Summary
여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.
Abstract
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 1990 년대 중반에 결합 된 항 레트로 바이러스 치료 (cART)의 도입에도 불구하고 주요 건강 관심사로 남아 있습니다. 항레트로바이러스 요법은 전신 바이러스 부하를 효율적으로 낮추고 정상적인 CD4+ T 세포 수를 회복시키지만 완전히 기능적인 면역 체계를 재구성하지는 않습니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에 있는 역기능 면역 계통은 면역 성 활성화, 면역 세포의 조기 노화, 또는 지속적인 염증에 의해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 조건은 HIV 감염과 관련된 comorbid 요인과 함께 세포 및 동물 모델에서 쉽게 재현 할 수없는 질병에 복잡성을 추가합니다. 이 환자에 있는 면역 기능 장애의 근본적인 분자 사건을 조사하기 위하여는, 시험관에서 인간 1 차적인 단핵구를 문화로 조작하는 체계는 여기에서 제시됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 HIV 음성 대조군뿐만 아니라 CART를 받은 HIV 감염 개인으로부터 얻은 1차 CD14+ 단핵구의 배양 및 형질감염을 허용한다. 이 방법은 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포의 격리, 배양 및 형질취득을 포함합니다. 시판되는 키트와 시약이 사용되는 동안, 프로토콜은 miRNA 모방 및 억제제뿐만 아니라 siRNAs와 단핵구의 성공적인 준수 및 형질감염을위한 중요한 팁과 최적화 된 조건을 제공합니다.
Introduction
인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1) 감염은 기회 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)으로 이어질 수있는 심각한 면역 기능 장애를 유발합니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염 환자는 낮은 바이러스 하중 및 일반적인 CD4+ T 세포 수에 의해 특징지더라도, 면역 계통의 기능은 암 발전의 증가한 리스크에 연결되는 역기능 면역 반응으로 이끌어 내는 이 개별에서 손상될 수 있습니다1. cART에 HIV 환자에 있는 면역 기능 장애의 기계장치는 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서 환자 유래 면역 세포를 특성화하고 생물학 및 기능을 조사하는 것이 현재 HIV 연구의 중요한 구성 요소입니다.
단핵구와 대식세포는 면역 반응의 주요 조절자이며 HIV 감염2,3,4,5에서근본적인 역할을 합니다. 본질적으로 이질성 및 플라스틱, 대식세포는 고전적으로 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화(M2)로 광범위하게 분류될 수 있다. 이러한 일반적인 분류는 실험 조건을 설정할 때 필요하지만, 대식세포의 편광 상태는다양한사이토카인6,7,8,9에의해 역전될 수 있다. 여러 연구가 단핵구와 수지상 세포에 대한 HIV 감염의 영향을 조사했지만, 단핵구 매개 반응의 분자 세부 사항은 크게 알려지지 않은6,7, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 면역 세포 조절 및 기능에 관여하는 인자 들 중에서, microRNAs (miRNAs), 유전자 발현 후 전사적으로 조절되는 짧은 비코딩 RNA는, 주요 세포 경로의 맥락에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (즉, 성장, 분화, 개발, 및 세포 자멸)20. 이들 분자는대식세포(21)의기능적 편광을 지시하는 데 필수적인 전사 인자의 중요한 조절자로 기술되었다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에서 단핵구에 있는 miRNAs의 잠재적인 역할은 조사되었습니다, 그러나 필드에 있는 진행은22,23,24,25,26를훨씬 더 필요로 합니다 . 이 논문에서는 HIV 에 감염된 환자 및 대조군으로부터 1차 인간 단핵구로 miRNAs 및 siRNAs를 트랜스펙트하는 최적화된 방법에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 시판되는 시약과 키트에 의존하며, 기술 절차의 연속성은 임상 샘플로 작업할 때 불필요한 실험 변수를 제거하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 중요한 팁(즉, 플레이트에 대한 세포의 순착을 촉진하기 위해 무혈청 매체로 도금된 세포 의 수 또는 간략한 인큐베이션)를 제공한다. 또한, 이 프로토콜에 사용되는 편광 조건은 출판된 작업27,28,29에서파생된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
아래에 설명 된 모든 방법은 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 뉴 올리언스 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 혈액은 통보된 동의를 얻은 후에 수집되었습니다.
참고: 전체 절차는 생물 안전 수준 2(BSL2) 시설에서 멸균 조건하에서 수행되므로 생물학적 물질을 처리하는 데 주의가 사용됩니다. 특히, 각 단계는 생물 안전 성 캐비닛 에서 멸균 기술을 사용하여 수행됩니다. 혈액, 혈액 제품, 세포 또는 세포 제품 파이펫팅과 관련된 각 단계 후, 적절한 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 10 % 표백제로 모든 플라스틱 재료 (즉, 혈청 피펫, 파이펫 팁 및 튜브)를 헹구는 것이 중요합니다.
1. 면역 자기 음성 선택에 의한 1 차적인 인간 단핵구의 격리
- 4 개의 10 mL 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 진공 관 (튜브 당 혈액 10 mL)에서 신선한 인간 전혈 40 mL (HIV+ 환자 또는 건강한 대조군)을 수집하십시오. 생체 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 40 mL의 혈액을 모두 50 mL 원뿔형 프로필렌 튜브 로 옮니다.
- 선택한 인간 단핵구 절연 키트(재료 표)에대한 제조업체의 프로토콜에 따라 키트에 제공되는 단핵구 절연 칵테일 2 mL를 혈액 튜브에 추가하십시오. 소용돌이 자기 구슬은 또한 키트에 30 s에 대해 제공되며, 혈액 튜브에 2 mL를 추가합니다.
- 40 mL 미만의 혈액을 사용할 수 있는 경우, 추가된 시약을 축소하십시오. 용액을 혼합하려면 플라스틱 25 mL 혈청학적 파이펫과 파이펫을 위아래로 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 혈액 혼합물을 4개의 50 mL 튜브로 균등하게 분리하고 각 튜브에 1 mM EDTA를 함유하는 멸균 인산완충식염수(PBS)를 30mL 첨가합니다. 플라스틱 25mL 세로올로지컬 파이펫으로 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
- 튜브를 자석 홀더에 10 분 동안 놓고 항체 가액 자기 구슬을 제거합니다. 각 튜브마다 하나씩 4개의 자석 홀더를 동시에 사용하여 각 혈액 샘플에 대해 일관된 배양 및 격리 시간을 허용합니다.
- 그들은 여전히 자석 홀더에있는 동안, 파이펫을 사용하여, 각 튜브의 중심에서 내용을 그립니다. 적혈구를 그리지 않도록주의하십시오 (10 mL 시작 량의 10 % 이하), 4 개의 새로운 50 mL 튜브 중 하나에 내용물.
- 각 50 mL 튜브에 와류 자기 비드 500 μL을 추가합니다. 25 mL 파이펫으로 위아래로 파이펫을 하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자석 홀더에 넣고 5 분 동안 넣습니다.
- 자석 홀더에 있는 동안 각 튜브의 중앙에서 내용물 4개 중 하나로 조심스럽게 내용물 전달합니다. 각 새로운 50 mL 튜브를 자석 홀더에 5 분 동안 직접 놓습니다.
- 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나로 내용물들을 조심스럽게 옮김을 전달합니다. 모든 새로운 50 mL 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 회전. 상급자를 흡인하고 총 10 mL의 멸균 PBS에서 4 개의 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 혈세포계를 사용하여 트라이판 블루 배제에 의해 세포를 카운트.
참고: 8-20 x 106 세포는 일반적으로 전혈 40 mL에서 수득됩니다.
2. 1 차적인 인간 단핵구의 배양
- 37 °C 수조를 사용하여 따뜻한 혈청이없는 RPMI 1640 매체는 1 % 페니실린 - 스트렙 토신 (펜 / 스트렙)으로 보충하고 (생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 계속 사용하는 동안) 1 x 106 세포 / mL의 농도로이 매체의 단핵 구를 다시 일시 중단하십시오.
- 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시에 각 우물에 1 mL의 재부유 된 세포를 추가하고 (세포의 최종 수는 1 x 106 세포 / 플레이트여야함) 5 %CO2가있는37 °C 인큐베이터에 놓습니다. 세포가 부착될 때까지 0.5-1.0h를 기다립니다.
- 37°C 의 수조를 사용하여, 따뜻한 열불활성화(HI) 태아 소 혈청(FBS)을 사용한다. 각 접시에 FBS 100 μL(최종 농도 10%) 추가합니다. 대식 세포 분화를 촉진 하는 세포에 성장 인자를 추가 합니다.
- M1유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 25 ng/mL의 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 미디어에 첨가하였다. M2-유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 50 ng/mL의 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를미디어(28)에첨가하여.
참고: GM-CSF 및 M-CSF 는각각7,28,30에대해 M1 또는 M2에 대한 포라이밍 셀을 프라이밍하는 동안 일반적인 대식세포 표현형(M0)으로 단핵구 분화를 허용한다.
- M1유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 25 ng/mL의 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 미디어에 첨가하였다. M2-유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 50 ng/mL의 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를미디어(28)에첨가하여.
3. 문화에서 1 차적인 인간 단핵구를 전위
- miRNA를 이용한 트랜스펙트 단핵구는 중합체 계 형질감염 시약(표오브 물질)을함유하는 키트를 사용하여 모방또는 억제제 또는 siRNA를 모방한다.
- 형질감염 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 (그리고 생물 안전 성 캐비닛에서 멸균 기술의 사용을 계속), 먼저 1.83 μM의 최종 농도로 버퍼에서 선택한 miRNA 모방 / 억제제 또는 siRNAs를 희석 1 x 106 세포의 트랜스펙션 당 10 μL을 준비하십시오.
- 제공된 중합체의 1 μL을 신선한 1.5 mL 마이크로원절튜브에 첨가하여 트랜스펙션 시약을 준비하고, 즉시 90 μL의 완충액을 첨가하였다(총 91μL의 트랜스펙트당 시약). 3-5 s에 대 한 소용돌이.
- 희석된 miRNA 모방/억제제 또는 siRNA의 10 μL을 함유하는 튜브내로의 형질감염 용액의 피펫 90 μL. 부드러운 파이펫팅으로 섞고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
- 1 x 106 도금 단핵구의 하나의 우물 (또는 접시)에 100 μL의 형질 감염 복합체를 추가하십시오. 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양한 다음, 배지를 3 mL의 완전 배지(RPMI 1640+1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열 불활성화 FBS)로 대체하여 GM-CSF 또는 M-CSF를 함유한다.
4. M1/M2 차별화 및 활성화
- 단핵구는 즉시 배양시 광범위한 M0 대식세포로 분화하기 시작합니다. 도금 후 3일째에, 생물안전성 캐비닛 하에서 멸균 기술을 계속 사용하고 3 mL의 신선한 RMPI 1640 미디어(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 열 불활성화 FBS, 25 ng/mL GM-CSF로 보충)로 미디어를 교체하여 M1과 같은 편광 또는 50 ng/mL MF를 촉진합니다. 이러한 조건에서 세포를 37°C, 5%CO2에서인큐베이터에서 초기 도금으로부터 총 6일 동안 배양한다.
- M1 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 100 ng/mL 대장균-유래리포폴리사카라이드(LPS) 및 20 ng/mL 인터페론(IF)을 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.
- M2 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 10 ng/mL ML M-CSF 및 20 ng/mL 인터류키핀 4(IL-4)를 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.
- 24 시간 후 RNA, 단백질 또는 유동 세포 분석 분석을 위해 세포를 수확하십시오.
- 세포가 수집 할 준비가되면, PBS로 접시에 세포를 2 배 씻어 (RNA 추출을위한 RT에서 또는 단백질 추출을위해 얼음에 냉각). 분화된 대식세포는 이제 플레이트에 단단히 부착되기 때문에 플레이트에 세포를 직접 용해하여 RNA 및 단백질 분석을 위한 물질을 얻습니다.
- 유세포 측정을 위한 재료의 수집을 위해, 접시에 2 mM EDTA를 포함하는 PBS를 추가하고, 37 °C에서 10 분 동안 세포를 배양하고, 접시에서 세포를 부드럽게 긁어 내고, 표준 프로토콜을 진행하기 전에 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 내용물수집.
5. 유세포분석
- 배양 배지를 제거하기 위해 PBS에서 세포를 헹구는다. 100,000개의 세포(각 유량 세포 분석 조건당)를 스핀다운하고 HuFcR 결합 억제제 2 μL을 함유하는 PBS의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
- 50 μL의 염색 완충액을 첨가하고 원하는 항체(여기, CD80, CD83, CD163 및 CD209를 사용하였다)를 권장량에 첨가하였다.
- 부드럽게 섞고 4°C에서 30분간 어둠 속에서 배양합니다.
- PBS로 2x세척하고 시토플루오리미터에서 샘플을 실행하기 전에 150 μL의 PBS에서 염색된 세포를 다시 중단합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
설명된 절차를 사용하여, HIV에 감염된 개별 및 건강한 기증자에게서 1 차적인 인간 단핵구는 격리되었습니다. 여기에 제시된 모든 데이터는 낮은(&20 카피/mL) 또는 탐지할 수 없는 바이러스 부하 및 일반 CD4+ T 세포 수로 cART를 받는 HIV+ 피험자로부터 얻어졌습니다. 격리 직후, 세포를 염색하고, 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 유세포측정을 수행하였다. 결과는 >97%의 세포가 CD14에 대해 양성으로 염색된 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 대식세포의 편광을 위해, 출판된 프로토콜은28을사용하였다. 1차 인간 단핵구는 6일 동안 GM-CSF 또는 M-CSF의 존재에서 배양되었다. 6일째에, 세포는 M1 또는 M2 대식세포쪽으로 활성화되었다. 24시간 후 활성화, 세포를 수확하고 대식세포 마커의 유세포분석분석으로 염색하였다.
도 1은 M1 활성화 대조군(도1A)및 환자 유래 세포(도1B)CD80 및 CD83의 증가된 수준을 가진 세포및 비활성화 T0 세포에 비해 CD163의 감소된 수준뿐만 아니라 CD163 및 CD209의 증가된 수준을 가진 M2 활성화 세포를 나타낸다. 패널 C는 M1 및 M2 편광 셀에서 CD80, CD83, CD163 및 CD209의 발현을 나타낸다. 그래프는 3개의 대조군 및 3개의 HIV 유래 세포 세트에서 얻은 평균 데이터를 나타낸다. 예상대로, CD80 및 CD83의 발현 수준은 M2 편광 세포에 비해 M1에서 증가했으며, CD209 및 CD163은 M1 편광 세포에 비해 M2에서 더 높게 발현되었다. 흥미롭게도, CD80 및 CD83은 HIV 유래 세포에 비해 대조군 유래 세포에서 더 높게 발현되는 것으로 나타났다. 그러나, 대조군과 비교하여 HIV 유래 세포에 있는 편광 마커의 편광 및/또는 발현 수준을 편광하는 기능에 있는 잠재적인 다름은 추가 조사를 요구합니다. 비록 GM-CSF, M-CSF, LPS, 및 IFN-γ가 치료제로 선택되었지만, 성장 인자, 사이토카인, 또는 자극기의 다른 조합이 이프로토콜(28)과함께 사용될 수 있다.
예비 실험 후 격리 절차가 성공적이었다는 것을 보여주었고, 갓 수집된 단핵구는 6개의 웰 플레이트에 도금되고, 형질감염 효율을 결정하기 위해 스크램블, 근적외선 표지 miRNA로 형질전환하였다. 세포는 형광 공초점 현미경 검사법에 의해 24 시간 후 형질혈을 심상하였다. 이 방법을 사용하여, 유세포분석법(도2A)및 공초점 현미경검사법(도2B)에의해 결정된 바와 같이, 형질감염의 90% 효율을 달성하였다.
다음으로, 형질전환 후 세포의 생존가능성을 결정하였다. 도 3은 2명의 환자로부터 유래된 세포의 평균으로 배색 분석법을 사용하여 결정된 세포의 생존 가능성을 나타내고(도3A)및 2개의 대조군(도 3B)에서1일째에 형질감염(도3A)또는 4일째(도3B)에서수확하였다. 이 실험을 위해, 50,000개의 세포를 96개의 다중 웰 플레이트에 도금하고 프로토콜에 따라 형질감염하였다. 일반적으로, 형질감염은 세포의 성숙 단계 및 형질감염 조건(즉, 모의, 스크램블된 siRNA/miRNA, 또는 siRNA/miRNA)에 관계없이 세포의 생존가능성을 현저히 감소시키지 않았다. 도 3은 환자 유래 세포(패널 A) 및 대조군 유래 세포(패널 B)로부터 수득된 데이터를 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 이것은 전체 실험을 수행하기에 충분하지 않은 세포가 필요했기 때문에 (1일째 및 4일째에 대한 생존 가능성 및 서쪽 얼룩 둘 다, 형질감염당 6개의 상이한 조건에서) 단일 샘플을 사용하여 수득할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 도면은 대조군 또는 환자 유래 세포로 얻을 수 있는 대표적인 결과를 제공한다.
이어서, 표적 mRNA에 대한 siRNA 형질감염의 효과는 단백질 발현을 평가함으로써 평가되었다. 도 4의 결과는 이들 세포에서 매우 풍부한 번역 조절제인 EIF4EBP1의 효과적인 하향 조절을 나타내며, 1일째(도 4A)및 4일째에 특정 siRNA를 가진 형질감염시(도 4C). 동일한 조절기는 또한 다양한 조절 조건 하에서 발현을 유지하였다(즉, 변형되지 않은, 모의, 스크램블된 siRNA, 및 형질감염 시약 없이 EIF4EBP1 siRNA: siR*). 1일째 및 제4일째 에 대한 웨스턴 블롯 실험의 정량화는 각각 도 4B 및 도 4D에나타내며, 부가적으로, HIV 유래 세포의 RT-qPCR에 의해 1일째 또는 4일째에 형질감염 후 miR-146a-5p의 발현 수준을 결정하였다(도4E). miRNA 모방으로 형질 감염된 세포는 감염되지 않은 세포에 대한 miRNA 발현이 48-72배 증가하는 반면, 모든 형질감염 대조군은 현저한 변화를 보이지 않았다.
그림 1: 단핵구 유래 대식세포는 M1 또는 M2 대식세포 표현형을 향해 성공적으로 편광되고 활성화된다. 하나의 건강한 대조군(A) 및 1개의 HIV 유래 세포 샘플(B)으로부터 유래된 세포의 유세포분석 결과는 CD80, CD83, CD163 및 CD209의 수준을 보여준다. 실험은 유사한 결과를 가진 2개의 추가 대조군 및 2개의 추가 HIV 양성 견본으로 반복되었습니다. 관심 있는 세포 집단은 전방 및 측면 분산 매개변수를 기준으로 게이트되었으며, 그 다음으로 이중 차별이 뒤따랐습니다. (c) M1 및 M2 편광 셀에서 CD80, CD83, CD163 및 CD209를 나타내는 막대 그래프. 그래프는 3개의 대조군(Ctrl) 및 3개의 HIV 유래(Pts) 세포 세트에서 얻은 평균 데이터 및 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 1차 인간 CD14+ 세포는 miRNA로 효율적으로 형질감염된다. (A) 건강한 대조군에서 파생된 1차 단핵구의 유동 세포분석, 24시간 후 형질감염, 형질감염 효율 >90% 표시. (b) 대표적인 공초점 이미지는 24시간 후 트랜스펙션을 촬영한 것으로, 현장의 모든 세포가 근적외선 염료(흰색)와 결합된 miRNA를 발현한다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형질감염된 세포의 생존가능성. 그래프 막대는 2명의 HIV+ 환자(A) 및 2개의 건강한 대조군(B)의 평균 세포 생존가능성을 나타내며, miR-146a-5p 또는 siRNA를 EIF4EBP1(siRNA)으로 형질전환한 후, 1일째(A) 또는 4일째(B)에서 적절한 대조군을 모두 7일째에 시험하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: cd14+ 단핵구의 siRNA/miRNA 형질감염 후 단백질 수치의 효율적인 하향 조절. 대조군 및 HIV 유래 단핵구(1 x 106 세포)는 EIF4EBP1 mRNA에 대하여 siRNA를 사용하여 1일째(A) 또는 4일째(C) 사후 격리에서 형질감염되었다. 패널(B) 및 (D)는 GAPDH에 비해 EIF4EBP1 발현의 정량화를 나타내고 환자(Pt) 또는 대조군(Ctrl) (A) 또는 환자 또는 대조군(B)에 대한 모의 에 대한 백분율로 표현된다. (e) 4일째(바 1-4) 또는 1일째(오른쪽 바)에서 형질감염된 HIV 유래 세포에서 miR-146a-5p 발현을 나타내는 2개의 실험의 대표적인 막대 그래프를 7일째에 수확하였다. 접기 변화는 변형되지 않은 샘플(siR = siRNA)을 통해 계산됩니다. siR* 또는 miR-145a-5p*는 형질감염 시약 없이 siRNA 또는 miR-146a-5p로 세포의 인큐베이션을 나타냅니다. 실험은 대조군 유래 세포로 2x반복되었고 본질적으로 동일한 결과를 생성하였다(데이터는 도시되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
제시된 프로토콜은 단핵구 및 대식세포를 공부하기 위한 모형으로 HIV 감염한 과목에서 1 차적인 세포의 사용을 보여줍니다. HIV+ cART를 겪고 있는 환자는 여러 해 동안 감염과 함께 살고 있으며 손상된 면역 체계와 관련된 다른 공동 감염을 가질 수도 있습니다. HIV 만성 감염의 존재에서 면역 조절을 연구하기 위해 세포는 환자로부터 직접 수확되었습니다. miRNA가 세포 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났듯이, 프로토콜은 이들 1차 세포에서 miRNA 발현을 조작하는 능력에 초점을 맞추고있다(그림 2, 그림 3, 도 4). 동일한 절차를 사용하여 이 프로토콜은 siRNAs에도 매우 효과적입니다(그림3, 그림 4). 성숙한 대식세포의 잠재적식 식세포 활성으로 인해 모의 및 스크램블 siRNA 컨트롤 외에도 형질감염 시약이 생략되는 컨트롤이 사용됩니다(그림 3 및 그림 4에서siR* 또는 miR*로 표시됨). 데이터는 세포 내로의 적절한 siRNA/miRNA 전달을 위해 형질감염 시약이 필요하다는 것을 확인하며, 시약없이, 세포는 이미 대식세포로 분화된 경우에도 miRNA 또는 siRNA를 자발적으로 섭취하지 않는다(도금 및 분극 후 4일째, 도금 및 분극 후, 도면 3 및 도 4).
인간 1차 CD14+ 단핵구의 격리 및 형질전환을 위해 시판되는 키트를 사용하는 동안, 절차를 재현가능하고 성공적으로 만들기 위해 최적화된 주요 단계가 있습니다. 구체적으로, 도금된 세포의 수는 그들의 생존 및 분화에 매우 중요하며, 1 x 106 세포/35 mm 접시가 가장 잘 작동하는 것으로 나타났다. 2) 갓 단리된 CD14+ 세포는 FBS의 존재에 시드된 경우 배양 접시에 균일하게 부착되지 않는다. 결과적으로, 형질전환 후 배지 4h를 교체할 때, 부착되지 않은 모든 세포가 제거되어 플레이트 간 조건이 매우 가변적이다. 3) 형질전환 후 배지 4시간 교체는 형질감염의 효율에 영향을 미치지 않는 반면, 트랜스펙팅 시약으로 인한 독성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 4) 형질전환 조건은 제조자(25 nM)가 권장하는 농도보다 적은 siRNA 또는 miRNA(15 nM)를 요구하도록 최적화되었다. 5) 세포의 고도로 부착 성질로 인해, 용해 완충액을 플레이트에 직접 첨가하면 수확된 단백질 또는 RNA의 농도가 크게 향상된다. 그러나 플레이트에서 세포를 제거해야 하는 경우(즉, 유세포 분석의 경우) EDTA를 사용하여 세포를 부드럽게 긁는 것이 가장 좋습니다. 이 방법은 수집된 세포의 수를 약 20%-30%까지 감소시켜 추가 분석을 위해 충분한 세포 수를 얻기 위해 그에 따라 실험을 계획하는 것이 중요합니다.
올바르게 따를 때, 이 절차는 단핵구의 고도로 순수한 CD14+ 인구의 취득을 보여줍니다, siRNAs의 transfection 및 miRNAs와 같은 작은 RNA, 배양 조건, M1 또는 M2 대식세포로 분화. 이 방법은 HIV 이외의 복잡한 질병 또는 감염을 연구하기 위해 적용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 유세포 분석 분석을 제공하기 위한 환자 샘플 및 세포 면역학 물질 대사 코어를 제공하는 HIV 임상/종양 Biorepository Core에 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH P20GM121288 및 P30GM114732에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
