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Developmental Biology

भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO के साथ मानव Pluripotent स्टेम सेल के क्षणिक उपचार

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59833
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

Summary

मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSCs) से विभेदित सेल प्रकार उत्पन्न महान चिकित्सीय वादा रखती है, लेकिन चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. PSCs अक्सर संकेतों का एक उचित सेट के साथ प्रेरित भी जब अंतर करने के लिए एक अंतर्निहित असमर्थता प्रदर्शन. यहाँ वर्णित पीएससी लाइनों की एक किस्म भर में multilineage भेदभाव बढ़ाने के लिए एक सरल उपकरण है.

Abstract

pluripotent स्टेम सेल (PSCs) के बढ़ते उपयोग के बावजूद, विभिन्न वंशों में कुशलतापूर्वक भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (ESCs और iPSCs) अलग करने में चुनौतियों रहते हैं. कई भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, अभी तक सेल लाइनों में परिवर्तनशीलता और भेदभाव की कम दरों को सफलतापूर्वक इन प्रोटोकॉल को लागू करने में चुनौतियों प्रदान करते हैं. यहाँ वर्णित PSCs के भेदभाव क्षमता को बढ़ाने के लिए एक आसान और सस्ती साधन है. यह पहले से पता चला है कि dimethyl suloxide (DMSO) की एक कम एकाग्रता के साथ स्टेम कोशिकाओं के उपचार काफी निर्देशित भेदभाव के बाद विभिन्न सेल प्रकार के लिए अंतर करने के लिए पीएससी की एक किस्म की प्रवृत्ति बढ़ जाती है। इस तकनीक को अब विभिन्न प्रजातियों में प्रभावी होना दिखाया गया है (जैसे, माउस, प्राइमेट, और मानव) कई वंशों में, न्यूरॉन्स और cortical गोलाभ से लेकर मांसपेशियों की कोशिकाओं और hepatocytes चिकनी करने के लिए. DMSO pretreatment सेल चक्र को विनियमित करने और स्टेम कोशिकाओं प्राइमिंग भेदभाव संकेतों के लिए और अधिक उत्तरदायी होने के द्वारा पीएससी भेदभाव में सुधार. लेकिन यहाँ एक reproduible और व्यापक रूप से लागू करने के लिए और अधिक कुशलता से पसंद के किसी भी वंश के लिए PSCs अंतर का मतलब है के रूप में इस सरल उपकरण का उपयोग करने के लिए विस्तृत पद्धति है.

Introduction

pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग biomedical अनुसंधान में कई प्रगति के लिए नेतृत्व किया गया है, पुनर्योजी चिकित्सा और स्टेम सेल आधारित उपचार के क्षेत्रों सहित, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग. यह भी अधिक अनुवाद अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के समग्र संभावना के लिए नेतृत्व किया है. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी के आगमन पर 20 साल पहले शोधकर्ताओं को दैहिक ऊतकों से pluripotent स्टेम कोशिकाओं को विकसित करने और उन्हें कार्यात्मक सेल प्रकार में अंतर करने के लिए रोगों की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति दी है, सहित हृदय, तंत्रिका विज्ञान, और प्रतिरक्षा रोगों. हालांकि स्टेम सेल भेदभाव प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, प्रभावी ढंग से मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और iPSCs different में स्टेम सेल प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोग को सीमित करने में चुनौतियों अनुसंधान कार्यक्रम. विभिन्न सेल लाइनों और क्लोनों में विरासत परिवर्तनशीलता वांछित लिनेज1के लिए स्टेम सेल लाइनों को अलग करने के लिए बाधाएं पैदा कर रही है। इसके अलावा, परिपक्व, hPSCs से टर्मिनल विभेदित कार्यात्मक कोशिकाओं deriving कई वंशों भर में एक थकाऊ और अक्षम प्रक्रिया बनी हुई है. वास्तव में, एचपीएससी से विभेदित कोशिकाएं प्रायः कार्यात्मक कोशिकाओं2में अंतर करने में असफल हो जाती हैं। रोगियों में उपयोग करने के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों को आगे बढ़ाने में, एचपीएससी से उत्पन्न होने वाले कोशिकाओं की प्रभावकारिता में सुधार करने और यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है।

हमारी प्रयोगशाला काफी परिपक्व सेल प्रकार में दोनों iPSCs और ESCs differentiating की दक्षता बढ़ाने के लिए एक त्वरित, सस्ती उपकरण की स्थापना की है. हमने पाया है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया अभिकर्मक dimethyl sulfoxoxide के साथ hiPSCs और HESCs के pretreatment 24 एच से 48 एच के लिए स्टेम सेल भेदभाव क्षमता में एक उल्लेखनीय सुधार में भेदभाव परिणामों का निर्देश से पहले. DMSO के साथ उपचार सेल चक्र के प्रारंभिक G1 चरण में hiPSCs और hESCs के अनुपात में वृद्धि और रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (Rb)3को सक्रिय करता है , सेल प्रसार, अस्तित्व, और भेदभाव4का एक महत्वपूर्ण नियामक . हाल के कार्य में, यह पाया गया है कि एम.बी.एस.ओ. के प्रो-डिफरेंट प्रभावों के लिए आर बी और उसके परिवार के सदस्यों की आवश्यकता होती है, जैसे कि आर बी की क्षणिक निष्क्रियता DMSO के प्रभावों को दबा देती है, जबकि एक क्षणिक तरीके से आरबी के गठन सक्रियण में वृद्धि होती है DMSO के प्रभाव5| भ्रूणीय विकास के दौरान कोशिका चक्र के अनुरूप, ESCs और iPSCs के सेल चक्र एक संक्षिप्त G1 चरण है कि आत्म नवीनीकरण को बढ़ावा देता है की विशेषता है6,7,8. यह संक्षिप्त जी 1 चरण अधिक अप्रतिबंधित प्रसार की अनुमति देता है लेकिन विभेदन4,9 के लिए क्षमता को सीमित करताहै. G1 में विकास गिरफ्तारी को बढ़ावा देने और hESCs और iPSCs के सेल चक्र में जांच की चौकी नियंत्रण को सक्रिय करके, DMSO उपचार सेल भाग्य परिवर्तन के लिए कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं के निर्देश भेदभाव के बाद.

तारीख करने के लिए, DMSO pretreatment 30 से अधिक नियंत्रण और रोग विशेष मानव ईएससी और iPSC सेल लाइनों3,5 के रूप में अच्छी तरह से स्टेम कोशिकाओं और अन्य के भेदभाव में सभी तीन रोगाणु परतों के लिए भेदभाव क्षमता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है बाद के अध्ययनों में विभिन्न प्रकार के अन्य प्रौढ़ कोशिका प्रकारों के सेल लाइनें10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (तालिका 1) . इसके अलावा, DMSO उपचार गैर मानव प्राथमिक कोशिकाओं 21,23 (उदा., माउस, प्राइमेट, खरगोश) के भेदभाव को बढ़ाने में प्रभावी होना दिखाया गया है, प्रजातियों में साझा तंत्र का सुझाव. अंत में, DMSO pretreatment भी जीन संपादन प्रौद्योगिकी के लिए बढ़ा दिया गया है, एक विशेष अध्ययन से पता चलता है कि 24 h DMSO hESCs/iPSCs के pretreatment काफी क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता है की क्षमता में वृद्धि हुई (CRISPR) /CRISPR-संबद्ध प्रोटीन-9 (Cas9)-अवांछित उत्परिवर्तनों को शामिल किए बिना गैर-कोडिंग डीएनए की मध्यस्थता संपादन दक्षता29| यहां स्टेम सेल जीव विज्ञान में अनुप्रयोगों के लिए HESCs और iPSCs के DMSO pretreatment की एक विस्तृत पद्धति है और भेदभाव का निर्देश दिया.

Protocol

1. स्टेम सेल रखरखाव

नोट: नीचे वर्णित सेल रखरखाव प्रोटोकॉल एक अनुलग्न मोनोलेयर में बनाए रखने वाले प्लुइपॉवर स्टेम सेल (पीएससी) पर लागू होता है। मीडिया, अन्य अभिकर्मकों, और सेल संस्कृति प्लेटें DMSO उपचार से पहले इस्तेमाल किया जरूरत के रूप में समायोजित किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में सभी निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, कोशिकाओं को एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए.

  1. कोट बाँझ, 6 अच्छी तरह से, ऊतक संस्कृति एक pluripotent स्टेम सेल योग्य मैट्रिक्स या सब्सट्रेट के साथ प्लेटों का इलाज निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार है और एक सीओ2 इनक्यूबेटर में कम से कम 1 एच के लिए इनक्यूबेट (5% सीओ2,आर्द्र वातावरण). लेपित प्लेटें फिल्म लिपटे और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस के पानी के स्नान में क्रायोपआरक्षित पीएससी को थपथपाएं। जैविक सुरक्षा कैबिनेट को शुरू करने से पहले इथेनॉल के साथ शीशी स्टरलाइज़ करें, फिर तुरंत एक बाँझ शंकु ट्यूब में पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को स्थानांतरित करें जिसमें प्रीवार्म्ड स्टेम सेल मीडिया के 5-10 वॉल्यूम शामिल हैं।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. मीडिया को प्रेरित करें और धीरे से स्टेम सेल मीडिया के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से शुरू करें जो एक 10 डिग्री रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक है, जैसे Y-27632।
  5. थाली से संस्कृति मैट्रिक्स aspirate और वांछित घनत्व पर कोशिकाओं बीज, आम तौर पर 0.5-1 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से कम से कम 2 एमएल स्टेम सेल मीडिया के प्रति अच्छी तरह से.
    नोट: चढ़ाना घनत्व विभिन्न सेल लाइनों, और क्लोन भर में भिन्न हो सकते हैं और तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  6. prewarmed स्टेम सेल मीडिया दैनिक के साथ की जगह से कोशिकाओं को बनाए रखें. कोशिकाओं को लगभग 70%-80% संगम पर विभाजित करें या जब सेल कालोनियों से संपर्क करना शुरू करते हैं।
  7. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, मीडिया को प्रेरित करें और बाँझ पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से एक वियोजन एंजाइम समाधान के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. धो और prewarmed स्टेम सेल मीडिया के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और स्टेम सेल मीडिया के 5-10 संस्करणों के साथ एक बाँझ शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण. कक्षों को प्लेट करने के लिए 1-3-1.7 चरणों का पालन करें।

2. DMSO Pretreatment

नोट: भेदभाव से पहले DMSO pretreatment के लिए कोशिकाओं चढ़ाना, शुरू चढ़ाना सेल घनत्व स्टेम सेल लाइन के विशिष्ट विकास दर के साथ ही भेदभाव प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जा रहा है के विचार के साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए। आवश्यक के रूप में, पारंपरिक मार्करों का उपयोग कर pluripotency मान्य करें। कोशिकाओं को भेदभाव से पहले प्रारंभिक thwing के बाद कम से कम 1x-2x पारित किया जाना चाहिए.

  1. 2 डी संस्कृति भेदभाव
    1. जब कोशिकाएं एक उपयुक्त संगम तक पहुँचती हैं, लेपित प्लेटें तैयार करती हैं, कोशिकाओं को अलग करती हैं, और ऊपर बताए गए रूप में एकल-सेल निलंबन तैयार करती हैं।
    2. trypan नीले या किसी अन्य व्यवहार्यता मार्कर सहित एक हेमोसाइटोमीटर या स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की गणना.
    3. स्टेम सेल मीडिया में 10 डिग्री रॉक अवरोध करनेवाला के साथ अच्छी तरह से 0.5-1 x 106 कोशिकाओं पर एक लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट पर कोशिकाओं को प्लेट।
      नोट: सेल लाइनों हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण के लिए, इन घनत्व आम तौर पर 24 एच DMSO pretreatment के भीतर 80%-90% confluent कोशिकाओं में हुई.
    4. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब् व्2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    5. prewarmed स्टेम सेल मीडिया में 1%-2% DMSO तैयार (उदा., मीडिया के 10 एमएल में DMSO के 10 $L ] 1% DMSO समाधान, या 200 $L DMSO मीडिया के 10 एमएल में - 2% DMSO समाधान).
    6. 24 एच इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं से मीडिया को प्रेरित करें और इसे DMSO समाधान से बदलें।
    7. कोशिकाओं को भेदभाव से पहले एक सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब्व्2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज से 48 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
      नोट: आमतौर पर, एक 24 एच DMSO उपचार मानव ईएससी और iPSC लाइनों के बहुमत भर में पर्याप्त है. बहुत धीमी गति से विकास दर (लंबे दोहरीकरण बार) के साथ सेल लाइनों DMSO के साथ 48 एच ऊष्मायन से लाभ उठा सकते हैं. DMSO के साथ एक 48 एच ऊष्मायन के लिए, मीडिया उपचार के पहले 24 एच के बाद 1%-2% DMSO के साथ ताजा स्टेम सेल मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  2. 3 डी संस्कृति भेदभाव:
    1. जब कोशिकाएं एक उपयुक्त संगम तक पहुँचती हैं, तो ऊपर बताए गए कक्ष निलंबन में कोशिकाओं को अलग और एकत्रित करें।
    2. एक व्यवहार्यता मार्कर सहित एक हेमोसाइटोमीटर या स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की गणना.
    3. एक uncoated में कोशिकाओं प्लेट, कम संलग्न 6 अच्छी तरह से प्लेट पर 0.5-1 x 106 कोशिकाओं स्टेम सेल मीडिया में अच्छी तरह से 10 डिग्री रॉक अवरोध करनेवाला के साथ.
      नोट: हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण सेल लाइनों के लिए, इन घनत्व आम तौर पर स्थापित कोशिकाओं के 24 घंटे के भीतर 3 डी एचपीएससी क्षेत्र के गठन के परिणामस्वरूप.
    4. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब् व्2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    5. prewarmed स्टेम सेल मीडिया में 1%-2% DMSO तैयार (उदा., मीडिया के 10 एमएल में DMSO के 10 $L ] 1% DMSO समाधान, या मीडिया के 10 एमएल में DMSO के 200 $L - 2% DMSO समाधान).
    6. मानक प्रक्रियाओं के बाद मीडिया को बदलें (उदा., प्लेट को 30 डिग्री-45 डिग्री कोण पर झुकाएं ताकि सेल गोलों को कुएं के नीचे व्यवस्थित किया जा सके; कोशिकाओं को एक बाँझ शंकु नली में स्थानांतरित कर दें और सेल गोलियों को ट्यूब के नीचे व्यवस्थित होने दें; या धीरे-धीरे कोशिकाओं को एकत्रित करें। द स्टफिंग एक 5 या 10 एमएल पिपेट का उपयोग कर तेरा बाँझ शंकु ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं में 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए आरटी पर।
    7. कोशिकाओं से मीडिया को प्रेरित करें और इसे DMSO समाधान के साथ बदलें, धीरे से पाइपिंग।
    8. कोशिकाओं को भेदभाव से पहले एक सीओ 2 इनक्यूबेटर (5% ब्व् 2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज से 48 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
      नोट: आमतौर पर, एक 24 एच DMSO उपचार मानव ईएससी और iPSC लाइनों के बहुमत भर में पर्याप्त है. बहुत धीमी गति से विकास दर (लंबे दोहरीकरण बार) के साथ सेल लाइनों DMSO के साथ 48 एच ऊष्मायन से लाभ उठा सकते हैं. DMSO के साथ एक 48 एच ऊष्मायन के लिए, मीडिया उपचार के पहले 24 एच के बाद 1%-2% DMSO के साथ ताजा स्टेम सेल मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

3. प्राथमिक Germ परतों के लिए भेदभाव

नोट: निम्नलिखित विधियों का वर्णन पहले PSCs के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रभावी होने के लिए दिखाया 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर एक मोनोलेयर में हो. इच्छावंशी वंशमें भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO उपचार के बाद पसंद के किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए। एक 24-48 एच उपचार के बाद DMSO समाधान निकालें और मानक प्रोटोकॉल के बाद भेदभाव के साथ आगे बढ़ें।

  1. एंडोडर्म विभेदन (Kroon एट अल से adapted30)
    1. 2 डी संस्कृतियों के लिए ऊपर वर्णित के रूप में DMSO के साथ Pretreat कोशिकाओं.
    2. Wnt3a और Activin एक शेयर समाधान तैयार करें.
    3. तैयार दिन 1 endodermal भेदभाव मीडिया 20 ng/mL और Activin A की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Wnt3a जोड़कर 100 ng/mL की उचित मात्रा में prewarmed RPMI मीडिया की उचित मात्रा में.
    4. DMSO pretreatment के बाद, कोशिकाओं से aspirate मीडिया और यह दिन 1 मीडिया के साथ की जगह (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति).
    5. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब् व्2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    6. तैयारी दिन 2 और 3 endodermal भेदभाव मीडिया prewarmed RPMI मीडिया की उचित मात्रा में 100 एनजी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Activin ए जोड़कर.
    7. कोशिकाओं से Aspirate मीडिया और यह दिन 2 मीडिया के साथ जगह (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति).
    8. कोशिकाओं को सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब् व्2, आर्द्र वायुमंडल) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    9. कोशिकाओं से Aspirate मीडिया और दिन 3 मीडिया के साथ बदलें (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति).
  2. मेसडरम विभेदन (जांग एट अल.31से प्राप्त )
    1. 2 डी संस्कृतियों के लिए ऊपर वर्णित के रूप में DMSO के साथ कोशिकाओं pretreat.
    2. Wnt3a और Activin एक शेयर समाधान तैयार करें.
    3. पूर्व निर्धारित उन्नत RPMI मीडिया की उचित मात्रा के लिए 100 एनजी/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए 20 एनजी/एमएल और Activin A के अंतिम सांद्रता में Wnt3a जोड़कर मध्यविदारक विभेदन मीडिया तैयार करें।
    4. DMSO pretreatment के बाद, कोशिकाओं से aspirate मीडिया और भेदभाव मीडिया के साथ बदलें (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति).
    5. कोशिकाओं को एक सीओ2 इनक्यूबेटर (5% ब् व्2, आर्द्र वातावरण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  3. एक्टोडर्म विभेदन (चेंबर एट अल.32से प्राप्त )
    1. 2 डी संस्कृतियों के लिए ऊपर वर्णित के रूप में DMSO के साथ कोशिकाओं pretreat.
    2. नोगिन और SB431542 स्टॉक समाधान तैयार करें।
    3. नॉकआउट DMEM में 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (KOSR) भंग करके एक्जीमेट भेदभाव आधार मीडिया तैयार करें।
      नोट: मीडिया परिवर्तन के 3-4 दिनों के लिए पर्याप्त आधार मीडिया तैयार करें.
    4. 500 ng/mL और SB431542 की एक अंतिम एकाग्रता के लिए नोगिन जोड़कर एक्टोडर्मल भेदभाव मीडिया तैयार करें prewarmed KOSR/knockout DMEM की उचित मात्रा के लिए 10 डिग्री एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए।
    5. DMSO pretreatment के बाद, कोशिकाओं से aspirate मीडिया और भेदभाव मीडिया के साथ बदलें (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति).
    6. कोशिकाओं को सीओ 2 इनक्यूबेटर (5% सीओ2 , आर्द्र वातावरण)में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, मीडिया को नए सिरे से जोड़े गए विभिन्नकारकों के साथ दैनिक की जगह।

4. संतति सेल प्रकार के लिए भेदभाव

निम्नलिखित विधियों का वर्णन पहले एक 2 डी या 3 डी संस्कृतियों में बड़े PSCs के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है. इच्छावंशी वंशमें भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO उपचार के बाद पसंद के किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए। एक 24-48 एच उपचार के बाद DMSO समाधान निकालें और मानक प्रोटोकॉल के बाद भेदभाव के साथ आगे बढ़ें।

  1. तंत्रिका जनक कोशिका विभेदन (Tchieu एट अल.33से adapted )
    1. एक pluripotent स्टेम सेल के साथ कोटिंग द्वारा 6 अच्छी तरह से प्लेटें तैयार-योग्य कम विकास कारक मैट्रिक्स या सब्सट्रेट, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक सीओ2 इनक्यूबेटर में कम से कम 1 एच के लिए (5% सीओ2, आर्द्र वातावरण). लेपित प्लेटें फिल्म लिपटे और 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. प्लेट PSCs के रूप में एक रॉक अवरोध करनेवाला युक्त स्टेम सेल मीडिया में अच्छी तरह से 0.5-1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर ऊपर वर्णित है.
    3. 2 डी संस्कृतियों के लिए ऊपर वर्णित के रूप में DMSO के साथ Pretreat कोशिकाओं.
    4. छोटे रासायनिक अवरोधकों LDN193189, SB431542, और XAV939 स्टॉक समाधान तैयार करें.
    5. तैयार दिन 1-3 neuroectoderm भेदभाव मीडिया के साथ आवश्यक पूरक द्वारा 6 मीडिया 500 nM LDN193189, 10 $M SB431542, और 2 $M XAV939.
    6. DMSO pretreatment के बाद, मीडिया aspirate और दिन 1-3 neuroectoderm मीडिया के साथ बदलें (जैसे, 2 एमएल एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति). मीडिया दैनिक बदलें.
    7. 500 एन एम LDN193189 और 10 डिग्री एम SB431542 के साथ आवश्यक 6 मीडिया के पूरक द्वारा दिन 4-12 neuroectoderm भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    8. भेदभाव के 4 दिन, मीडिया aspirate और दिन 4-12 neurodectoderm मीडिया के साथ बदलें. मीडिया को दैनिक बदलें.
    9. भेदभाव के 12 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं तंत्रिका संतति कोशिकाओं (एनपीसी) के उपयुक्त मार्कर व्यक्त करना चाहिए। NPCs आगे DMEM/F-12 युक्त तंत्रिका मीडिया में बनाए रखा जा सकता है, 2% बी-27, 1% एन -2, और के साथ पूरक 10 g/mL बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF). एक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग कर जब NPCs पारित, 0.5-1 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से पर NPCs चढ़ाना.
  2. ओलिगोडेनड्रोसाइट जनक कोशिका विभेदन (दुवार्स और फोसती34से प्राप्त )
    1. प्लेट PSCs के रूप में एक रॉक अवरोध करनेवाला युक्त स्टेम सेल मीडिया में लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें पर 1 x 105 प्रति अच्छी तरह से एक घनत्व पर ऊपर वर्णित है.
    2. 2 डी संस्कृतियों के लिए ऊपर वर्णित के रूप में DMSO के साथ Pretreat कोशिकाओं.
    3. SB431542, LDN193189, सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड (आरए) तैयार करें, और एगोनिस्ट (एसएजी) स्टॉक समाधान को चिकना करें।
    4. 10 डिग्री एम SB431542, 250 एनएम LDN193189, और 100 एनएम आरए के साथ DMEM/F-12 के पूरक द्वारा दिन 0-8 भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    5. DMSO pretreatment के बाद, 8 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं, ताजा जोड़ा भेदभाव कारकों के साथ दैनिक मीडिया बदल रहा है (जैसे, एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल).
    6. 8 दिन पर, 1x एमईएम गैर-जरूरी एमिनो एसिड (एनईए) समाधान, 1X एल-ग्लूटामाइन, 2-मेरकैप्टोएनोलनॉल, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1x एन-2 पूरक 100 एनएम आरए और 1 डिग्री एम एसएजी युक्त मीडिया को बदलें। मीडिया को दैनिक बदलें.
    7. भेदभाव के 12 दिनों के बाद, विभेदित कोशिकाओं oligodendrocyte संतति कोशिकाओं (OPCs) के उपयुक्त मार्करों व्यक्त करना चाहिए.
  3. अंत: स्रावी संतति कोशिका विभेदन (Pagliuca एट अल.35से adapted )
    1. स्टेम सेल मीडिया में 6 x 105 कोशिकाओं/एमएल पर बीज पीएससी प्लस 500 एमएल स्पिनर फ्लास्क में 10 डिग्री सेल्सियस रॉक अवरोध करनेवाला एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 70 आरपीएम की रोटेशन दर पर सेट 9-स्थिति हलचल प्लेट पर रखा गया है, 5% सीओ2, और 100% आर्द्रता।
    2. क्लस्टर फ्लास्क के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, मीडिया aspirate, तो 1%-2% DMSO के साथ pretreat.
    3. तैयार Activin एक, Chir99021, KGF, Sant1, सभी ट्रांस retinoic एसिड (आरए), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, और Betacelluin शेयर समाधान.
    4. सारणी 3में तैयार किए गए आधार मीडिया की तैयारी की।
    5. DMSO pretreatment के बाद, aspirate मीडिया और S1 मीडिया के साथ की जगह 100 ng/mL Activin ए और 3 एम एम Chir99021 (जैसे, 500 एमएल प्रति फ्लास्क) के साथ पूरक. 24 ज के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें।
    6. 2 दिन, S1 मीडिया के साथ बदलें 100 ng/mL Activin A. 2 दिनों के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें के साथ पूरक.
    7. 4 दिन, S2 मीडिया के साथ बदलें 50 ng/mL KGF के साथ पूरक. 3 दिनों के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें, पहले 2 दिनों के बाद मीडिया बदल रहा है (दिन 6).
    8. 7 दिन, S3 मीडिया के साथ बदलें 50 ng/mL KGF, 0.25 mM Sant1, 2 mM RA, और 200 nM LDN193189 के साथ पूरक. 24 ज के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें।
    9. 8 दिन, S3 मीडिया के साथ बदलें 50 ng/mL KGF, 0.25 mM Sant1, 2 M RA, 200 एनएम LDN193189, और 500 एनएम PdBU के साथ पूरक. 24 ज के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें।
    10. 9 दिन, S3 मीडिया के साथ बदलें 50 ng/mL KGF, 0.25 m Sant1, और 100 एनएम आरए के साथ पूरक. 5 दिनों के लिए ऊष्मायन की अनुमति दें, हर 2 दिन (दिन 11 और 13) मीडिया बदल रहा है।
    11. दिन 14 और 16 पर, S5 मीडिया के साथ मीडिया की जगह 0.25 एमएम Sant1, 100 एनएम आरए, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i द्वितीय, 1 एमएम T3, और 20 ng/mL betacellulin (4 दिन कुल ऊष्मायन) के साथ पूरक.
    12. दिन 18 और 20 पर, S5 मीडिया के साथ मीडिया की जगह 25 एनएम आरए, 1 एमएम XXI, 10 mM Alk5i द्वितीय, 1 mM T3, और 20 ng/mL betacellulin के साथ पूरक.

5. भेदभाव के इम्यूनोसाइटोकेमिकल सत्यापन

नोट: निम्न विधियों में एक सामान्य इम्यूनोसाइटोकेमिकल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जिसे आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है। प्राथमिक एंटीबॉडी उन है कि पहले से हमारी प्रयोगशाला में मान्य किया गया है. विभेदकेपन के सत्यापन के लिए अन्य तकनीकों का भी उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री, क्यूपीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी सोख्ता, कार्यात्मक परख, आदि)।

  1. इम्यूनोलेबलिंग कक्ष
    1. निलंबन में 3 डी संस्कृतियों के लिए, स्थिर करने से पहले 18-24 एच के लिए लेपित प्लेटों पर एकल सेल निलंबन में बिखरे हुए पूरे सेल क्लस्टर या क्लस्टर प्लेट।
    2. अनुयायी कोशिकाओं से Aspirate मीडिया और एक शेकर पर आरटी में पीबीएस के साथ संक्षेप में धोने.
    3. सेल निर्धारण के लिए, शेकर पर आरटी में 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ एस्पायर पीबीएस और इनक्यूबेट कोशिकाओं।
      चेतावनी: पीएफए स्टॉक अपनी विषाक्तता के कारण एक धूआं हुड के तहत तैयार किया जाना चाहिए. श्वास न करें और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण न पहनें।
    4. पीएफए निकालें और उचित रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें।
    5. एक शेकर पर आरटी पर धोने के प्रति कम से कम 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं।
    6. सेल permeabilization और अवरुद्ध के लिए, 5% गधा सीरम के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं 0.3% triton-x 100/
    7. एक ही समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार permebilization के लिए इस्तेमाल किया /
    8. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में इन्क्यूबेट रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस शेकर पर।
    9. रात भर ऊष्मायन के बाद, एक शेकर पर आरटी पर कम से कम 5 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं।
    10. परमीबिलाइजेशन/ब्लॉकिंग समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    11. एक शेकर पर आरटी में 1 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    12. Aspirate माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और एक शेकर पर आरटी पर धोने के प्रति कम से कम 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धोने।
    13. उचित ऊष्मायन समय के लिए डीएपीआई या किसी अन्य पसंदीदा मार्कर के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं, और पीबीएस में कुल्ला।
  2. छवि परिमाणीकरण
    1. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर शर्त प्रति तीन छवियों की एक न्यूनतम प्राप्त करें और /
    2. एंटीबॉडी दाग कोशिकाओं और कुल सेल संख्या की कुल संख्या की गणना करके प्रत्येक मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत मात्रा (DAPI/Hoechst नाभिक धुंधला के आधार पर) निष्पक्ष इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (जैसे, ImageJ) या के लिए एक स्वचालित स्क्रीनिंग मंच विश्लेषण.

Representative Results

डीएमएसओ ने आइपीएससी का इलाज किया
नियंत्रण विषयों से व्युत्पन्न मानव iPSCs या तो एक अनुयायी 2 डी मोनोलेयर में या निलंबन में 3 डी सेल क्षेत्रों में सुसंस्कृत थे. प्रारंभिक चढ़ाना के बाद लगभग 24 एच, कोशिकाओं के रखरखाव के माध्यम में 24 एच के लिए या तो 1% या 2% DMSO के साथ इलाज किया गया. DMSO उपचार के बाद प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों चित्र 1में दिखाए जाते हैं। एक मोनोलेयर3में बनाए रखा आई पी एस सी के लिए पिछले रिपोर्टों के अनुरूप , DMSO pretreatment गैर-DMSO उपचार कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि दर में एक क्षणिक खुराक पर निर्भर कमी के परिणामस्वरूप (चित्र 1ए)। यह कमी प्रसार सेल-टू-सेल संपर्क में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जो विशेष रूप से 2% DMSO इलाज कोशिकाओं में स्पष्ट है जो अधिक उच्च संकुल सेल कालोनियों के बढ़ते गठन को प्रदर्शित करता है। अन्य सेल प्रकार में, DMSO प्रेरित G1 गिरफ्तारी सेल सेल बातचीत है कि संपर्क निषेध प्रेरित विकास गिरफ्तारी36समर्थन में शामिल प्रोटीन की वृद्धि की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ दिखाया गया है. 3डी कोशिका क्षेत्रों के रूप में बनाए रखे गए आई पी एस सी में, डी एम एस ओ उपचार ने इसी प्रकार सेल गोलों की संख्या में वृद्धि की (चित्र 1ठ)। इसके अलावा, DMSO उपचार भी कम चर 3 डी क्षेत्र आकार है, जो पहले कोशिकाओं37के सुधार भेदभाव क्षमता का संकेत दिखाया गया है में हुई. महत्वपूर्ण बात यह है कि न तो 1% या 2% DMSO के परिणामस्वरूप सेल विषाक्तता हुई, जैसा कि व्यवहार्यता गणना द्वारा मापा गया (एन $ 3; 2D संस्कृति % लाइव ] नियंत्रण: 80 ] 1.3; 1% DMSO: 82 ] 3.7, 2%: 81 ] 2.7; 3D संस्कृति % लाइव ] नियंत्रण: 81 ] 4.3; 1% DMSO: 82 ] 6.7, 2%: 7.2.2.2.2.2. कुल मिलाकर, इन परिणामों धारणा है कि DMSO उपचार सुसंस्कृत स्टेम कोशिकाओं में सेल चक्र और विकास पैटर्न बदल के साथ संगत कर रहे हैं. विकास निषेध पर ये प्रभाव प्रतिवर्ती हैं जब DMSO माध्यम से हटा दिया जाता है, जैसा कि पहले दिखाया गया3.

DMSO उपचार प्राथमिक रोगाणु परतों के लिए ESCs के भेदभाव में सुधार
HUES6 HESCs 24 h के लिए लेपित प्लेटों पर बीज थे और रखरखाव माध्यम में 24 एच के लिए 2% DMSO के साथ उपचार के बाद. इसके बाद चित्र 2ए30,31,32में दर्शाए गए उपचार प्रतिमानों के बाद कोशिकाओं को तीन प्राथमिक रोगाणु परतों में विभेदित किया गया . इसके बाद अलग-अलग कोशिकाओं को स्थिर किया गया और प्रत्येक संबंधित रोगाणु परत के प्रोटोटाइपिक मार्करों के लिए इम्यूनोलॉजिकल रूप से दाग दिया गया (एंडोडर्म के लिए SOX17, मध्यजनर्म के लिए ब्रैकीयूरी, और एक्सोडर्म के लिए SOX1)। जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है, 2% DMSO के साथ pretreatment के 24 ज प्रत्येक संबंधित रोगाणु परत मार्कर व्यक्त कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई. यह हमारी प्रयोगशाला से पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है जिसमें बढ़ी हुई इम्यूनोरेसक्रियता, जीन अभिव्यक्ति, साथ ही डीएमएसओ3,5के साथ उपचारित स्टेम कोशिकाओं में सभी रोगाणु परतों के प्रति विभेदित कोशिकाओं की पूर्ण संख्या दिखाई दे रही है। HUES6 सभी वंश1भर में भेदभाव के लिए बहुत कम प्रवृत्ति के साथ एक हेएससी लाइन है, फिर भी DMSO उपचार काफी हद तक सभी रोगाणु परतों में अंतर करने के लिए अपनी क्षमता में सुधार.

DMSO उपचार जनक सेल प्रकार के लिए भेदभाव में सुधार
सीएनएस संतति कोशिका प्रकार के लिए भेदभाव पर DMSO के प्रभाव की जांच करने के लिए, मानव iPSCs या तो तंत्रिका संतति कोशिकाओं (एनपीसी) या oligodendrocyte संतति कोशिकाओं (OPCs) के लिए विभेदित थे. एनपीसी उत्पन्न करने के लिए, कोशिकाओं को रखरखाव माध्यम में 24 एच के लिए 2% डीएमएसओ के साथ पूर्व उपचार किया गया था जिसके बाद 12 दिनों के निर्देशित विभेदन होने के बाद (चित्र 3ए)। जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है , 2% DMSO pretreatment नियंत्रण की तुलना में एनपीसी मार्कर PAX6 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई. एक अन्य पूर्व मान्य प्रोटोकॉल34 (चित्र 3 C) काउपयोगकरते हुए, आई पी एस सी को 12 दिनों के लिए OPCs में विभेदित किया गया था. NPCs के समान, आई पी एस सी से व्युत्पन्न OPCs 24 h के लिए 2% DMSO के साथ पूर्व व्यवहार किया OPC मार्करों OLIG2 व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि अनुपात का प्रदर्शन किया (चित्र 3डी) .

एक प्रारंभिक DMSO उपचार परिपक्व सेल प्रकार में भेदभाव बढ़ाने के लिए बनी रहती है
एक भेदभाव प्रोटोकॉल के बाद के चरणों पर DMSO के प्रभाव की जांच करने के लिए, HUES8 hESCs 24 h के लिए pretreated थे 2% DMSO के साथ भेदभाव करने से पहले $ कोशिकाओं के लिए एक 20 दिन निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल चित्रा 4में वर्णितएक 35. HUES8 का उपयोग इस प्रकार किया गया था क्योंकि उन्हें पहले से ही एंडोडर्मल वंश1,38की ओर उच्च प्रवृत्ति दिखाई गई है . निश्चित एंडोडर्म चरण में, विभेदित कोशिकाएं SOX17 और FOXA2, निश्चित एंडोडर्म (डे) विशिष्ट मार्करों को व्यक्त करती हैं। अग्नाशयी संतति में आगे भेदभाव के साथ (पीपी1) चरण, विभेदित कोशिकाओं PDX1 और FOXA2 व्यक्त, अग्नाशय के जनक कोशिकाओं की विशेषता मार्करों. अग्नाशयी कोशिका विभेद के इन चरणों में, डे में शामिल होने की क्षमता और बाद में पीपी1 में नियंत्रण और DMSO-उपचारित ESCs दोनों के लिए उच्च थे इन चरणों में से प्रत्येक में विभेदित (चित्र4बी, चरण 1 और 3). हालांकि HUES8 सेल लाइन endodermal वंश में अंतर करने के लिए प्रवृत्ति में वृद्धि हुई है उल्लेख किया गया है, के रूप में भेदभाव आगे टर्मिनल चरणों में अधिक विशेष सेल प्रकार में प्रेरित किया जाता है DMSO इलाज hESCs बहुत अधिक हैं परिपक्व अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं का उत्पादन करने की संभावना. PDX1/NKX6.1+ अग्नाशयी जनक कोशिकाओं, Neurogenin 3 + अंत: स्रावी कोशिकाओं, और NKX6.1/C-पेप्टाइड + एससी-जेड कोशिकाओं के उत्पादन की क्षमता काफी अधिक थे DMSO-उपचारित HESCs (चित्र 4बी, चरणों 4 और 5). ये परिणाम NPC और OPC भेदभाव दिखा रहा है कि DMSO संतान सेल प्रकार के लिए भेदभाव क्षमता को बढ़ाता है और यह भी दर्शाता है कि DMSO के प्रभाव और अधिक विशेष सेल प्रकार पैदा करने में लगातार है के साथ लाइन में हैं. यह पूर्व काम के अनुरूप है, जहां हमने दिखाया है कि प्रारंभिक 24 एच DMSO उपचार रोगाणु परतों में टर्मिनल सेल प्रकार में भेदभाव बढ़ जाती है, न्यूरॉन कोशिकाओं में शामिल है और साथ ही कार्डियोमायोसाइट्स की धड़कन31,39 भेदभाव3के लिए उच्च या गरीब propensities के साथ सेल लाइनों में .

प्रारंभिक DMSO उपचार vivo प्रत्यारोपण में निम्नलिखित HESC व्युत्पन्न सेल समारोह में सुधार
पहले, हम कार्यात्मक अग्नाशय जनक कोशिकाओं है कि बाद में विवो3में इंसुलिन स्राव में एक उल्लेखनीय सुधार दिखाने में hESCs के भेदभाव को बढ़ाने में DMSO उपचार की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है. पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉलकाउपयोग करना 3 ,30,40, HUES8 hESCs 24 एच के लिए 1% DMSO के साथ इलाज किया गया, अग्नाशय जनक कोशिकाओं में विभेदित, और प्रतिरक्षा में प्रतिरोपित SCID-Beige चूहों का आकलन करने के लिए एक ग्लूकोज चुनौती या KCl उत्तेजना के जवाब में इंसुलिन स्राव कार्यक्षमता (चित्र5ए)। जबकि FOXA2 + में भेदभाव की क्षमता ($90%) और PDX1 + ($75%) अग्नाशयी संतति नियंत्रण और DMSO-उपचार के बीच तुलनीय थे (चित्र 5बी) HUES8 हेस्क लाइन के लिए, कोशिकाओं एक 24 एच 1% DMSO उपचार के बाद HESCs से विभेदित ग्लूकोज और KCl के लिए प्रतिक्रिया में सुधार किया था विवो प्रत्यारोपण में निम्नलिखित उत्तेजना. कार्यक्षमता में सुधार 2 सप्ताह के भीतर ट्रांसप्लांटेशन के बाद स्पष्ट हो गया था (चित्र 5ग) और प्रत्यारोपण के बाद कम से कम 16 सप्ताह तक कायम रहा (चित्र 5डी) एक साथ लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि DMSO pretreatment न केवल रोगाणु परतों के लिए भेदभाव दक्षता बढ़ जाती है, जनक कोशिकाओं, और अधिक परिपक्व सेल प्रकार, लेकिन यह भी है कि यह vivo में विभेदित कोशिकाओं की कार्यक्षमता बढ़ाने के लिए बनी रहती है.

विभेदित कक्ष प्रकार कक्ष प्रकार प्रारंभ कर रहा है %DMSO DMSO उपचार की लंबाई DMSO उपचार की लंबाई
हेपेटिक कोशिकाओं Esc
हेपेटोमा सेल लाइन
Esc
Esc
मेसेनकाइमल स्टेम सेल
आई पी एस सी
Esc
Esc
हेपेटोमा सेल लाइन
Esc		 1.0
1.0
1.0
0.5
0.1-2.0
1.0
1.0
0.5
1.0
0.6		 8 दिन
कई दिनों
7 दिन
10-14 दिन
7-21 दिन
7 दिन
4 दिन
5 दिन
2-21 दिन
सब जगह		 बसमा एट अल., 2008
केनब्रैट और एंडर्ससन, 2008
हे एट अल., 2009
Duan एट अल., 2010
अलीज़ादेह एट अल., 2014
Kondo एट अल., 2014
Szkolnicka एट अल., 2014
Czysz एट अल., 2015
निकोलाऊ एट अल., 2016
वानहोव एट अल., 2016
प्राथमिक रोगाणु परतों ईएससी और आईपीएससी
ईईएससी
ईईएससी		 0.1-2.0
0.5
0.1-2.0		 24 घंटे
24 घंटे
24 घंटे		 चेट्टी एट अल., 2013
चेट्टी एट अल., 2015
ली एट अल., 2018
कार्डिएक कोशिकाओं ईएससी और आईपीएससी
P19 कोशिकाओं
ईएससी और आईपीएससी
भ्रूण mesenchymal स्टेम कोशिकाओं		 0.1-2.0
1.0
1.0-2.0
0.8-1.0		 24 घंटे
4 दिन
24-30 घंटे
24 घंटे		 चेट्टी एट अल., 2013
चोई एट अल., 2014
वैन डेन बर्ग एट अल,2016
डेंग एट अल., 2017
अग्नाशयी कोशिकाओं ईएससी और आईपीएससी
ईईएससी		 0.1-2.0
0.5		 24 घंटे
24 घंटे		 चेट्टी एट अल., 2013
चेट्टी एट अल., 2015
चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं P19 कोशिकाओं 1.0 4 दिन चोई एट अल., 2014
एंडोथेलियल कोशिकाओं P19 कोशिकाओं 1.0 4 दिन चोई एट अल., 2014
एन्टेसाइट्स आई पी एस सी 0-1.6 4 दिन ओगाकी एट अल., 2015
गट उपकला आई पी एस सी 0-1.6 4 दिन ओगाकी एट अल., 2015
तंत्रिका कोशिकाओं मारमोसेट आईपीएससी 0.05-2.0 24 घंटे Qiu एट अल., 2015
न्यूट्रोफिल ल्यूकेमिया सेल लाइन 1.25 6-8 दिन टेममोरियन और मोघनलू, 2016
कंकाल मायोट्यूब आई पी एस सी 1.5 24 घंटे Swartz एट अल., 2016
कॉर्टिकल ऑर्गेनॉइड एच आई पी एस सी 1.0 24 घंटे यून एट अल., 2018

तालिका 1: भेदभाव पर DMSO उपचार के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन पहले से प्रकाशित काम का सारांश.

एस 1 एस 2 एस 3 एस 5
MCDB131 (एल) 1 1 1 1
ग्लूकोज (छ) 0.44 0.44 0.44 3.6
NaHCO3 (छ) 2.46 1.23 1.23 1.754
एफएएफ-बीएसए (छ) 20 20 20 20
आईटीएस-एक्स (एमएल) 0.02 0.02 5 5
ग्लूटामैक्स (एमएल) 10 10 10 10
विटामिन सी (मिलीग्राम) 44 44 44 44
हेपरिन (मिलीग्राम) 0 0 0 10
पी/एस (एमएल) 10 10 10 10

तालिका 2: के घटक अंत: स्रावी जनक कोशिका भेदभाव आधार मीडिया.

Figure 1
चित्र 1 : DMSO उपचार hPSCs के विकास को बदल देता है. (क) 24 घंटे के लिए 1% या 2% डीएमएसओ के साथ कोई उपचार (नियंत्रण) या उपचार प्राप्त करने के बाद एक मोनोलेयर में चढ़ाया गया hiPSCs के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों को आईपीएससी के क्षणिक खुराक-निर्भर विकास निषेध को बढ़ावा देता है। (बी) 24 घंटे के लिए कोई उपचार (नियंत्रण) या उपचार प्राप्त करने के बाद 3 डी क्षेत्र के गठन की अनुमति देने के लिए कम संलग्न प्लेटों पर चढ़ाया hiPSCs के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों कम चर 3 डी क्षेत्र के गठन में परिणाम 1% या 2% DMSO के साथ नियंत्रण की तुलना में. स्केल बार ] 500 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : DMSO उपचार प्राथमिक रोगाणु परतों के लिए hPSCs के भेदभाव में सुधार. (ए) तीन प्राथमिक रोगाणु परतों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभेदन प्रोटोकॉल का स्केमेटिक। (B) अलग-अलग HUES6 HESCs के प्रतिनिधि चित्र, SOX17 (एंडोडर्म), लघुत्व (मेसोडरम) और SOX1 (एक्टोडर्म) के लिए प्रतिरक्षण किए गए हैं। 24 एच के लिए 2% DMSO के साथ pretreatment सभी तीन रोगाणु परतों भर में भेदभाव दक्षता में वृद्धि हुई. SOX17+ एंडोडर्मल, ब्रैकीयूरी (ब्रैकी) + mesodermal, या SOX1 + एक्टोडर्मल कोशिकाओं में भेदभाव कोशिकाओं का प्रतिशत नियंत्रण के प्रत्येक रोगाणु परत में निर्देशित भेदभाव के बाद और DMSO इलाज HESCs तीन जैविक प्रतिकृति के SEM के साथ नोट कर रहे हैं . अयुग्मित t-परीक्षण: अंत:डर्म च ] 0.0003; मध्यचर्म च ] 0.047; बाह् यचच च ] 0ण्015. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : DMSO उपचार तंत्रिका जनक कोशिका प्रकार के लिए भेदभाव में सुधार. (ए) विभेदन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध जो तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। (ख) मानव आई पी एस सी के प्रतिनिधि चित्र ों को पैक्स6 के लिए प्रतिकतमा में विभेदित किया गया है। 24 2% DMSO के साथ pretreatment के ज संख्या PAX6 सकारात्मक कोशिकाओं में वृद्धि हुई. नियंत्रण के निर्देशित भेदभाव और DMSO इलाज मानव iPSCs के निर्देश के बाद Pax6 + NPCs में भेदभाव कोशिकाओं का प्रतिशत तीन जैविक प्रतिकृति के SEM के साथ उल्लेख कर रहे हैं. अयुग्मित t-परीक्षण: p ] 0.0225. स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (सी) भेदभाव प्रोटोकॉल के Schematic oligodendrocyte संतति कोशिकाओं (OPCs) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। (डी) मानव आई पी एस सी के प्रतिनिधि छवियों को ओपीसी मार्कर ओलिग2 के लिए इम्यूनोलेबल में विभेदित किया गया है। 2% DMSO के साथ pretreatment के 24 एच नियंत्रण की तुलना में दोनों OPC मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई. नियंत्रण के निर्देशित भेदभाव और DMSO इलाज मानव iPSCs के निर्देश के बाद Olig2 + OPCs में भेदभाव कोशिकाओं का प्रतिशत चार जैविक प्रतिकृति के SEM के साथ उल्लेख कर रहे हैं. अयुग्मित t-परीक्षण: p $ 0.0466. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : DMSO उपचार एचपीएससी के टर्मिनल भेदभाव क्षमता को बढ़ाता है। (क) एक $ 20 दिन के Schematic TERMINALd विभेदित अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं में HUES8 HESCs के भेदभाव का निर्देश दिया. (ख) विभेद के प्रत्येक चरण में इंगित मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेशन के बाद अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं और कोशिकाओं के 24 एच के लिए 2% डीएमएसओ के साथ पूर्व व्यवहार का निर्देश दिया गया है। प्रारंभिक DMSO उपचार निर्देशित भेदभाव के बाद के चरणों में टर्मिनल अंत: स्रावी सेल प्रकार में भेदभाव को बढ़ाने के लिए बनी हुई है। नियंत्रण के निर्देशित भेदभाव और DMSO-उपचारित एचएसईएससी के निर्देशित भेदभाव के बाद भेदभाव के प्रत्येक चरण में संकेत मार्करों में भेदभाव कोशिकाओं के प्रतिशत दो से चार जैविक प्रतिकृतियां के SEM के साथ नोट कर रहे हैं. स्केल बार ] 200 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : एचपीएससी के प्रारंभिक डी एम एस एस ओ उपचार विवो में अग्नाशयी संतति कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद ग्लूकोज की जवाबदेही को बढ़ाताहै . (क) अनुसूचत जात के ्या अनुसूचत जात-जनजात में ह्युज8 एचईएस सी के निर्देशित विभेद ($15 दिन) (पीपी2) के बाद कोई उपचार (नियंत्रण) या 24 ज 1% डी एम एस ओ उपचार और बाद में प्रतिरोपण (5 मिलियन कोशिकाएं) को इम्यूनोडेफिकेशन में SCID-बेग चूहों. (ख) पीडीएक्स1+ और फॉक्सए2+ अग्नाशयी जनक कोशिकाओं में अंतर करने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत, इन विट्रो में निम्नलिखित नियंत्रण के भेदभाव और डी एम एस ओ-उपचार के तुरंत पहले ट्रांसप्लांटेशन (एन जेड 1)। (ग) माध्य एलाइसा मापता है कि चूहों के सीरम से एक निम्न (2.5 एमएम) या उच्च (15 एम एम) ग्लूकोज चुनौती या पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल ) उत्तेजना में (सी) 2 सप्ताह और (डी) 16 सप्ताह के बाद अग्नाशय के प्रत्यारोपण के बाद संतति कोशिकाओं को नियंत्रण और DMSO-उपचारित HESCs (त्रुटि सलाखों ] SEM; n $ 3 पर 2 सप्ताह और नियंत्रण के लिए 16 सप्ताह; n $ 2 पर 2 सप्ताह और DMSO के लिए 16 सप्ताह) के लिए विभेदित कोशिकाओं. दो तरह से ANOVA: 2 सप्ताह में नियंत्रण बनाम DMSO के लिए p $ 0.0051; 16 सप्ताह में नियंत्रण बनाम DMSO के लिए 0.0116 p. अलग-अलग समय पर अध्ययन किए गए चूहे भिन्न-भिन्न होते हैं। परिणाम चेट्टी एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं3. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सारांश में, इस प्रोटोकॉल सभी प्राथमिक रोगाणु परतों के लिए pluripotent स्टेम कोशिकाओं (PSCs) के भेदभाव क्षमता को बढ़ाने के लिए एक सरल और सस्ती उपकरण का वर्णन करता है, विशेष जनक कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, और यहां तक कि कार्यात्मक, परिपक्व सेल प्रकार में इन विट्रो और विवो सेटिंग्स में। इलस्ट्रेटेड विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से हमारी प्रयोगशाला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दूसरों में पुनरुत्पादित किया गया है, लेकिन पसंद के किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल DMSO उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसा कि तालिका 1में दर्शाया गया है, अनेक प्रयोगशालाओं ने विभिन्न अन्य समीय सेल प्रकारों को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रतिमानों का उपयोग करते हुए क्षणिक डी एमएसओ उपचार के बाद पीएससी विभेदन में वृद्धि का भी प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, हालांकि यहाँ तरीकों मानव PSCs के उपयोग का वर्णन, DMSO pretreatment प्रजातियों भर में उपयोग किया जा सकता है और माउस में प्रभावी होना दिखाया गया है, खरगोश, और प्राइमेट PSCs.

हालांकि DMSO की उच्च खुराक cytotoxic होने के लिए जाना जाता है, कम खुराक इस विधि में इस्तेमाल किया (1%-2%) एक क्षणिक अवधि के लिए कम से कम सेल मौत में परिणाम. जबकि समग्र सेल संख्या तुरंत DMSO उपचार के बाद सेल चक्र के G1 चरण में सेल चक्र गिरफ्तारी के DMSO पदोन्नति के कारण कम हो सकता है, पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि कोशिकाओं को हटाने के बाद नियंत्रण संस्कृतियों के रूप में संगम के एक ही स्तर तक पहुँचने में सक्षम हैं DMSO3|

प्रतिशत और DMSO pretreatment की अवधि सेल लाइन प्रति अनुकूलित किया जाना चाहिए. उपचार के समय को कोशिकाओं के साइकिल चालन/डबलिंग समय के लिए विचार के साथ समायोजित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, माउस PSCs आम तौर पर के बारे में 15 ज की बहुत कम साइकिल चालन समय है; इस प्रकार, इन कोशिकाओं के लिए 15 एच के लिए DMSO उपचार पर्याप्त है. कुछ प्रयोगशालाओं ने भी पाया है DMSO उपचार फायदेमंद हो सकता है जब भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान या कम सांद्रता पर जारी रखा (तालिका 1देखें ). यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ पीएससी लाइनें विशिष्ट वंशों के लिए भेदभाव करने के लिए अधिक संशोधन योग्य हैं। उदाहरण के लिए, HUES6 कोशिकाओं को भेदभाव के लिए कम स्वीकार्य होना दिखाया गया है और इस प्रकार DMSO उपचार के साथ उल्लेखनीय सुधार किया था (चित्र 2) . वैकल्पिक रूप से, चित्र 4 और चित्र 5 में प्रयुक्त HUES8 कोशिकाओं को एंडोडर्मल विभेद की दिशा में उच्च प्रवृत्ति दिखाई गई है; इस प्रकार, निश्चित एंडोडर्म की ओर प्रारंभिक चरणों में भेदभाव के लिए नियंत्रण और DMSO के बीच कम अंतर दिखाए गए थे। फिर भी, DMSO pretreatment की वृद्धि इस सेल लाइन में भेदभाव के बाद के चरणों में मनाया जाता है (चित्र 4बी). DMSO उपचार भी है कि यह दोनों 2 डी और 3 डी सेल संस्कृतियों प्रणालियों में प्रभावी है में बहुमुखी है, यह सेल संस्कृति प्लेटों पर कोटिंग सामग्री के विभिन्न प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह रखरखाव माध्यम के विभिन्न प्रकार में काम करता है कि विकास और विस्तार को बढ़ावा देने के एचपीएससी (उदा., एमटीईएसआर, ई 8, एमईएफ वातानुकूलित मीडिया, आदि)।

अधिक आम तौर पर, इन परिणामों का सुझाव है कि pluripotent स्टेम कोशिकाओं की प्रारंभिक राज्य प्रारंभिक भेदभाव के लिए प्रवृत्ति पर एक मजबूत प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कार्यात्मक सेल प्रकार में टर्मिनल भेदभाव है. हम पहले से पता चला है कि DMSO उपचार hPSCs3,5 में Rb के माध्यम से कार्य करताहै. Rb टर्मिनल भेदभाव को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सेल अस्तित्व , और कोशिकाओं की आनुवंशिक स्थिरता41,42,43,44, और यह इसलिए कोशिकाओं पर लगातार प्रभाव की व्याख्या कर सकते हैं DMSO से अलग-इलाज hPSCs. विनियमन के इन प्रारंभिक तरीकों को लक्षित भेदभाव के लिए एक बेहतर पथ पर hPSCs जगह और अंततः पुनर्योजी दवा के लिए उनकी उपयोगिता में सुधार हो सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के चिकित्सा के स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय स्कूल और एक Siebel फैलोशिप एस सी को सम्मानित से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Gibco 21985023
6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353046
9-Position stir plate  Chemglass CLS-4100
Accutase Gibco 11105-01
Activin A R&D Systems 338-AC
Advanced RPMI Gibco 12633012
Alk5i II Axxora ALX-270-445
All-trans retinoic acid  Sigma-Aldrich R2625
anti-Brachyury R&D Systems AF2085 No variablity observed across different lot numbers
anti-C-peptide Developmental Studies Hybridoma Bank GN-ID4 No variablity observed across different lot numbers
anti-FoxA2 Millipore 07-633 No variablity observed across different lot numbers
anti-Nkx2.2 University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank 74.5A5 No variablity observed across different lot numbers
anti-Nkx6.1 University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;  F55A12-supernatant No variablity observed across different lot numbers
anti-Olig2 EMD Millipore MABN50 No variablity observed across different lot numbers
anti-Pax-6 Biolegend 901301 No variablity observed across different lot numbers
anti-Pdx1 R&D Systems AF2419 No variablity observed across different lot numbers
anti-SOX1  R&D Systems AF3369 No variablity observed across different lot numbers
anti-SOX17 R&D Systems AF1924 No variablity observed across different lot numbers
B-27 Supplement, minus Vitamin A Gibco 12587010
Basic fibroblast growth factor Gibco PHG0264
Betacellulin Thermo Fisher Scientific  50932345
Chir99021 Stemgent 04-000-10
CMRL 1066 Corning 99-603-CV
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAF1000
D-(+)-Glucose Sigma  G7528 
DAPI Invitrogen  D1306
Disposable Spinner Flasks Corning, VWR 89089-814
DMEM/F-12 Gibco 11320033
DMSO  Sigma-Aldrich D2650
Essential 6 Media Gibco A1516501
FAF-BSA Proliant  68700
FGF7 PeproTech 100-19
Geltrex Gibco A1413202
GlutaMAX  Gibco 35050061
Heparin  Sigma  H3149 
Human Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO Diagnostics 80-INSHUU-E01.1
ITS-X Invitrogen  51500056
KGF Peprotech AF-100-19
Knockout DMEM Gibco 10829018
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) EMD Millipore 642245
LDN193189 Stemgent 04-0074
Matrigel Matrix Corning 354277
MCDB-131  Cellgro  15-100-CV 
MEM NEAA Gibco 11140050
mTeSR 1 StemCell Technologies 5850
N2 Supplement Life Technologies 17502048
NaHCO3 Sigma  S3817 
Noggin Fc Chimera Protein R&D Systems 3344-NG-050
PdBU EMD Millipore 524390
Penicillin/Streptomycin  Mediatech  30-002-CI
RPMI Gibco 11875-093
Sant1 Sigma-Aldrich S4572
SB431542 Stemgent 04-0010
Smoothened Agonist, SAG EMD Millipore 566660
StemPro Accutase Gibco A1110501 
TrypLE Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment Microplates Corning 3471
Vitamin C Sigma-Aldrich A4544 
Wnt3a R&D Systems 5036-WN
XAV 939 Tocris 3748
XXI EMD Millipore 565790
Y-27632 StemCell Technologies 72302

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 149 मानव pluripotent स्टेम सेल भेदभाव DMSO रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन सेल चक्र सेल भाग्य
भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO के साथ मानव Pluripotent स्टेम सेल के क्षणिक उपचार
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Sambo, D., Li, J., Brickler, T.,… More

Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation. J. Vis. Exp. (149), e59833, doi:10.3791/59833 (2019).

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