Summary
מאמר זה מסביר בפירוט גישה שיטתית להערכת זמינות מיקרו-מינרלית בסלמון אטלנטי. המתודולוגיה כוללת כלים ומודלים עם מורכבות ביולוגית גוברת: (1) ניתוח דגימה כימית, (2) מסיסות במבחנה, (3) מחקרי ספיגה בקווי תאים, ו-(4) במחקרי דגי vivo.
Abstract
הערכת הזמינות של מיקרו-מינרלים תזונתיים היא אתגר גדול בתזונה מינרלית של מיני דגים. המאמר הנוכחי נועד לתאר גישה שיטתית המשלבת מתודולוגיות שונות כדי להעריך את הזמינות של אבץ (Zn) בסלמון אטלנטי(משכורת סלמו). בהתחשב בכך שכמה מינים כימיים Zn יכול להיות נוכח במזון סלמון אטלנטי, הועלתה ההשערה כי זמינות Zn מושפעת מינים כימיים Zn הנוכחי להאכיל. לכן, במחקר זה, הפרוטוקול הראשון הוא על איך לחלץ את המינים הכימיים Zn שונים מן ההזנה ולנתח אותם על ידי גודל הדרת כרומטוגרפיה-אינדוקטיבית מצמיד ספקטרוסקופיית מסת פלזמה (SEC-ICP-MS) שיטה. לאחר מכן, פותחה שיטת במבחנה כדי להעריך את המסיסות של Zn תזונתיים במזון סלמון אטלנטי. הפרוטוקול השלישי מתאר את השיטה לחקור את ההשפעה של שינוי הרכב מינים כימיים Zn על ספיגת Zn במודל אפיתל מעי דגים באמצעות קו תאי המעי פורל קשת (RTgutGC). יחד, הממצאים משיטות ההפריה הושוו למחקר in vivo שבחן את הזמינות לכאורה של מקורות אנאורגניים ואורגניים של Zn בתוספת הזנות סלמון אטלנטיות. התוצאות הראו כי מספר מינים כימיים Zn ניתן למצוא הזנות ואת היעילות של מקור Zn אורגני תלוי מאוד חומצת אמינו ליגנד המשמש כלאט Zn. הממצאים של שיטות במבחנה היו פחות מתאם עם תוצאה זו של מחקר in vivo. עם זאת, בפרוטוקולים במבחנה המתוארים במאמר זה סיפקו מידע חיוני לגבי זמינות Zn והערכתה בהזנות דגים.
Introduction
ארוחות דגים ושמן דגים שימשו באופן מסורתי במזון סלמון אטלנטי. עם זאת, מרכיבים אלה מוחלפים יותר ויותר על ידי מרכיבים על בסיס צמחי1. השינוי הנ"ל בהרכב המזון הביא לזמינות תזונתית נמוכה ולצורך מוגבר בשיפור הזמינות של מינרלים במזון סלמון אטלנטי, במיוחד אבץ (Zn)2. הזמינות המופחתת עשויה להיות תוצאה של שינוי ברמת Zn, מינים כימיים Zn או / וגורמים antinutritional נוכח מטריצת ההזנה. בתרחיש זה, מערך חדש של תוספים שנחשבים באופן כללי כ'מקורות אורגניים 'הופיעו עם פוטנציאל להיות מקור זמין טוב יותר של מינרלים תזונתיים לדגים. לכן, חשוב להבין כימיה בסיסית ופיזיולוגיה השולטת בזמינות המינרלים ומקורותיהם לדגים. אבץ הוא יסוד קורט חיוני לכל האורגניזמים החיים3. תפקידו של Zn כמולקולת איתות תואר הן ברמה הצפרית והן ברמה התאית בדגים4. בסלמון האטלנטי, מחסור Zn נקשר עם חריגות שלד ופעילות מופחתת של Zn metalloenzymes שונים5,6.
מחקר זה מתאר גישה שיטתית להבנת זמינות Zn על ידי סיווגו לארבעה תאים שונים של מורכבות כימית וביולוגית מגוונת. השיטות המעורבות מתוארות בארבעה חלקים, כפי שניתן לראות באיור 1: (1) הערכה של מינים כימיים Zn בשבר המסיס של הזנת סלמון אטלנטית באמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללה- ספקטרוסקופיית מסת פלזמה מצמידה באופן אינדוקטיבי (SEC-ICP-MS) שיטה7; (2) מסיסות במבחנה של Zn בתוספת להאכיל סלמון אטלנטי; (3) הערכת ספיגת מינים כימיים Zn על ידי מודל מעיים במבחנה (RTgutGC)8; ו -(4) זמינות לכאורה של Zn בסלמון אטלנטי(משכורת סלמו)9. פרוטוקולים דומים ניתן לפתח עבור מינרלים אחרים (למשל, מנגן, סלניום, נחושת) עניין תזונתי למינים דגים חקלאות ימית.
Protocol
ניסוי ההאכלה בסעיף 4 בוצע על פי נורוויג'ן (עבור-2015-06 - 18-761) וחקיקה אירופית (הוראה 2010/63/האיחוד האירופי).
1. הערכה של מינים כימיים Zn בשבר המסיס של מזון סלמון אטלנטי באמצעות שיטת SEC-ICP-MS
- חוצץ חילוץ (100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.5)
- הכן את חיץ החילוץ על ידי המסת כמות מתאימה של tris(hydroxymethyl)aminomethane כדי להגיע לחוזק היוני הרצוי (100 מ"מ) ב- H2O אולטרה-ת..
- התאם את ה- pH של הפתרון ל- pH 8.5 עם פתרון HCl, ניטור שינוי ה- pH עם מד pH.
- הכנת דגימות הזנה
הערה: דגימת ההזנה בה נעשה שימוש פותחה על בסיס הזנה מסחרית לסלמון אטלנטי, המכילה מקורות חלבון בעיקר מרכיבים צמחיים (כלומר, כ-5% חלבון דגים, 10% שמן דגים, 68% חלבון על בסיס צמחי ו-12% שמן צמחי). אבץ סולפט נווסף למזון.- טוחנים את דגימת ההזנה ביד באמצעות עלה ומלט.
- מסננים את דגימת ההזנה כדי להבטיח כי החילוץ מבוצע בשבר הזנה עם גודל חלקיקים דומה (מ 850 מיקרומטר ל 1.12 מ"מ).
- המשך לבצע את החילוץ ZN.
- מיצוי אבץ מדגימת הזנה
- שקול כ 0.5 גרם של הזנה משולש לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל.
- הוסף את מאגר החילוץ (5 מ"ל של 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) לדגימות.
- לחלץ את הדגימות בסובב (20 סל"ד) ב 4 °C (5 °F) עבור 24 שעות.
- הפרד את השברים המסיסים והלא מסיסים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 x g.
- השתמש במסנן מזרק חד-פעמי בגודל 0.45 מיקרומטר כדי לסנן את השבר המסיס.
- העבר את הדגימות המסוננות לצינורות נקיים.
- בצע את ניתוח דגימת Zn בשברים המסיסים באמצעות SEC-ICP-MS, כמתואר בשלב 1.6.
הערה: סיכום ההליך לחילוץ Zn מדגימת הזנה מתואר באיור 2.
- פתרון פאזה ניידת (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7.5)
- הכן את פתרון הפאזה הניידת המסה 6.057 גרם של טריס (הידרוקסימתיל)אמינומטן ב 1 L של פתרון MeOH 3% (v/ v).
- התאם את ה- pH של הפתרון ל- pH ל- 7.5 עם פתרון HCl, ניטור שינוי ה- pH עם מד pH.
- סנן את פתרון הפאזה הנייד באמצעות מסנן ממברנה 0.45 מיקרומטר.
- כיול משקל מולקולרי של טווח הפרדת העמודות של ה- SEC
- כייל את טווח ההפרדה על-ידי ביצוע כיול משקל מולקולרי.
הערה: במחקר זה thyroglobulin (660 kDa), Zn / Cu סופראוקסיד דיסמוטאז (32 kDa), מיוגלובין (17 kDa) וויטמין B12 (1.36 kDa) שימשו. - הכן כל אחד מהתקנים עם ריכוז ידוע ב- H2O אולטרה-תפו.
- הכן ממתקינה כרומטוגרפית נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) על-ידי הוספת 250 μL של תקן למצקה.
- טען את הבקבוקונים עם תקנים לרצף לרוץ של הדגימות.
- הפעל את כיול המשקל המולקולרי בהתחלה ובסוף הרצף האנליטי, ניטור 127I (thyroglobulin), 66Zn (Zn / Cu סופראוקסיד דיסמוטאז), 57Fe (מיוגלובין) ו 59Co (ויטמין B12).
הערה: כיול המשקל המולקולרי מבוצע בו זמנית עם ניתוח דגימת Zn.
- כייל את טווח ההפרדה על-ידי ביצוע כיול משקל מולקולרי.
- ניתוח דגימת אבץ באמצעות SEC-ICP-MS
הערה: ניתוח דגימת Zn על ידי שיטת SEC-ICP-MS פותחה על בסיס עקרונות המתוארים במקומות אחרים10,11 ואופטימיזציה נוספת בוצעה לניתוח של הזנת סלמון אטלנטי7.- בצע את ניתוח דגימת Zn על השברים המסיסים באמצעות עמודת כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) ו- HPLC בשילוב עם ספקטרוסקופיית מסת פלזמה משולבת (ICP-MS).
- הכן בון HPLC על-ידי הוספת 250 μL של שבר מסיס ללוויה.
- לפני הניתוח, ספייק את כל הדגימות עם 0.5 μL של ויטמין B12. שלב זה מאפשר לתקן עבור משמרות זמני שמירה, ניטור 59Co.
- לדלל את השבר המסיס עם חוצץ החילוץ (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) ולהתאים לנפח סופי של 1 מ"ל.
- הכן את ריצת הרצף של הדגימות בסדר אקראי.
- כוונן את ה- ICP-MS בהתאם להוראות היצרן.
- בצע את הגדרות המכשיר עבור HPLC ו- ICP-MS המבצעים את ניתוח דגימת Zn (ראה טבלה 1).
2. מסיסות במבחנה של Zn בתוספת להאכיל סלמון אטלנטי
הערה: מדגם ההזנה בו נעשה שימוש פותח על בסיס הזנה מסחרית לסלמון אטלנטי, המכיל מקורות חלבון בעיקר מרכיבים צמחיים (כלומר, כ-5% ארוחת דגים, 10% שמן דגים, 68% רכיבים על בסיס צמחי ו-12% שמן צמחי).
- טוחנים את דגימות המזון סלמון אטלנטי עבור 10 s ב 3000 סל"ד באמצעות טחנת סכין ולאחסן ב 4 °C (50 °F) עד ניתוח נוסף.
- שקול ~ 0.2 גרם של דגימות הזנה הקרקע בשלב 2.1 ולהוסיף רדיוטרייזר Zn (65Zn) של פעילות ספציפית ידועה בצינור מדגם נפח 5 מ"ל (עם מכסה).
זהירות: הליך זה חייב להתבצע בתוך חבילת רדיונוקלידים. האדם המבצע שלב זה צריך להיות מאומן ומאושר לטפל איזוטופים רדיו. יש להקפיד על אמצעי הבטיחות והזהירות המומלצים על ידי מינהל בטיחות הקרינה של המכון. - לאחר מכן להכין את פתרון חיץ זוהר מעיים מים מתוקים כמתואר להלן.
- לתמיסת מלח A, שקול 11.65 גרם של NaNO3, 0.55 גרם של KNO3 ו 0.4 גרם של MgSO4. ממיסים את המלחים ב-H2O אולטרה-ת'ור ומסתגלים לנפח סופי של 60 מ"ל.
- לתמיסת מלח B, שקול 0.31 גרם של Ca(NO3)2· 4 H2O. ממיסים את המלחים ב- H 2 O אולטרה-תפותי ומסתגלים לנפח סופי של 10 מ"ל.
- השתמש בתמיסת מלאי HEPES של 500 מ"מ כתמיסת מלח C.
- לתמיסת מלח D, שקול 1.2 גרם של MgCl2, להמיס את המלח ב- H2O אולטרה-ת'ור ולהתאים לנפח סופי של 20 מ"ל.
- לתמיסת מלח E, לשקול 0.9 גרם של MgSO4, להמיס את המלח ב אולטרה-pure H2O ולהתאים לנפח הסופי של 20 מ"ל.
- הכן פתרון פירובט על ידי המסת 0.55 גרם של CH3COCOONa ב 10 מ"ל של אולטרה-pure H2O.
- יש להמיס 0.9 גרם גלקטוז (C6H12O6)באולטרה-דור H2O.
- ממיסים היטב באמצעות מערבל מגנטי ומעקרים פתרונות מלח A, B, D ו- E על ידי autoclaving, ופתרון C, פירובט וגלקטוז על ידי סינון באמצעות מסנן מזרק 200 מיקרומטר.
- לאחר הכנת פתרונות המלאי השונים, כדי להכין 100 מ"ל של פתרון עבודה של המאגר, לערבב את הפתרונות המוכנים לעיל בפרופורציה הבאה: 6.8 מ"ל של פתרון מלח A, 4.14 מ"ל של B, 5 מ"ל של C, 2.5 מ"ל של D, 1.5 מ"ל של E, ו 1.14 מ"ל כל פירובט וגלקטוז. הפוך את הנפח ל 100 מ"ל באמצעות מים deionized.
הערה: המאגר לעיל ייצג כעת את ההרכב היוני של לומן המעיים שנמצא סלמונידים מים מתוקים.
- הכן שישה aliquots אחרים של המאגר המתואר בשלב 2.6 ולהוסיף אחת מחומצות האמינו הבאות (ציסטאין, מת'יונין, גליצין, היסטידין, ליצין וארגינין) כדי להגיע לריכוז טוחנת סופי של 5 מ"מ.
- הוסף את המאגר הזוהר במעיים מתוקים (נפח תגובה = 3 מ"ל; pH 7.4) לדגימת ההזנה.
- חזור על שלב 2.5 עם המאגרים המתוארים ב 2.4 (בנוכחות חומצות אמינו שונות בריכוז של 5 מ"ר).
- סגור את הצינורות ולאפשר להם להסתובב ספינר סיבובי במשך 30 דקות ב 25 סל"ד.
- הפרד את השברים המסיסים והלא מסיסים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1157 x g.
- השתמש בקופת גמא כדי למדוד את הספירה לדקה (סל"ד) של 65Zn בשברים המסיסים והלא מסיסים.
- חשב את חלקם של איזוטופי הרדיו של Zn (65Zn) הנמצאים בשברים המסיסים והלא מסיסים.
3. הערכה של ספיגת מינים כימיים Zn באמצעות מודל מעיים במבחנה (RTgutGC)
- תרבית תאי RTgutGC
הערה: כל חומרי העבודה המשמשים בשלב זה צריכים להיות סטריליים.- להחיות את תאי RTgutGC קפוא בעדינות באמבט מים להגדיר ב 20 °C (50 °F).
- פיפט בעדינות את הפתרון המכיל את התאים ולהשעות אותם ב 10 מ"ל של בינוני L15 המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
הערה: 10% FBS משמש רק להחייאת התאים הקפואים. עבור מעבר עוקב, FBS משמש ב 5%. הרכב FBS יכול להשתנות בין אצוות, ולכן מומלץ לקנות ולהצטייד ככל הנדרש מאצווה אחת כדי למנוע וריאציות בין אצווה בהרכב הסרום. - מוסיפים את מתלה התא ל-75 ס"מ2 צלוחיות תרבית תאים ודגרה באינקובטור שנקבע על 19 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה רגילה.
- בדוק את התאים וכאשר confluent (80% מפגש, להעריך חזותית על ידי בחינת הצפיפות של פני השטח של התא תחת מיקרוסקופ), לפצל את התאים לבקבוקונים חדשים (מעבר הבא) או קציר לשימוש בניסויים.
הערה: דוגמה לתאי RTgutGC שעה ושבוע לאחר זריעה לבקבוקי תרבית התא מוצגת באיור 3.
- קציר תאים והכנה לניסויי חשיפה
- לשטוף תאים פעמיים עם 1 mL אתילנדימינאטראפטי חומצה (EDTA) פתרון. לאחר כל שטיפה, לשאוב את פתרון EDTA באמצעות צינור יניקה סטרילי.
- לטפל בתאים עם טריפסין (0.7 מ"ל של טריפסין, ב 0.25% מלוחים חוצצי פוספט [PBS]).
- סובבו בעדינות את הבקבוק בזוויות חריפות כדי להפיץ את טריפסין לאורך כל פני השטח של הבקבוקון.
- המשך סיבוב במשך 2 דקות, בעוד התאים להתנתק.
- לאחר סיבוב עדין במשך 2 דקות, להוסיף 10 מ"ל של L15 / FBS בינוני כדי לנטרל טריפסין.
- נקה את ההשעיה התא וכתוצאה מכך לתוך צינור צנטריפוגה תחתון חרוטי באמצעות פיפטה סטרילית צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 130 x g.
- לקבוע את הצפיפות של התאים שנקטפו על ידי ספירה ידנית באמצעות hemocytometer.
- הוסף אמצעי אחסון נדרש של אמצעי L15/FBS כדי להשיג צפיפות תאים של 5 x 104 תאים/מ"ל.
- זרע את התאים על לוחות 24-well על ידי pipetting 1 מ"ל של השעיית תא לבאר כדי להשיג את צפיפות התא הסופית של 5 x 104 תאים / טוב.
הערה: רצוי להשתמש בצינורות מרובי מחלקות כדי למזער את השונות ולקצר את הזמן. - מניחים את הצלחות המוזרעות באינקובטור תחת אטמוספירה רגילה ב 19 °C (48 שעות לפני הניסויים.
הערה: טריפסין להיות מאוחסן ב -20 °C (70 °F); פתרון EDTA ומדיית L15/FBS ב-4 °C (70 °F). התאם את הטמפרטורה של כל פתרונות העבודה והמדיה ל- 19 °C (70 °F) ממש לפני השימוש.
- הכנת מדיה חשיפה
הערה: שלב זה צריך להיעשות תחת מכסה המנוע האדים בתנאים אספטיים וסטריליים.- הכן L15/ex על ידי ערבוב 6.8 מ"ל של תמיסה מלח A (שלב 2.3.1), 1.14 מ"ל של B (שלב 2.3.2), 5 מ"ל של C (שלב 2.3.3) ו 1.14 מ"ל כל אחד פירובט (שלב 2.3.6) וגלקטוז (שלב 2.3.7). האיפור את הנפח עד 100 מ"ל באמצעות מים מזוקקים סטריליים ברמת תא.
- הכן FW על ידי ערבוב 6.8 מ"ל של תמיסה מלח A (2.3.1), 4.14 מ"ל של B (2.3.2), 5 מ"ל של C (2.3.3), 2.5 מ"ל של D (2.3.4), 1.5 מ"ל של E (2.3.5) ו-1.14 מ"ל כל אחד של פירובט (2.3.6) וגלקטוז (2.3.7). האיפור את הנפח עד 100 מ"ל באמצעות מים מזוקקים סטריליים ברמת תרבית התא.
- לכמת את ריכוזי היונים במדיה החשיפה באמצעות ICP-MS כמתואר במקום אחר12.
הערה: ריכוזים יוניים שנותחו בהכנות התקשורת מוצגים בטבלה 2.
- אבץ (65Zn) זרם תוחם
- זרעו את תאי RTgutGC על לוחות של 24 בארות (5 x 104 תאים/באר) במדיום L15/FBS מלא.
- דגירה במשך 48 שעות באינקובטור עם אווירה נורמלית ב 19 °C (50 °F).
- התאם את כל ההכנות למדיה הניסיונית ל- pH 7.4 באמצעות 0.5 M NaOH בנוכחות או היעדר L-מתיאונין (L-Met) או DL-מתיאונין (DL-Met) בריכוז של 2 מ"מ.
הערה: התאמת ה- pH של המאגרים המתוארים ב- 3.4.3 צריכה להיעשות טרי לפני הטיפול בתאים בשלב 3.4.5. - לאחר סיום תקופת הדגירה, להסיר את המדיום מן הבארות, ולשטוף ביסודיות עם PBS.
- הוסף את המדיה הניסיונית FW המותאמת ל- pH, ואפשר התאקלמות למשך 20 דקות.
- לחשוף את תאי RTgutGC לריכוזים נומינליים של 3.07, 6.14, 12.27 ו 24.55 μM 65Zn(II) (כמו ZnCl2; ~ 4 kBq / mL) בתקשורת המתוארת בשלב 3.4.3.
- מיד לאחר מכן, לשמור על התאים באינקובטור ב 19 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
- לאחר 15 דקות הדגירה נגמר, לשאוף את התרבות supernatant ולהסיר מן הבאר.
- לשטוף את התאים עם בינוני FW קר כקרח (עם 200 μM Zn, pH 7.4) ולאחר מכן להרוות על ידי הוספת 5 mM אתילן גליקול-ביס (β-aminoethyl אתר)-N,N,N,N,N'-N'-חומצה טטראקטית (pH 7.4) במשך 5 דקות, כדי להיפטר מכל ספיח 65Zn(II).
- לחשוף את התאים לתכשירים התקשורתיים לעיל בנוכחות או היעדר של 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptane-2-קרבוקסילי (BCH), מעכב הובלת חומצות אמינו.
- לאחר תקופת החשיפה של 15 דקות, חזור על שלבים 3.4.8 ו- 3.4.9.
- תאי RtgutGC יידבקו בתחתית הבארות כמו monolayer. לעכל את התאים באמצעות 0.2% נתרן חם דודסיל סולפט (SDS) דטרגנט (100 μL/ well).
הערה: פתרון SDS צריך להיות ממוקם במשך 1 שעה באמבט מים להגדיר 90 °C (70 °F) לפני השימוש. - לשאוף ולשחזר את התא לעכל לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- מדוד רדיואקטיביות של עיכול התא באמצעות מונה גמא.
הערה: יש לתקן את הספירה לדקה (cpm) עבור ריקבון רדיואקטיבי, פעילות רקע והם כפופים לחישובי פעילות ספציפיים בעקבות הנוסחה המתוארת על ידי גלובר והוגסטרנד13. - כדי לכמת את ריכוז החלבון של התאים, הומוגניזציה התאים עם 500 μL של 0.5 M NaOH.
- השתמש בערכת בדיקה של ברדפורד כדי למדוד את ריכוז החלבון בדגימת התא, עם אלבומין בסרום בקר (BSA) כסטנדרט.
הערה: לאחר ריכוז החלבון הוא כימות, קצב ספיגת Zn על ידי תאי RTgutGC יכול לבוא לידי ביטוי כמו pmoles Zn min-1 מ"ג-1 חלבון.
4. זמינות לכאורה של Zn תזונתי בסלמון אטלנטי(משכורת סלמו)
הערה: הזנות הסלמון האטלנטי פותחו על בסיס הזנות מסחריות, המכילות מקורות חלבון בעיקר מרכיבים צמחיים (כלומר, כ-5% חלבון דגים, 10% שמן דגים, 68% חלבון על בסיס צמחי ו-12% שמן צמחי). שתי הזנות נוספו עם מקור אנאורגני (Zn sulphate) או מקור אורגני (Zn chelate של גליצין) כדי להשיג ריכוז Zn של 150 מ"ג/ קילוגרם של הזנה. בנוסף, תחמוצת Yttrium (כיתה הזנה) נוספה להאכיל ב 0.01% כסמן אינרטי כדי לאפשר חישוב של מקדם זמינות לכאורה.
- התאקלמו את הסלמון האטלנטי (זן SalmoBreed, גיל 1 + שנים, קבוצות מין מעורב) במיכלים שלהם בהתאמה עד שהדגים רגילים לתנאי הניסוי.
- להעריך את ההתאקלמות של סלמון אטלנטי על ידי ניטור צריכת ההזנה היומית שלהם.
הערה: ניסוי זה בוצע בטנקים משולשים, ולכן נעשה שימוש בסך הכל בשישה טנקים. במהלך ניסוי ההאכלה טמפרטורת המים הייתה 11.9 ± 0.3 מעלות צלזיוס ורוויה חמצן מומס היה 101 ± 5%. - להאכיל את הדגים עם הזנות ניסיוניות במשך 11 ימים.
- המתת חסד את הדג על ידי מנת יתר באמצעות 6 מ"ל של פתרון מלאי מתנסולפונט טריקאין לליטר מים.
- לאסוף מדגם מדומה של צואה מן הדג מאותו טנק לתוך צלחת על ידי פסים מן הסנפיר הגחון לפי הטבעת.
- הסר את הצואה מהצלחת עם מרית לתוך צינור חרוט 50 מ"ל ומיד לאחסן את הדגימות ב -20 °C (50 °F).
הערה: הדגימות נשמרו ב -20 °C (50 °F) עד לניתוח נוסף. - להקפיא יבש את דגימות הצואה עבור 72 שעות ב -80 °C (80 °F).
- באופן ידני הומוגניזציה ידנית מדגם הצואה לאבקה דקה באמצעות עלה ומלט.
- לקבוע את הריכוז של Zn ו Yttrium בדגימות הזנה וצואה באמצעות ICP-MS (כמתואר במקום אחר9).
- קבע מקדם זמינות לכאורה (AAC, %) באמצעות הנוסחה הבאה:
Representative Results
הערכה של מינים כימיים Zn בשבר המסיס של הזנת סלמון אטלנטית באמצעות שיטת SEC-ICP-MS
שיטת SEC-ICP-MS מספקת נתונים על המינים הכימיים של Zn שנמצאו בחלק המסיס של הזנת הסלמון האטלנטי. איור 4 ממחיש את הפרופיל הכרומטוגרפי של Zn שנמצא בשבר המסיס. כרומטוגרמה זו הושגה בשיטת SEC-ICP-MS. חמישה Zn המכילים פסגות נמצאו בחלקים המסיסים של הזנת הסלמון האטלנטי. לכל פסגה משקל מולקולרי שונה; שיא ראשון (~ 600 kDa), שיא שני ושיא שלוש (מ 32 ל 17 kDa), שיא ארבע (מ 17 ל 1.36 kDa) ושיא חמש (> 1.36 kDa). שיא ארבע היה הנפוץ ביותר, ואחריו שיא שתיים, שלוש, חמש ואחת, בהתאמה. למינים הכימיים Zn שנמצאו בשבר המסיס יכולים להיות מקורות שונים מכיוון שההזנה המשמשת מכילה מרכיבים ימיים ועל בסיס צמחי, וצורה משלימה (כלומר, Zn sulphate). טווח המשקל המולקולרי של המינים הכימיים Zn הציע כי תרכובות אלה עשויים להיות metalloproteins.
מסיסות במבחנה של Zn בתוספת להאכיל סלמון אטלנטי
מסיסות של תוספת 65Zn גדל בנוכחות חומצות אמינו. כל חומצות האמינו שנבדקו הגדילו את המסיסות של תוספת 65Zn. מת'יונין, גליצין, ציסטאין, היסטידין וליצין משופר 65מסיסות Zn; מסיסות גבוהה יותר נמצאה עם היסטידין וליסין(איור 5).
הערכה של ספיגת מיני Zn באמצעות מודל מעיים במבחנה (RTgutGC)
ספיגת אבץ אפית בתאי RTgutGC הושפעה באופן משמעותי מנוכחות של L-Met או DL-Met בריכוזים של 2 מ"מ. יתר על כן, ההשפעה של מתיונין על ספיגת Zn בתאי RTgutGC הושפעה לרעה מנוכחות של BCH (חוסם מערכת הובלת חומצות אמינו), בהשוואה לתאים שאינם מטופלים עם BCH (איור 6).
זמינות לכאורה של Zn תזונתי בסלמון אטלנטי(משכורת סלמו)
בהזנות מעשיות עבור סלמון אטלנטי, זמינות Zn לכאורה היה זהה כאשר שכשהם עם מקור אנאורגני (Zn סולפט) או מקור אורגני (Zn chelate של גליצין). הערכים המשוערים לזמינות לכאורה של Zn (%, n = 3) בסלמון אטלנטי היו 31% ± 12% בעת שכשהם עם מקור אנאורגני (Zn sulphate) ו 31% ± 3% בעת שכשהם מקור אורגני (Zn chelate של גליצין).
איור 1: סיכום הגישה השיטתית להערכת זמינות המינרלים בשיטות משלימות. גישה זו שימשה לחקר זמינות אבץ בסלמון האטלנטי, כולל דגימת Zn, מסיסות Zn בסביבת מעיים, ספיגת Zn על ידי תאי מעיים וזמינות לכאורה Zn. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סיכום ההליך לחילוץ Zn מדגימת הזנה. אבץ מופק מדגימת הזנה בתנאי מיצוי קלים. החילוץ מלווה בניתוח דגימת Zn. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמה לתאי RTgutGC 1 שעות (משמאל) ושבוע אחד (מימין) לאחר זריעת צלוחיות תרבית התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כרומטוגרמה המציגה את הפסגות המכילות Zn מהשבר המסיס של הזנת הסלמון האטלנטי ונותחה על ידי SEC-ICP-MS. שלושת המשכפלים מאופיינים בקווים הכחולים, האדומים והשחורים. כיול משקל מולקולרי בוצע באמצעות תירוגלובולין (660 kDa, ניטור 127I), Zn/ Cu סופראוקסיד דיסמוטאז (32 kDa, ניטור 66Zn), מיוגלובין (17 kDa, ניטור 57Fe), ויטמין B12 (1.36 kDa, ניטור 59Co); שיא 1 (P1): ~ 600 kDa, זמן שמירה (RT) 8.2 דקות; שיא 2+3 (P2+3): מ 32 עד 17 kDa, RT 14.2 + 15.3 דקות; שיא 4 (P4): מ 17 ל 1.36 kDa, RT 16.3 דקות; שיא 5 (P5): > 1.36 kDa, Rt 23.2 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ההשפעה של חומצות אמינו על מסיסות במבחנה של Zn בתוספת להאכיל סלמון אטלנטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). הנתונים נותחו באמצעות ANOVA בכיוון אחד, ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Dunnet, השוואת הממוצע של כל קבוצת AA עם זה של קבוצת ביקורת (ללא AA). כוכביות מציינות את רמת המשמעות של ANOVA (ערכי P < 0.05 (*), < 0.01 (**), < 0.001 (***) ו- < 0.0001 (****)). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השפעת מתיונין ומעכב הובלת חומצות אמינו (2-אמינוביציקלו [2.2.1] חומצה הפטן-2-קרבוקסילית, BCH, 10 מ"ר). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). הנתונים נותחו באמצעות ANOVA דו כיווני, ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טוקי עם רמת < 0.05 של משמעות. הבדלים לאחר ההוקי בין קבוצות מיוצגים כאות עילית מעל הפסים; פסים עם כתב עילי שונים שונים סטטיסטית (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הגדרות HPLC | |
| עמודה | עמודת SEC (30 ס"מ x 7.8 מ"מ, גודל חלקיקים של 5 מיקרומטר) + עמודת שמירה (גודל חלקיקי מיקרומטר 7 מיקרומטר) |
| טווח כיול | 1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da |
| שלב נייד | 50 מ"מ טריס-HCl + 3% MeOH (pH 7.5) |
| קצב זרימה | 0.7 מ"ל דקה−1 |
| נפח הזרקה | 50 μL |
| הגדרות ICP-MS | |
| עוצמה קדימה | 1550 ואט |
| זרימת גז פלזמה | 15.0 ליטר דקה−1 |
| זרימת גז נושאת | 0.86 ליטר דקה−1 |
| זרימת גז איפור | 0.34 ליטר דקה−1 |
| זמן השתהות | 0.1 s לכל איזוטופ |
| איזוטופים מנוטרים | 127 אני, 66Zn, 59Co, 57Fe |
טבלה 1. מבט כולל על הגדרות המכשיר עבור HPLC ו- ICP-MS.
| הרכב כימי (mM) | L15/ex | מדיום ניסיוני (L15/FW) |
| נתרן חנקתי | 155 | 155 |
| אשלגן חנקתי | 6.2 | 6.2 |
| מגנזיום גופרתי | 3.8 | 19.5 |
| סידן חנקתי | 1.5 | 5.4 |
| HEPES | 5 | 5 |
| מגנזיום כלוריד | - | 15 |
| נתרן פירובט | 5.7 | 5.7 |
| גלקטוז | 5.7 | 5.7 |
| pH | 7.1 | 7.4 |
| חוזק יוני | 178 | 258 |
| הרכב יוני (mM) | ||
| סידן, Ca2+ * | 1.6 ± 0.1 | 5.3 ± 0.2 |
| מגנזיום, מ"ג2+ * | 3.9 ± 0.3 | 32.5 ± 0.7 |
| אשלגן, K+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| נתרן, נה+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| חנקתי,מס' 3- ** | 164 | 172.4 |
| סולפט, כך4- ** | 3.8 | 18.7 |
| כלוריד, קל- ** | 1.5 | 31.5 |
טבלה 2. ההרכב הכימי והאיוני של המדיה הניסיונית נבדק.
Discussion
ספיגת המעיים של Zn נראה מושפע על ידי הצורה הכימית של מיני Zn13. בהקשר זה, השימוש בפרוטוקולים המתוארים במאמר זה אפשר לחקור ברצף את ההיבטים הכימיים והביולוגיים שבבסוד 'הזמינות' של Zn בסלמון אטלנטי.
מחקר זה דיווח על שימוש בשיטת ניתוח דגימת Zn. שיטת SEC-ICP-MS סיפקה נתונים איכותיים לגבי המשקל המולקולרי של מינים כימיים Zn נוכח בשבר המסיס של הזנת סלמון אטלנטית. זה הושג בהשוואה לזמני השמירה של תקני כיול המשקל המולקולרי (כלומר, תירוגלובולין (660 kDa), Zn/ Cu סופראוקסיד דיסמוטאז (32 kDa), מיוגלובין (17 kDa) וויטמין B12 (1.36 kDa)) עם זמני השמירה של Zn המכיל פסגות. אתגר שנמצא בניתוח דגימת Zn היה זיהוי המינים הכימיים הלא ידועים של Zn בשל היעדר סטנדרטים אנליטיים. ב- SEC, ההפרדה בין המולקולות מבוססת על גודלן ביחס לנקבוביות בשלב הנייח. באופן עקרוני, מולקולות גדולות יותר יסעו מהר יותר, תחילה, ומולקולות קטנות יותר יסעו לאט יותר, ויעברו מאוחר יותר14. כתוצאה מכך, כל Zn המכיל שיא עשוי להכיל מספר תרכובות עם משקל מולקולרי דומה15. זה גם תורם לאתגר של זיהוי מינים כימיים Zn לא ידועים. יתר על כן, מספר תנאי מיצוי קל נבדקו להפקת Zn. Zn שחולץ היה נמוך (~ 10%). תנאי מיצוי קל הוחלו כדי לשמור על המין הכימי Zn שלם אבל זה אולי פגע יעילות החילוץ7.
בבדיקת המסיסות במבחנה, המסיסות של Zn בתוספת (כמו איזוטופ רדיו 65ZnCl2) ציין כי חומצות אמינו, במיוחד היסטידין וליסין, הגדיל את המסיסות של Zn (איור 5). באמצעות דגימות הזנה ישירות עבור מבינוי מסיסות תחת תנאים מדומים במערכת העיכול מבוסס על הידיעה כי שינוי ב speciation Zn הוא תלוי pH16. עם זאת, תנאים חומציים בתחילת מערכת העיכול, עלול לגרום לשינוי מסוים speciation אשר עשוי להיות בלתי הפיך (למשל, ZnO -> ZnCl2, בנוכחות HCl בתנאים חומציים בקיבה). עם זאת, מקור Zn המשמש כאן הוא ZnSO4 ואת המסיסות של אשר שופרה על ידי חומצות אמינו במדיום. השאלה הבאה שיש לענות עליה הייתה, האם ניתן לתרגם את המסיסות המוגברת לזמינות? קו תאי המעיים RTgutGC שימש כדי ללמוד את השאלה הזאת. בהקשר של תזונה מינרלית בבעלי חיים, קשה להגדיר את המונח 'זמינות' וניתן להסדיר אותו באופן דיפרנציאלי בתאים (במבחנה) בהשוואה לחיה (in vivo). לפיכך, המונח 'ספיגה' שימש כשמדובר בהערכת במבחנה באמצעות קו תאי מעיים. קו התא סיפק מידע שימושי על מנגנוני ספיגת Zn באפיתל המעי המהווה חלק מהתהליך הרגולטורי המורכב השולט בזמינות המינרלים בבעלי חיים. תאי RTgutGC עוררו יכולת טובה יותר לספיגה אפית של Zn בנוכחות חומצת אמינו (כלומר, מת'יונין; איור 6). עם זאת, הזמינות לכאורה ב vivo לא היה שונה באופן משמעותי בין מקורות Zn אורגניים בסלמון אטלנטי. במחקר זמינות in vivo, השוואת מקור Zn נעשתה ברמות Zn תזונתיים הרבה מעבר לדרישות Zn הידועות של סלמון אטלנטי17, ריכוז Zn הכולל של 150 מ"ג / קילוגרם להאכיל. ההבדלים בזמינות דמיינו טוב יותר כאשר רמות התזונה שנבדקו נופלות בטווח הדינמי הליניארי לפני שבעל החיים מגיע לרוויה. במחקר הנוכחי של vivo, ייתכן כי הסלמון האטלנטי היו רוויים היטב להבדל נצפה בספיגת Zn בין מקורות המשמשים.
לסיכום, השיטה הראשונה סיפקה מידע איכותי לגבי מינים כימיים שונים של Zn שנמצאו בחלק המסיס של הזנת סלמון אטלנטית; השיטה השנייה, מסיסות במבחנה של Zn בתוספת שופר בנוכחות ליגנדים חומצת אמינו; השיטה השלישית אישרה כי מסיסות משופרת על ידי חומצות אמינו יכול לשפר את ספיגת אפיתל המעי; לעומת זאת, השיטה הרביעית לא הצליחה למצוא הבדלים בזמינות של Zn ממקור אנאורגני או אורגני לסלמון אטלנטי. לסיכום, אם כי לא עולה בקנה אחד עם ממצאי in vivo, פרוטוקולי אין ויטרו סיפקו תובנות מעניינות להבנת המרכיבים השונים של זמינות Zn.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו בוצעה במסגרת פרויקט APREMIA (זמינות ודרישה לכאורה של מינרלים בסלמון אטלנטי, מענק מס '244490) במימון מועצת המחקר הנורבגית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
