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방법 논문

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59967

⸱

2019년 12월 16일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Microbiology, Immunology, and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Biomedical and Clinical Sciences L. Sacco, University of Milan

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

초록

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 1990 년대 중반에 결합 된 항 레트로 바이러스 치료 (cART)의 도입에도 불구하고 주요 건강 관심사로 남아 있습니다. 항레트로바이러스 요법은 전신 바이러스 부하를 효율적으로 낮추고 정상적인 CD4+ T 세포 수를 회복시키지만 완전히 기능적인 면역 체계를 재구성하지는 않습니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에 있는 역기능 면역 계통은 면역 성 활성화, 면역 세포의 조기 노화, 또는 지속적인 염증에 의해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 조건은 HIV 감염과 관련된 comorbid 요인과 함께 세포 및 동물 모델에서 쉽게 재현 할 수없는 질병에 복잡성을 추가합니다. 이 환자에 있는 면역 기능 장애의 근본적인 분자 사건을 조사하기 위하여는, 시험관에서 인간 1 차적인 단핵구를 문화로 조작하는 체계는 여기에서 제시됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 HIV 음성 대조군뿐만 아니라 CART를 받은 HIV 감염 개인으로부터 얻은 1차 CD14+ 단핵구의 배양 및 형질감염을 허용한다. 이 방법은 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포의 격리, 배양 및 형질취득을 포함합니다. 시판되는 키트와 시약이 사용되는 동안, 프로토콜은 miRNA 모방 및 억제제뿐만 아니라 siRNAs와 단핵구의 성공적인 준수 및 형질감염을위한 중요한 팁과 최적화 된 조건을 제공합니다.

서론

인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1) 감염은 기회 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)으로 이어질 수있는 심각한 면역 기능 장애를 유발합니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염 환자는 낮은 바이러스 하중 및 일반적인 CD4+ T 세포 수에 의해 특징지더라도, 면역 계통의 기능은 암 발전의 증가한 리스크에 연결되는 역기능 면역 반응으로 이끌어 내는 이 개별에서 손상될 수 있습니다1. cART에 HIV 환자에 있는 면역 기능 장애의 기계장치는 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서 환자 유래 면역 세포를 특성화하고 생물학 및 기능을 조사하는 것이 현재 HIV 연구의 중요한 구성 요소입니다.

단핵구와 대식세포는 면역 반응의 주요 조절자이며 HIV 감염2,3,4,5에서근본적인 역할을 합니다. 본질적으로 이질성 및 플라스틱, 대식세포는 고전적으로 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화(M2)로 광범위하게 분류될 수 있다. 이러한 일반적인 분류는 실험 조건을 설정할 때 필요하지만, 대식세포의 편광 상태는다양한사이토카인6,7,8,9에의해 역전될 수 있다. 여러 연구가 단핵구와 수지상 세포에 대한 HIV 감염의 영향을 조사했지만, 단핵구 매개 반응의 분자 세부 사항은 크게 알려지지 않은6,7, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 면역 세포 조절 및 기능에 관여하는 인자 들 중에서, microRNAs (miRNAs), 유전자 발현 후 전사적으로 조절되는 짧은 비코딩 RNA는, 주요 세포 경로의 맥락에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (즉, 성장, 분화, 개발, 및 세포 자멸)20. 이들 분자는대식세포(21)의기능적 편광을 지시하는 데 필수적인 전사 인자의 중요한 조절자로 기술되었다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에서 단핵구에 있는 miRNAs의 잠재적인 역할은 조사되었습니다, 그러나 필드에 있는 진행은22,23,24,25,26를훨씬 더 필요로 합니다 . 이 논문에서는 HIV 에 감염된 환자 및 대조군으로부터 1차 인간 단핵구로 miRNAs 및 siRNAs를 트랜스펙트하는 최적화된 방법에 대해 설명합니다.

이 프로토콜은 시판되는 시약과 키트에 의존하며, 기술 절차의 연속성은 임상 샘플로 작업할 때 불필요한 실험 변수를 제거하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 중요한 팁(즉, 플레이트에 대한 세포의 순착을 촉진하기 위해 무혈청 매체로 도금된 세포 의 수 또는 간략한 인큐베이션)를 제공한다. 또한, 이 프로토콜에 사용되는 편광 조건은 출판된 작업27,28,29에서파생된다.

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프로토콜

아래에 설명 된 모든 방법은 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 뉴 올리언스 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 혈액은 통보된 동의를 얻은 후에 수집되었습니다.

참고: 전체 절차는 생물 안전 수준 2(BSL2) 시설에서 멸균 조건하에서 수행되므로 생물학적 물질을 처리하는 데 주의가 사용됩니다. 특히, 각 단계는 생물 안전 성 캐비닛 에서 멸균 기술을 사용하여 수행됩니다. 혈액, 혈액 제품, 세포 또는 세포 제품 파이펫팅과 관련된 각 단계 후, 적절한 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 10 % 표백제로 모든 플라스틱 재료 (즉, 혈청 피펫, 파이펫 팁 및 튜브)를 헹구는 것이 중요합니다.

1. 면역 자기 음성 선택에 의한 1 차적인 인간 단핵구의 격리

  1. 4 개의 10 mL 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 진공 관 (튜브 당 혈액 10 mL)에서 신선한 인간 전혈 40 mL (HIV+ 환자 또는 건강한 대조군)을 수집하십시오. 생체 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 40 mL의 혈액을 모두 50 mL 원뿔형 프로필렌 튜브 로 옮니다.
  2. 선택한 인간 단핵구 절연 키트(재료 표)에대한 제조업체의 프로토콜에 따라 키트에 제공되는 단핵구 절연 칵테일 2 mL를 혈액 튜브에 추가하십시오. 소용돌이 자기 구슬은 또한 키트에 30 s에 대해 제공되며, 혈액 튜브에 2 mL를 추가합니다.
    1. 40 mL 미만의 혈액을 사용할 수 있는 경우, 추가된 시약을 축소하십시오. 용액을 혼합하려면 플라스틱 25 mL 혈청학적 파이펫과 파이펫을 위아래로 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양하십시오.
  3. 혈액 혼합물을 4개의 50 mL 튜브로 균등하게 분리하고 각 튜브에 1 mM EDTA를 함유하는 멸균 인산완충식염수(PBS)를 30mL 첨가합니다. 플라스틱 25mL 세로올로지컬 파이펫으로 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
  4. 튜브를 자석 홀더에 10 분 동안 놓고 항체 가액 자기 구슬을 제거합니다. 각 튜브마다 하나씩 4개의 자석 홀더를 동시에 사용하여 각 혈액 샘플에 대해 일관된 배양 및 격리 시간을 허용합니다.
  5. 그들은 여전히 자석 홀더에있는 동안, 파이펫을 사용하여, 각 튜브의 중심에서 내용을 그립니다. 적혈구를 그리지 않도록주의하십시오 (10 mL 시작 량의 10 % 이하), 4 개의 새로운 50 mL 튜브 중 하나에 내용물.
  6. 각 50 mL 튜브에 와류 자기 비드 500 μL을 추가합니다. 25 mL 파이펫으로 위아래로 파이펫을 하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자석 홀더에 넣고 5 분 동안 넣습니다.
  7. 자석 홀더에 있는 동안 각 튜브의 중앙에서 내용물 4개 중 하나로 조심스럽게 내용물 전달합니다. 각 새로운 50 mL 튜브를 자석 홀더에 5 분 동안 직접 놓습니다.
  8. 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나로 내용물들을 조심스럽게 옮김을 전달합니다. 모든 새로운 50 mL 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 회전. 상급자를 흡인하고 총 10 mL의 멸균 PBS에서 4 개의 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  9. 혈세포계를 사용하여 트라이판 블루 배제에 의해 세포를 카운트.
    참고: 8-20 x 106 세포는 일반적으로 전혈 40 mL에서 수득됩니다.

2. 1 차적인 인간 단핵구의 배양

  1. 37 °C 수조를 사용하여 따뜻한 혈청이없는 RPMI 1640 매체는 1 % 페니실린 - 스트렙 토신 (펜 / 스트렙)으로 보충하고 (생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 계속 사용하는 동안) 1 x 106 세포 / mL의 농도로이 매체의 단핵 구를 다시 일시 중단하십시오.
  2. 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시에 각 우물에 1 mL의 재부유 된 세포를 추가하고 (세포의 최종 수는 1 x 106 세포 / 플레이트여야함) 5 %CO2가있는37 °C 인큐베이터에 놓습니다. 세포가 부착될 때까지 0.5-1.0h를 기다립니다.
  3. 37°C 의 수조를 사용하여, 따뜻한 열불활성화(HI) 태아 소 혈청(FBS)을 사용한다. 각 접시에 FBS 100 μL(최종 농도 10%) 추가합니다. 대식 세포 분화를 촉진 하는 세포에 성장 인자를 추가 합니다.
    1. M1유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 25 ng/mL의 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 미디어에 첨가하였다. M2-유사 표현형에 대한 주요 대식세포는 50 ng/mL의 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를미디어(28)에첨가하여.
      참고: GM-CSF 및 M-CSF 는각각7,28,30에대해 M1 또는 M2에 대한 포라이밍 셀을 프라이밍하는 동안 일반적인 대식세포 표현형(M0)으로 단핵구 분화를 허용한다.

3. 문화에서 1 차적인 인간 단핵구를 전위

  1. miRNA를 이용한 트랜스펙트 단핵구는 중합체 계 형질감염 시약(표오브 물질)을함유하는 키트를 사용하여 모방또는 억제제 또는 siRNA를 모방한다.
    1. 형질감염 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 (그리고 생물 안전 성 캐비닛에서 멸균 기술의 사용을 계속), 먼저 1.83 μM의 최종 농도로 버퍼에서 선택한 miRNA 모방 / 억제제 또는 siRNAs를 희석 1 x 106 세포의 트랜스펙션 당 10 μL을 준비하십시오.
  2. 제공된 중합체의 1 μL을 신선한 1.5 mL 마이크로원절튜브에 첨가하여 트랜스펙션 시약을 준비하고, 즉시 90 μL의 완충액을 첨가하였다(총 91μL의 트랜스펙트당 시약). 3-5 s에 대 한 소용돌이.
  3. 희석된 miRNA 모방/억제제 또는 siRNA의 10 μL을 함유하는 튜브내로의 형질감염 용액의 피펫 90 μL. 부드러운 파이펫팅으로 섞고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
  4. 1 x 106 도금 단핵구의 하나의 우물 (또는 접시)에 100 μL의 형질 감염 복합체를 추가하십시오. 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양한 다음, 배지를 3 mL의 완전 배지(RPMI 1640+1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열 불활성화 FBS)로 대체하여 GM-CSF 또는 M-CSF를 함유한다.

4. M1/M2 차별화 및 활성화

  1. 단핵구는 즉시 배양시 광범위한 M0 대식세포로 분화하기 시작합니다. 도금 후 3일째에, 생물안전성 캐비닛 하에서 멸균 기술을 계속 사용하고 3 mL의 신선한 RMPI 1640 미디어(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 열 불활성화 FBS, 25 ng/mL GM-CSF로 보충)로 미디어를 교체하여 M1과 같은 편광 또는 50 ng/mL MF를 촉진합니다. 이러한 조건에서 세포를 37°C, 5%CO2에서인큐베이터에서 초기 도금으로부터 총 6일 동안 배양한다.
  2. M1 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 100 ng/mL 대장균-유래리포폴리사카라이드(LPS) 및 20 ng/mL 인터페론(IF)을 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.
  3. M2 대식 세포 표현형으로 프라이밍 세포의 편광을 진행하기 위해, 세포 매체를 5% 열 불활성화 FBS, 1% 펜/스트렙, 10 ng/mL ML M-CSF 및 20 ng/mL 인터류키핀 4(IL-4)를 포함하는 새로운 매체로 대체하여 인큐베이션 6일째에 세포를 활성화합니다.
  4. 24 시간 후 RNA, 단백질 또는 유동 세포 분석 분석을 위해 세포를 수확하십시오.
    1. 세포가 수집 할 준비가되면, PBS로 접시에 세포를 2 배 씻어 (RNA 추출을위한 RT에서 또는 단백질 추출을위해 얼음에 냉각). 분화된 대식세포는 이제 플레이트에 단단히 부착되기 때문에 플레이트에 세포를 직접 용해하여 RNA 및 단백질 분석을 위한 물질을 얻습니다.
    2. 유세포 측정을 위한 재료의 수집을 위해, 접시에 2 mM EDTA를 포함하는 PBS를 추가하고, 37 °C에서 10 분 동안 세포를 배양하고, 접시에서 세포를 부드럽게 긁어 내고, 표준 프로토콜을 진행하기 전에 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 내용물수집.

5. 유세포분석

  1. 배양 배지를 제거하기 위해 PBS에서 세포를 헹구는다. 100,000개의 세포(각 유량 세포 분석 조건당)를 스핀다운하고 HuFcR 결합 억제제 2 μL을 함유하는 PBS의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
  2. 50 μL의 염색 완충액을 첨가하고 원하는 항체(여기, CD80, CD83, CD163 및 CD209를 사용하였다)를 권장량에 첨가하였다.
  3. 부드럽게 섞고 4°C에서 30분간 어둠 속에서 배양합니다.
  4. PBS로 2x세척하고 시토플루오리미터에서 샘플을 실행하기 전에 150 μL의 PBS에서 염색된 세포를 다시 중단합니다.

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결과

설명된 절차를 사용하여, HIV에 감염된 개별 및 건강한 기증자에게서 1 차적인 인간 단핵구는 격리되었습니다. 여기에 제시된 모든 데이터는 낮은(&20 카피/mL) 또는 탐지할 수 없는 바이러스 부하 및 일반 CD4+ T 세포 수로 cART를 받는 HIV+ 피험자로부터 얻어졌습니다. 격리 직후, 세포를 염색하고, 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 유세포측정을 수행하였다. 결과는 >97%의 세포가 CD14에 대해 양성으로 염색된 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 대식세포의 편광을 위해, 출판된 프로토콜은28을사용하였다. 1차 인간 단핵구는 6일 동안 GM-CSF 또는 M-CSF의 존재에서 배양되었다. 6일째에, 세포는 M1 또는 M2 대식세포쪽으로 활성화되었다. 24시간 후 활성화, 세포를 수확하고 대식세포 마커의 유세포분석분석으로 염색하였다.

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토론

제시된 프로토콜은 단핵구 및 대식세포를 공부하기 위한 모형으로 HIV 감염한 과목에서 1 차적인 세포의 사용을 보여줍니다. HIV+ cART를 겪고 있는 환자는 여러 해 동안 감염과 함께 살고 있으며 손상된 면역 체계와 관련된 다른 공동 감염을 가질 수도 있습니다. HIV 만성 감염의 존재에서 면역 조절을 연구하기 위해 세포는 환자로부터 직접 수확되었습니다. miRNA가 세포 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났듯이, 프로토콜은 이들 1차 세포에서 miRNA 발현을 조작하는 능력에 초점을 맞추고있다(그림 2, 그림 3, 도 4). 동일한 절차를 사용하여 이 프로토콜은 siRNAs에도 매우 효과적입니다(그림3, 그림 4). 성숙한 대식...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 유세포 분석 분석을 제공하기 위한 환자 샘플 및 세포 면역학 물질 대사 코어를 제공하는 HIV 임상/종양 Biorepository Core에 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH P20GM121288 및 P30GM114732에 의해 투자되었습니다.

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재료

Escherichia coli
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브 K2BD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794유세포 분석
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42유세포 분석 - 접합 항체
CD163 BV711BD Horizon563889유세포 분석 - 접합 항체
CD209 BV421BD Horizon564127유세포 분석 - 접합 항체
CD80 FITCBD Horizon557226유세포 분석 - 접합 항체
CD83 APCBD Horizon551073유세포 분석 - 접합 항체
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644웨스턴 블롯
EIF4EBP1 siRNACruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios 유세포 분석기Beckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724에 대한 단클론 항체
eBiosciences14-9161-73유세포 분석 완충액
Kaluza 분석 소프트웨어Beckman CoulterB16406유세포 분석 데이터
지질다당류를 분석하는 소프트웨어: B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA 음성 대조군시그마HMC0002근적외선 염료와 결합 스크램블 miRNA
Nunc 35mm 세포 배양 접시Thermo Scientific150318
PBSGibco20012027
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122
재조합 인간 GM-CSFR& D Systems215-GM-050
재조합 인간 IFN-&감마;R& D 시스템285-IF-100
재조합 인간 IL-4R& D 시스템204-IL-010
재조합 인간 M-CSFR& D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
스크램블 컨트롤 siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection 시약 키트LipocalyxVB-01LB-01
WST-1 세포 증식 시약Roche5015944001세포 생존율 평가를 위한 비색 분석
용 단클론 항체Santa 웨스턴 블롯 HuFcR 결합 억제제 O55의

참고문헌

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1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화
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