Summary
المعروض هنا هو بروتوكول الأمثل لعزل ، والزراعة ، ونقل ، والتفريق بين الخلايا الاساسيه البشرية من الافراد المصابين بالفيروس والضوابط الصحية.
Abstract
ولا يزال فيروس نقص المناعة البشرية أحد الشواغل الصحية الرئيسية علي الرغم من إدخال العلاج المضاد للفيروسات العكوسه في منتصف التسعينيات من القرن العشرين. في حين ان العلاج المضاد للفيروسات الرجعية يخفض بكفاءة الحمل الفيروسي الجهازي ويستعيد العد الطبيعي للخلاياالتائية ، فانه لا يعيد تشكيل جهاز مناعي وظيفي تماما. يمكن ان يتميز جهاز المناعة المختل في الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق بالتنشيط المناعي ، والشيخوخة المبكرة للخلايا المناعية ، أو التهاب المستمر. وتضيف هذه الشروط ، إلى جانب العوامل المصاحبة للاصابه بالفيروس ، تعقيدا إلى المرض ، الذي لا يمكن استنساخه بسهوله في النماذج الخلوية والحيوانية. للتحقيق في الاحداث الجزيئية الكامنة وراء الخلل المناعي في هؤلاء المرضي ، يتم عرض نظام للثقافة والتلاعب بالخلايا الوحيدة الاساسيه البشرية في المختبر هنا. وعلي وجه التحديد ، يسمح البروتوكول للثقافة والانتقال من CD14 الابتدائية + مونوسيدات التي تم الحصول عليها من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب الذين يخضعون لعربه التسوق وكذلك من الضوابط السلبية لفيروس نقص المناعة المكتسب. وتشمل هذه الطريقة العزلة والثقافة والانتقال من الخلايا الاحاديه والضامة المشتقة من البويضات. في حين يتم استخدام مجموعات المتاحة تجاريا والكواشف, البروتوكول يوفر نصائح هامه والظروف المثلي للانضمام الناجحة والانتقال من الخلايا الاحاديه مع محاكاة ميرنا ومثبطات وكذلك مع siRNAs.
Introduction
تسبب عدوي فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1) خللا مناعيا شديدا ، وهو ما يمكن ان يؤدي إلى الاصابه بالعدوى الانتهازية ومتلازمة عوز المناعة المكتسب (الإيدز). علي الرغم من ان المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة التي تمر بالعربة تتميز الأحمال الفيروسية المنخفضة والعد العادية الخلايا التائية + T ، ويمكن المساس بأداء الجهاز المناعي في هؤلاء الافراد ، مما يؤدي إلى استجابه مناعية مختلة التي ارتبطت بزيادة خطر الاصابه بالسرطان1 أليات الخلل المناعي في مرضي فيروس نقص المناعة الذاتية علي السلة لا تزال غير معروفه إلى حد كبير. ولذلك ، فان توصيف الخلايا المناعية المستمدة من المريض والتحقيق في علم الاحياء والوظيفة عنصر حاسم في البحوث الحالية بفيروس نقص المناعة المكتسب.
الخلايا الاحاديه والضامة هي المنظمين الرئيسيين للاستجابات المناعية وتلعب أدوارا أساسيه في الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية2,3,4,5. غير متجانسة والبلاستيك في الطبيعة ، ويمكن تصنيف الضامة علي نطاق واسع في تنشيط كلاسيكي (M1) أو بدلا من ذلك تنشيط (M2). في حين ان هذا التصنيف العام ضروري عند اعداد الشروط التجريبية ، قد يتم عكس حاله الاستقطاب من الضامة من قبل مجموعه متنوعة من السايتوكينات6،7،8،9. علي الرغم من ان العديد من الدراسات قد حققت في اثار الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية علي الخلايا الاحاديه والجذعية ، والتفاصيل الجزيئية للاستجابات بوساطة البويضات غير معروفه إلى حد كبير6،7،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19 من بين العوامل التي تنطوي عليها تنظيم الخلايا المناعية ووظيفتها ، ميكرورناس (miRNAs) ، قصيرة غير الترميز RNAs ان ما بعد الهيستونات تنظيم التعبير الجيني ، وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في سياق المسارات الخلوية الرئيسية (اي النمو ، والتمايز ، والتنمية ، والمبرمج)20. وقد وصفت هذه الجزيئات بأنها منظمات هامه من عوامل النسخ الاساسيه لإملاء الاستقطاب وظيفية من الضامة21. وقد تم التحقيق في الدور المحتمل لmirnas في الخلايا الاحاديه من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق ، ولكن التقدم في هذا المجال يتطلب المزيد من العمل22،23،24،25،26. تناقش هذه الورقة طريقه محسنه لتحويل miRNAs و siRNAs إلى خلايا بشريه أساسيه من المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية والضوابط.
يعتمد هذا البروتوكول علي الكواشف ومجموعات المواد المتاحة تجاريا ، لان الاستمرارية في الإجراءات التقنية تساعد علي أزاله المتغيرات التجريبية غير الضرورية عند العمل مع العينات السريرية. ومع ذلك ، فان الطريقة توفر نصائح هامه (اي عدد الخلايا المطلية أو الحاضنة القصيرة مع وسائل الاعلام الخالية من المصل لتعزيز التصاق الخلايا بالصفيحة). الاضافه إلى ذلك ، فان شروط الاستقطاب المستخدمة في هذا البروتوكول مستمده من الاعمال المنشورة27و28و29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع الطرق الموضحة أدناه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمركز نيو اورليانز للعلوم الصحية بجامعه ولاية لويزيانا. تم جمع جميع الدم بعد الحصول علي موافقه مستنيرة.
ملاحظه: يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في ظل ظروف معقمه في مرفق مستوي السلامة الاحيائيه 2 (BSL2) بحيث يتم استخدام الحذر للتعامل مع المواد البيولوجية. علي وجه الخصوص ، يتم تنفيذ كل خطوه باستخدام تقنيات معقمه في اطار مجلس السلامة البيولوجية. بعد كل خطوه تنطوي علي الدم أو منتجات الدم أو الخلايا أو المنتجات الخلوية ، من المهم شطف جميع المواد البلاستيكية (مثل الماصات المصلية والماصة والأنابيب) مع 10 ٪ من المبيض من حاويه نفايات داخل غطاء المحرك قبل التخلص السليم.
1-عزل الخلايا البشرية الاوليه عن طريق الاختيار السلبي المناعي
- جمع 40 مل من الدم الطازج ، الإنسان كله (من اما فيروس نقص المناعة البشرية + المريض أو السيطرة الصحية) في 4 10 ml ايثيل الصوديوم حمض (أدتا) فراغ أنابيب (10 مل من الدم في أنبوب). باستخدام تقنيات معقمه تحت خزانه السلامة الاحيائيه ، نقل جميع 40 مل من الدم إلى 1 50 مل أنابيب البروبيلين المخروطية.
- بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة لمجموعه عزل البويضات البشرية المحددة (جدول المواد) ، أضف 2 مل من كوكتيل العزلة الاحاديه الخلية ، المقدم في الطقم ، إلى أنبوب الدم. الخرز المغناطيسي دوامه ، كما قدمت في عده ، ل 30 ثانيه ، وأضافه 2 مل إلى أنبوب من الدم.
- إذا كان اقل من 40 مل من الدم هو متاح ، وتوسيع نطاق الكاشفات المضافة. لمزج المحلول ، ماصه للأعلى وللاسفل مع ماصه بلاستيكية 25 مل من البلاستيك واحتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT).
- فصل خليط الدم علي قدم المساواة في أنابيب 4 50 mL وأضافه 30 مل من الفوسفات معقمه-مخزنه المالحة (تلفزيوني) التي تحتوي علي 1 مم أدتا لكل أنبوب. امزجها بواسطة الأنابيب لاعلي ولأسفل مع ماصه بلاستيكية 25 مل.
- وضع الأنابيب في أصحاب المغناطيس لمده 10 دقيقه لأزاله الأجسام المضادة-الخرز المغناطيسي مترافق. استخدم أربعه حاملي مغناطيس في نفس الوقت ، واحد لكل أنبوب ، للسماح بأوقات الحضانة والعزل المتناسقة لكل عينه دم.
- وضع محتويات من مركز كل أنبوب ، وذلك باستخدام ماصه ، في حين انها لا تزال في أصحاب المغناطيس. يجب الحرص علي عدم وضع خلايا الدم الحمراء (لا يزيد عن 10 ٪ من حجم البداية 10 مل) ، ووضع محتويات في واحده من أربعه أنابيب جديده 50 mL.
- أضافه 500 μl من الخرز المغناطيسي فورتيكسد إلى كل أنبوب 50 mL. ماصه للأعلى والأسفل مع ماصه 25 مل واحتضان في RT لمده 5 دقائق. ثم ، وضع الأنابيب في أصحاب المغناطيس لمده 5 دقائق.
- نقل بعناية محتويات من مركز كل أنبوب في حين لا يزال في أصحاب المغناطيس في واحده من أربعه أنابيب جديده 50 mL. وضع مباشره كل أنبوب 50 mL جديده في أصحاب المغناطيس لمده 5 دقائق.
- نقل المحتويات بعناية من مركز كل أنبوب إلى واحده من أربعه أنابيب 50 mL جديده. تدور جميع أنابيب 50 ml الجديدة في 300 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق جميع الكريات الخلية الأربع في ما مجموعه 10 مل من العقيمة تلفزيوني.
- عد الخلايا بالاستبعاد الأزرق التريبين باستخدام مقياس الكريات الدموية.
ملاحظه: 8-20x 10 يتم الحصول علي الخلايا عاده من 40 مل من الدم كله.
2-زراعه البويضات البشرية الاوليه
- باستخدام حمام مياه 37 درجه مئوية ، الدافئة المصل الحرة RPMI 1640 وسائل الاعلام تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين (القلم/بكتيريا) ، و (مع الاستمرار في استخدام تقنيات معقمه تحت مجلس السلامة البيولوجية) أعاده تعليق الخلايا الوحيدة المعزولة في هذه الوسائط بتركيز 1 × 106 خليه/مل.
- أضافه 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى كل بئر من 6 لوحه جيدا أو في صحن 35 مم (يجب ان يكون العدد النهائي من الخلايا 1 × 106 خلايا/لوحه) ، ووضع في 37 درجه مئوية حاضنه مع 5 ٪ CO2. انتظر 0.5-1.0 h للخلايا للانضمام.
- باستخدام حمام المياه 37 درجه مئوية ، الساخنة الحرارة المعطلة (HI) الجنين البقري المصل (...). أضافه 100 μL (10 ٪ التركيز النهائي) لكل لوحه. أضافه عوامل النمو إلى الخلايا لتعزيز التمايز الضام.
- الضامة الرئيسية لنمط الظاهري M1 مثل عن طريق أضافه 25 نانوغرام/مل من الحبيبية-الضامة عامل تحفيز مستعمره (GM-السائل الدماغي الشوكي) لوسائل الاعلام. الضامة الرئيسية لنمط الظاهري M2 مثل باضافه 50 ng/mL من عامل تحفيز مستعمره الضامة (M-السائل الدماغي الشوكي) إلى وسائل الاعلام28.
ملاحظه: كل من GM-السائل الدماغي الشوكي و M-السائل الدماغي الشوكي تسمح التمايز أحاديه الخلية إلى النمط الظاهري الضام العام (M0) في حين فتيله الخلايا ل M1 أو M2 ، علي التوالي7،28،30.
- الضامة الرئيسية لنمط الظاهري M1 مثل عن طريق أضافه 25 نانوغرام/مل من الحبيبية-الضامة عامل تحفيز مستعمره (GM-السائل الدماغي الشوكي) لوسائل الاعلام. الضامة الرئيسية لنمط الظاهري M2 مثل باضافه 50 ng/mL من عامل تحفيز مستعمره الضامة (M-السائل الدماغي الشوكي) إلى وسائل الاعلام28.
3. إخراج البويضات البشرية الاساسيه في الثقافة
- الخلايا الاحاديه transfect مع المحاكاة ميرنا أو مثبطات أو siRNA باستخدام مجموعه تحتوي علي البوليمر القائم علي كاشف النقل (جدول المواد).
- بعد بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعه النقل (والاستمرار في استخدام تقنيات معقمه تحت مجلس السلامة البيولوجية) ، أولا تمييع المختارة ميرنا محاكاة/مثبطات أو siRNAs في العازلة إلى تركيز نهائي من 1.83 μM. اعداد 10 μL من المخفف تقليد/المثبط لكل ترانسكشن 1 × 106 خلايا.
- اعداد كاشف ترانسكشن عن طريق أضافه 1 μL من البوليمر المقدمة إلى جديد 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير ، تليها علي الفور باضافه 90 μL من المخزن المؤقت المقدمة (لإجمالي 91 μL من كاشف لكل ترانسكشن). دوامه ل 3-5 s.
- ماصه 90 μL من محلول التحويل إلى الأنبوب الذي يحتوي علي 10 μL من المخفف ميرنا تقليد/المثبط أو siRNA. اخلطه بواسطة الماصات اللطيفة والاحتضان لمده 15 دقيقه في RT.
- أضافه 100 μL من مجمع التحويل إلى بئر واحد (أو طبق) من 1 × 106 الخلايا الاحاديه مطلي. احتضان الخلايا ل 4 ح في 37 درجه مئوية ، ثم استبدال المتوسطة مع 3 مل من وسائل الاعلام الكاملة (RPMI 1640 تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين و 10 ٪ من الحرارة المعطلة التي تحتوي علي السائل الدماغي الشوكي أو الام السائل الدماغي الشوكي.
4. M1/M2 التمايز والتنشيط
- البويضات تبدا علي الفور التفريق إلى M0 واسعه الضامة علي الطلاء في الثقافة. في اليوم الثالث بعد الطلاء ، ومواصله استخدام تقنيات معقمه تحت خزانه السلامة الاحيائيه واستبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام الطازجة RMPI 1640 (تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين ، 10 ٪ من الحرارة المعطلة ، واما 25 نانوغرام/مل GM-السائل الدماغي الشوكي لتعزيز الاستقطاب مثل M1 أو 50 ثقافة الخلايا في هذه الظروف لما مجموعه 6 أيام من الطلاء الاولي في حاضنه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
- لدفع الاستقطاب من الخلايا تستعد إلى النمط الظاهري M1-الضامة ، وتنشيط الخلايا في اليوم 6 من الحضانة عن طريق استبدال وسائل الاعلام الخلية مع وسائل الاعلام الجديدة التي تحتوي علي 5 ٪ من الحرارة غير المفعلة ، 1 ٪ القلم/بكتيريا ، 100 ng/mL e. القولونيةالمشتقة (lps) ، و
- لدفع الاستقطاب من الخلايا تستعد إلى النمط الظاهري M2-الضامة ، وتنشيط الخلايا في اليوم 6 من الحضانة عن طريق استبدال وسائل الاعلام الخلية مع وسائل الاعلام الجديدة التي تحتوي علي 5 ٪ من الحرارة المعطلة ، 1 ٪ القلم/بكتيريا ، 10 نانوغرام/مل M-السائل الدماغي الشوكي ، و 20 نانوغرام/مل انتر
- بعد 24 ساعة ، حصاد الخلايا ل RNA ، البروتين ، أو تحليلات التدفق الخلوي.
- عندما تكون الخلايا جاهزه للجمع ، اغسل الخلايا في طبق 2x مع التليفزيون (في RT لاستخراج RNA أو مبرده علي الجليد لاستخراج البروتين). لان الضامة متمايزة الآن بشده تعلقت إلى اللوحات, [لرس] الخلايا في لوحات مباشره ان ينال ماده ل [رنا] وبروتين تحاليل.
- لجمع المواد لقياس التدفق الخلوي ، أضافه تلفزيوني يحتوي علي 2 مم أدتا إلى الطبق ، احتضان الخلايا لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية ، كشط بلطف الخلايا من الطبق ، وجمع المحتويات في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL قبل المضي قدما مع البروتوكولات القياسية.
5. تدفق الخلوي
- شطف الخلايا في القناات التلفزيونية لأزاله المتوسطة الخياطة. تدور أسفل 100,000 خلايا (في كل حاله تدفق الخلوية) وأعاده تعليق بيليه في 100 μL من التلفزيونية التي تحتوي علي 2 μL من المانع ملزمه HuFcR. احتضان في RT لمده 15 دقيقه.
- أضافه 50 μL من تلطيخ العازلة والأجسام المضادة المطلوبة (هنا ، CD80 ، CD83 ، CD163 ، و CD209 تم استخدامها) في المبالغ الموصي بها.
- اخلطي برفق وحضنيه عند درجه حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمده 30 دقيقه.
- غسل 2x مع تلفزيوني وأعاده تعليق الخلايا الملونة في 150 μL من النظام التلفزيوني قبل تشغيل العينة علي مقياس السيتوفلوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وباستخدام الاجراء الموصوف ، تم عزل الخلايا البشرية الاوليه من الافراد المصابين بالفيروس والمتبرعين الأصحاء. تم الحصول علي جميع البيانات المعروضة هنا من فيروس نقص المناعةالمكتسب + الموضوعات التي تخضع لعربه مع منخفضه (< 20 نسخ/مل) أو الأحمال الفيروسية غير قابل للكشف والعادية التهمالخلية + T. مباشره بعد العزلة ، كانت الخلايا ملطخه ، وتم اجراء قياس التدفق الخلوي لتاكيد نقاء الخلايا السكانية. وأظهرت النتائج ان > 97 ٪ من الخلايا الملونة ايجابيه ل CD14 (البيانات لم تظهر). لاستقطاب الضامة ، تم استخدام بروتوكول نشرت28. وقد تم استزراع الخلايا البشرية الاوليه في وجود السائل الدماغي الشوكي أو الام السائل الدماغي الشوكي لمده 6 أيام. في اليوم السادس ، تم تنشيط الخلايا باتجاه اما الضامة M1 أو M2. أربع وعشرين ساعة بعد التنشيط ، تم حصاد الخلايا وملطخه لتحليل تدفق الخلوية من علامات الخلايا الضامة.
ويبين الشكل 1 الرسوم البيانية التمثيلية لعنصر التحكم المنشط M1-(الشكل 1ا) والمستمدة من المريض (الشكل 1ب) الخلايا مع زيادة مستويات CD80 والCD83 وانخفاض مستويات CD163 بالمقارنة مع خلايا T0 غير نشطه ، فضلا عن الخلايا المنشطة M2 مع زيادة مستويات الCD163 والCD209. لوحه C في يظهر التعبير عن CD80 ، CD83 ، CD163 ، و CD209 في الخلايا المستقطبة M1 و M2. ويمثل الرسم البياني متوسط البيانات التي تم الحصول عليها من ثلاثه مجموعات من الخلايا المشتقة من الفيروس وثلاثه. كما هو متوقع ، زادت مستويات التعبير من CD80 و CD83 في M1 مقارنه بالخلايا المستقطبة M2 ، في حين ان CD209 و CD163 تم التعبير عنها بشكل كبير في M2 مقارنه بالخلايا المستقطبة M1. ومن المثير للاهتمام ، يبدو ان CD80 و CD83 يعبر عنها بشكل أكثر شده في الخلايا المستمدة من السيطرة مقارنه بالخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة المكتسب. ومع ذلك ، فان الاختلافات المحتملة في القدرة علي استقطاب و/أو التعبير عن مستويات علامات الاستقطاب في الخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة المكتسبة مقارنه بالضوابط تتطلب مزيدا من التحقيق. علي الرغم من ان GM-السائل الدماغي الشوكي, M-السائل الدماغي الشوكي, LPS, و IFN-γ تم اختيارها كعلاجات, مجموعات أخرى من عوامل النمو, السايتوكينات, أو المحفزات يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول28.
بعد التجارب الاوليه أظهرت ان إجراءات العزل كانت ناجحه ، تم طلاء الخلايا الوحيدة التي تم جمعها حديثا في 6 لوحات جيدا وتحولت مع المخلوطة ، بالقرب من الاشعه تحت الحمراء-المسمي ميرنا لتحديد كفاءه ترانسكشن. وكانت الخلايا التي تم تصويرها 24 ساعة بعد التحويل بواسطة المجهر البؤري الفلورسنت. مع هذه الطريقة ، > تم تحقيق كفاءه 90 ٪ من التحويل ، كما هو محدد من قبل تدفق الخلوي (الشكل 2ا) والمجهر البؤري (الشكل 2ب).
بعد ذلك ، تم تحديد صلاحيه الخلايا بعد الحقن. ويبين الشكل 3 مدي صلاحيه الخلايا ، التي تحدد باستخدام مقايسة قياس ألوان كمتوسط للخلايا المشتقة من مريضين (الشكل 3ا) وعنصري تحكم (الشكل 3ب) في اليوم 1 (الشكل 3ا) أو اليوم 4 (الشكل 3ب) وتحصد في اليوم 7. النسبة لهذه التجربة ، كانت 50,000 خليه مطليه علي صفيحه متعددة الآبار 96 ومقسمه بعد البروتوكول. وبصفه عامه ، فان التحويل لم يقلل بشكل كبير من قدره الخلايا علي البقاء ، بغض الرغم من مرحله نضوج الخلايا وظروف العدوى (اي ، الوهمية ، المخفوقة/ميرنا ، أو siRNA/ميرنا). وتجدر الاشاره إلى ان الشكل 3 يمثل البيانات المتحصل عليها من الخلايا المستمدة من المرضي (الفريق الف) والخلايا المستمدة من السيطرة (الفريق باء). هذا كان ضرورية, بما ان ما من خلايا كافي ان ينجز التجربة كامله (علي حد سواء جدوى ولطخه غربيه ليوم 1 و يوم 4 [ترنسفيايشن], في سته شروط مختلفه لكل [ترنسكايشن]) مع عينه وحيد استطاع كنت نلت. ومع ذلك ، فان هذا الرقم يوفر نتائج تمثيليه يمكن الحصول عليها اما باستخدام الخلايا المستمدة من السيطرة أو المرضي.
ثم ، تم تقييم فعاليه نقل siRNA علي الهدف mRNA عن طريق تقييم التعبير البروتين. وتظهر النتائج في الشكل 4 التنظيم الفعال لEIF4EBP1 ، وهو منظم انتقالي وفير جدا في هذه الخلايا ، عند الانتقال مع sirna محدده في كل من اليوم 1 (الشكل 4ا) واليوم 4 (الشكل 4ج). نفس المنظم أيضا الحفاظ علي التعبير في ظل ظروف السيطرة المختلفة (اي ، غير القابلة للتحويل ، وهميه ، وسارعت siRNA ، و EIF4EBP1 siRNA دون كاشف التحويل: سيدي *). ويبين الشكل 4(ب ) والشكل 4(د) علي التوالي القياس الكمي لتجارب اللطخه الغربية لليوم الأول واليوم الرابع. الاضافه إلى ذلك ، تم تحديد مستويات التعبير في اليوم الأول أو اليوم الرابع من قبل الخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة المكتسب (الشكل 4(ه)). وأظهرت الخلايا التي تم تحويلها مع التقليد ميرنا 48-إلى 72-اضعاف زيادة في التعبير ميرنا علي الخلايا غير المقسمة ، في حين ان جميع عناصر التحكم ترانسفيكشن تظهر اي تغييرات ملموسه.
الشكل 1: يتم استقطاب الضامة الاحاديه الخلية بنجاح وتنشيطها نحو الأنماط الظاهرية الضامة M1 أو M2. نتائج تحليل التدفق الخلوي للخلايا المشتقة من عنصر تحكم صحي واحد (A) وعينه خليه واحده مشتقه من فيروس نقص المناعة المكتسب (B) تظهر مستويات CD80 و CD83 و CD163 و CD209. وتكررت التجربة بوجود عنصري تحكم إضافيين وعينين إضافيتين من الإصابات الايجابيه بالفيروس مع نتائج مماثله. وكانت بوابات السكان من الفائدة علي أساس من الامام والمعلمات مبعثر الجانب ، تليها التمييز صدر. (ج) رسم بياني شريطي يبين CD80 ، CD83 ، CD163 ، و CD209 في الخلايا المستقطبة M1 و M2. يمثل الرسم البياني متوسط البيانات والانحرافات القياسية التي تم الحصول عليها من ثلاثه تحكم-(Ctrl) وثلاث مجموعات من الخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة المكتسب (القرش). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يتم تحويل الخلايا الاساسيهCD14 + البشرية بكفاءة مع mirnas. (ا) تحليل تدفق الخلايا الخلوية الاساسيه المستمدة من الضوابط الصحية ، 24 ساعة بعد التحويل ، وتبين > 90 ٪ كفاءه التحويل. (ب) الصورة المنسقة التمثيلية التي اتخذت 24 ساعة بعد التحويل تبين ان جميع الخلايا في الحقل تعبر عن ميرنا مترافق مع صبغه الاشعه تحت الحمراء القريبة (باللون الأبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قابليه الخلايا الناقلة للاستمرار. وتمثل أشرطه الرسم البياني متوسط القدرة الخلوية لاثنين من فيروس نقص المناعةالذاتية + المرضي (A) واثنين من الضوابط الصحية (ب) تحديد باستخدام المقايسة اللونية ، بعد التحويل مع مير-146 ا-5P أو siRNA إلى EIF4EBP1 (sirna) والضوابط المناسبة في اليوم 1 (ا) أو يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التنظيم الفعال لمستويات البروتين عند انتقال العدوى من سيرنا/ميرنا بعد عزلCD14 + مونوسيدات. وكانت الخلايا الاحاديه التي تستمد من السيطرة وفيروس نقص المناعة المكتسب (1 x 106 زنزانات) مقسمه في اليوم 1 (ا) أو اليوم 4 (ج) بعد العزلة باستخدام sirna ضد EIF4EBP1 mrna. اللوحات (ب) و (د) تمثل التقدير الكمي لتعبير EIF4EBP1 مقارنه بالفجوة الخارجية ويعبر عنها بأنها النسبة المئوية للمريض (Pt) أو التحكم (Ctrl) (A) أو غير المحولة للمريض أو المتحكم (ب). (ه) رسم بياني لشريط تمثيلي لتجربتين تظهران تعبير مير-146 الف-5 ف في الخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة المكتسبة في اليوم 4 (القضبان 1-4) أو اليوم الأول (الشريط الأيمن) ويتم حصادهما في اليوم السابع. يتم احتساب التغيير اضعاف علي العينة غير المتحولة (سيدي = siRNA). سيدي * أو مير-145a-5p * تشير الحضانة من الخلايا مع siRNA أو مير-146 ا-5p دون الكاشف ترانسفيكشن. وكررت التجربة 2x مع الخلايا المستمدة من السيطرة وأنتجت أساسا نفس النتائج (البيانات لم تظهر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويبين البروتوكول المعروض استخدام الخلايا الاوليه من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية كنموذج لدراسة البويضات والضامات. فيروس نقص المناعة الذاتية + المرضي الذين يخضعون لعربه العيش مع العدوى لسنوات متعددة ، ويمكن أيضا ان يكون لها آخر العدوى المشتركة ذات الصلة جهاز المناعة للخطر. لدراسة المناعة في وجود العدوى المزمنة بالفيروس ، تم حصاد الخلايا من المرضي مباشره. كما أظهرت miRNAs للعب ادوار رئيسيه في تطوير الخلايا والتمايز ، ويركز البروتوكول علي القدرة علي التلاعب التعبير ميرنا في هذه الخلايا الاساسيه (الشكل2، الشكل 3، الشكل 4). باستخدام نفس الاجراء ، يعمل هذا البروتوكول أيضا بشكل جيد جدا ل siRNAs (الشكل 3، الشكل 4). ونظرا للنشاط المحتمل للفاخرين من الضامة الناضجة ، بالاضافه إلى الضوابط الوهمية والتدافع siRNA ، يتم استخدام عنصر تحكم (يشار اليه باسم السير * أو مير * في الشكل 3 والشكل 4) ، حيث يتم حذف الكاشف العابر. تؤكد البيانات ان الكاشف ترانسكشن مطلوب للتسليم السليم siRNA/ميرنا في الخلايا ، كما بدون كاشف ، الخلايا لا تمتص تلقائيا ميرنا أو siRNA ، حتى عندما يتم تمييزها بالفعل في الضامة (اليوم 4 بعد الطلاء والاستقطاب ، الشكل 3 والشكل 4).
اثناء استخدام مجموعات المتاحة تجاريا للعزل والنقل من الإنسان الاساسيهCD14 + مونوسيدات ، هناك خطوات الرئيسية الأمثل لجعل الاجراء استنساخه وناجحه. علي وجه التحديد ، 1) عدد من الخلايا مطلي أمر بالغ الاهميه لبقاءهم والتمايز ، وتم العثور علي 1 × 106 خلايا/35 ملم طبق للعمل بشكل أفضل. 2) الCD14 المعزولةالطازجة + الخلايا لا نعلق بشكل موحد علي طبق الثقافة إذا المصنفة في وجود القوات الخاصة. ونتيجة لذلك ، عند استبدال المتوسطة 4 ح بعد التحويل ، سيتم أزاله جميع الخلايا غير المرفقة ، مما يجعل من لوحه إلى لوحه الظروف متغير للغاية. 3) تم العثور علي ان استبدال المتوسطة 4 ح الانتقال التالية ، ويقلل من سميه بسبب نقل الكواشف في حين لا تؤثر علي كفاءه النقل. 4) تم تحسين ظروف التحويل لتتطلب اقل siRNA أو ميرنا (15 نانومتر) من التركيزات الموصي بها من قبل الشركة المصنعة (25 نانومتر). 5) نظرا لطبيعة ملتصقة للغاية من الخلايا ، مضيفا تحلل العازلة مباشره إلى لوحه يحسن كثيرا من تركيز البروتينات أو الحمض الريبي النيبالي المقطوع. ومع ذلك ، إذا كان من الضروري أزاله الخلايا من لوحه (علي سبيل المثال ، لتحليل تدفق الخلوي) ، فمن الأفضل لاستخدام تلفزيوني مع أدتا وكشط بلطف الخلايا. هذا الأسلوب يقلل من عدد الخلايا التي تم جمعها من قبل ما يقرب من 20 ٪-30 ٪ ، لذلك من المهم تخطيط التجارب وفقا لذلك للحصول علي عدد كاف من الخلايا لمزيد من التحليل.
عندما يتبع بشكل صحيح ، وهذا الاجراء يدل علي الحصول علي CD14 نقيهللغاية + السكان من الخلايا الاحاديه ، انتقال من sirnas والصغيرة Rnas مثل mirnas ، والظروف الثقافية ، والتمايز في M1 أو M2 الضامة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة الامراض المعقدة أو الإصابات الأخرى غير الفيروس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون ان يشكروا فيروس نقص المناعة البيولوجية/الأورام الحيوية النواة لتوفير عينات المريض والنواة الأيض المناعة الخلوية لتوفير تحليل تدفق الخلوي. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة P20GM121288 و P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
