'da dinamik değişiklikler- kaldırma. (A) HCO3' ün etkisini gösteren temsili izler- CF ve CF haecs 'de zaman içinde asl pH kinetiği üzerinde kaldırma. HCO3- kaldırma işleminden sonra 7 zaman noktalarıyla donatılmış düz bir çizginin eğimi ile Asidifikasyon ilk oranları elde edildi. Veriler, sırasıyla CF olmayan ve CF kültürlerinde n = 6 ve 7 deneylerinden ± SEM anlamına gelir. (B) HCO3' ün ardından Asidifikasyon ilk oranlarının özeti- kaldırma. Veriler sırasıyla CF olmayan ve CF kültürlerinde (Mann-Whitney testi) n = 6 ve 7 deneylerinden ± SEM anlamına gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada, primer insan hava yolu epitelyal hücrelerinde ASL pH 'nin dinamik ölçümü için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Kritik adımlar, hücrelerin apikal yüzeyinde mukus yıkama, ölçüm ve deney gibi aynı parametreleri kullanarak arka plan çıkarma, z-pozisyon optimize ve kazanç ve bir in situ pH kalibrasyonu gerçekleştirme içerir.

Hücrelerin yıkaması için ilk adım, kalın bir mukus tabakası (i) boyaların perikiliary katmanına (PCL) ulaşmasını önler ve (ii) agonistler/İnhibitörlere yanıt olarak floresans değişikliklerinin algılanmasını önler. Bizim Yöntem nasıl birincil haecs HCO3- ve H+ taşıyıcılar aktivitesini agonistleri yanıt olarak modüle incelemek için geliştirilmiştir. PCL pH değişikliklerinin mukus pH 'daki değişikliklerle nasıl ilgili olduğunu araştırmak ilginç olacak olsa da, bu protokolün daha da geliştirilmesi, farklı molekül ağırlığı kullanımı da dahil olmak üzere-dextrans, 2 kat ve z-taramaları ayırt etmek için Tüm ASL.

Arka plan ölçümü, bu protokolün bir başka önemli adımdır. Tam farklılaşmış primer havayolu epitelia 'nın apikal yüzeyi, ışık yolunu ve bu nedenle arka planı etkileyebilecek nadiren tamamen düz. Arka planda okumaların, deney sırasında kuyuların aynı yerel noktalarında gerçekleştirilmesini sağlamak, kayıtların yeniden üretilebilirliği ve stabilitesi açısından önemlidir.

Z-pozisyonu ve kazancı optimize etmek, kullanılacak her farklı floresan boya konsantrasyonu için ayarlanması gereken gerekli adımlara sahiptir. Bu, yüksek deney arası değişkenliği önleyecek. Bir kez kurmak, bizim tahlil istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Bunun nedenlerinden biri de, epitel tarafından kolayca reabsorbe edilen, homojen olarak etiketli bir asl bırakarak sıvının küçük bir hacminde boyalar apikal yüzeyine eklenir olmasıdır. Başka bir yöntem ASL leke, bu eşit başarılı olabilir, Kuru toz veya PFC bir "süspansiyon" kullanılmış. bu zaman tasarrufu olabilir rağmen (deneyler genellikle 2 h içinde gerçekleştirilir gibi), Kuru boyalar tamamen ASL içinde çözünmesi ve böylece olabilir olası Form kümeleri. Böylece epitelyal hücrelerin yüzeyi üzerinde pH duyarlı boya farklı konsantrasyonlarda bulunacaktır.

İn situ pH kalibrasyonu doğru, yeniden üretilebilen sonuçlar elde etmek için önemli bir adımdır. Sonuçlar bölümünde gösterildiği ve açıklandığı gibi, ASL hacimlerindeki farklılıklar floresan sayılarını ve bu nedenle enterpolasyonlu pH değerlerini etkileyecektir (Şekil 2 ve Şekil 3). Farklı gruplar daha önce asl pH ölçümlerini yayınlarken, aynı grup8,17tarafından yayınlanan farklı çalışmalar arasında bile geniş bir değer yelpazesi elde edilmiştir. Biz situ kalibrasyonları gerçekleştirerek, sonuçlar daha yeniden oluşturulabilir olacağını düşünüyoruz. Standart eğrisi28,29,30oluşturmak için yüksek K+/nigericin (veya birden fazla ionophores) yöntemi kullanan diğer pH kalibrasyon teknikleri, karşılaştırıldığında, tahlil burada sunulan avantajı vardır , her adım bir emniyet kabininde gerçekleştirildiği sürece, ASL pH için kullanılan hücreler yıkanır, saklanabilir ve diğer deneyler için yeniden kullanılabilir, bu işlem yapılan tedaviler epitelyal hücreleri geri dönülemez şekilde etkilemez.

Bu testin geliştirilmesi ve optimizasyonu, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamıştır ve bu yöntemin ASL pH ölçümü ile diğer gruplara yardımcı olacağına inanıyoruz. Ancak, bu teknik Ayrıca bazı sınırlamalar nedeniyle ayarlanmış ve kullanılan hücrelerin türü vardır. Burada sunulan daha uzun bir süre boyunca ASL pH izleme (> 8-10 h) uzun vadeli yüksek nem ortamı ekipman zarar verebilir ve aslında çoğu plaka okuyucuların sadece bir üzerinden kinetik okumalar kaydetmek için seçenek sunmak zor olabilir belirli bir süre (genellikle 24 saat). Tamamen farklılaşma birincil haecs kullanımı farklı aşamaların HCO3- ve H+ taşıyıcılar ifadesini etkileyeceği şekilde çok önemlidir. Ancak, ince film koşullarında yetiştirilen hücrelerde ASL hacmini tam olarak kontrol etmek için neredeyse hiçbir olasılık yoktur. Protokol ve sonuç bölümlerinde belirtildiği gibi, hacimli değişiklikler floresan oranını etkileyecektir ve ne yazık ki tek bir bireyin yetiştirilen hücrelerde, farklı yarı geçirgen desteklerde aynı günde tohumlanabilir, ASL hacimleri olduğunu varsaymak gerekir aynı olacak. Bu sınırdan kaynaklanan, sıvı salgılanmasını veya emilimini etkileyecek herhangi bir agonist veya inhibitör, ASL hacmini ve muhtemelen floresan oranlarını etkileyecektir. Ancak, bizim tahlil, kalibrasyon eğrisi deney sonunda gerçekleştirilir, bu yüzden bu hacimde bu değişikliklerin kinetik deney sırasında aynı şekilde kalibrasyon oranlarını etkileyeceğini tahmin edebilirsiniz. Bu nedenle biz bu tahlil geliştirme ilgi olacaktır grupları tavsiye, en az 2-3 kullanmak için her koşul için standart bir eğrisi kurulması için izin verecek şekilde test başına çoğaltır.

Burada ince film koşullarında mukozal yüzey pH gerçek zamanlı ölçüm sağlayan basit, yarı otomatik, tahlil sunuyoruz. Birçok kültürde dinamik pH yanıtlarını, inter-donör karşılaştırmalar sağlayan yakın eşzamanlı bir şekilde araştırma kapasitesine sahiptir. Bir 96 iyi plaka biçimine polarize sistemi (HTS 96 iyi plakalar) kullanarak bu yöntemi upscaling38 bir ilaç keşif tahlil olarak daha da yüksek verim sağlayacaktır. Dahası, bu tekniğin, agonistlerin asl pH 'da akut etkisini incelemek için nasıl kullanılabilirler ve biz zaten bu yöntemin CF haecs asl39üzerinde bir apikal proton pompa inhibitörü üzerinde uzun vadeli etkisini incelemek için kullanılabilirler olduğunu gösterdik. PH enfeksiyon, inflamasyon, mukus viskozitesi ve iyon taşınması düzenleyen gösterildiği gibi, pH artırabilir moleküler hedefleri belirlemek kronik akciğer hastalıklarının araştırma alanlarında değerli olacak ve bu tekniği potansiyel kolaylaştıracak Kişisel tıp yaklaşımlar ilaç taraması gelişimi. Son olarak, asit-baz homeostazı disdüzenleme diğer hastalıklarda önemli bir rol oynar beri, bu protokol, optimizasyon adımları ile, farklı ekipman (plaka okuyucuları) ve diğer epitelyal hücreler gibi hücre türleri, adapte edilebilir. Ekstrsellüler asitlik kanseri40,41,42 bir özelliğidir ve bu tahlil nasıl katı tümörlerin düşük pHe üretmek veya düşük verim ilaç tarama tahlil olarak kullanılabilir belirlemek yardımcı olabilir pH homeostasis restorasyon. Benzer şekilde, kronik hava yolu hastalıkları için, aynı zamanda kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımı geliştirilmesi için bir platform sağlayabilir.

Disclosures

MB: Bu işle ilgili değil: Pfizer ve Roche Diagnostics 'ten araştırmacı liderliğindeki araştırma hibe; Novartis, Roche Diagnostics ve TEVA 'dan Newcastle Üniversitesi 'ne ödenen konuşmacı ücretleri. Boehringer ınelheim ve Vertex Eczacılık eğitim toplantıları için seyahat giderleri.

Acknowledgments

Bu çalışmanın iki CF Trust Stratejik Araştırma Merkezi hibe (SRC003 ve SRC013) ve bir Tıp Araştırma Konseyi (MRC) konsept hibe güven (MC_PC_15030) tarafından desteklenmektedir. JG Tıbbi Araştırma Vakfı (MRF-091-0001-RG-GARNE) bir hibe tarafından destekleniyordu. MB Tıbbi Araştırma Konseyi klinisyen bilim adamı Bursu (MR/M008797/1) tarafından destekleniyordu. IH, Wellcome Trust Klinik eğitim bursu (203520/Z/16/Z) tarafından destekleniyordu. Araştırma, Newcastle Hastanesi NHS Vakfı güven ve Newcastle Üniversitesi merkezli sağlık araştırmaları Newcastle Biyomedikal Araştırma Merkezi Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu. Gösterilen görüşler, yazarın (s) ve NHS, NıR veya Sağlık Bakanlığı 'nın olanlar değildir. Dr. Randell 'in primer hücreleri kistik fibrozis Vakfı Hibe (BOUCHE15R0) ve NıH hibe (P30DK065988) tarafından destekleniyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, Suppl 2. 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. ECFS Patient Registry Annual Data Report. , Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016).
  20. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017. , Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017).
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

Biyokimya Sayı 148 havayolu yüzey sıvı asit-baz dengesi pH plaka okuyucu hava-sıvı arayüzü havayolu epiteli kistik fibrozis
Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, … More

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter