Summary
É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.
Abstract
O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias que suportam funções fisiológicas, tais como metabolismo alimentar, colheita de energia, e regulação do sistema imunológico. A perturbação do microbioma intestinal saudável tem sido sugerida para desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla (MS). Fatores ambientais e genéticos podem influenciar a composição do microbioma; Portanto, a identificação de comunidades microbianas ligadas a um fenótipo de doença tornou-se o primeiro passo para a definição do papel do Microbiome na saúde e na doença. O uso do sequenciamento metagenomico de 16s rRNA para analisar a comunidade bacteriana tem ajudado no avanço da pesquisa de microbioma. Apesar de seu uso largo, não há nenhum protocolo uniforme para a análise de perfilação taxonômica 16S rRNA-baseada. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido a dificuldades técnicas, como leituras de sequenciamento menores, bem como o uso de apenas leituras Forward (R1) na análise final devido à baixa qualidade de leituras inversas (R2). Há necessidade de um método simplificado com alta resolução para caracterizar a diversidade bacteriana em um dado bioespécime. Os avanços na tecnologia de sequenciamento com a capacidade de sequenciar leituras mais longas em alta resolução ajudaram a superar alguns desses desafios. A tecnologia de sequenciamento atual combinada com um pipeline de análise metagenômica disponível publicamente, como o R-based divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2), ajudou a avançar o perfil microbiano em alta resolução, pois DADA2 pode atribuir a sequência no gênero e níveis de espécies. Descrito aqui é um guia para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 do gene 16S rRNA, seguido pela análise usando ferramentas de análise disponíveis livremente (i.e., DADA2, Phyloseq, e METAGENassist). Acredita-se que este fluxo de trabalho simples e completo servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.
Introduction
A microbiota refere-se a uma coleção de microrganismos (bactérias, vírus, archaea, bacteriófagos e fungos) vivendo em um ambiente particular, e o microbioma refere-se ao genoma coletivo de microrganismos residentes. Como as bactérias são um dos micróbios mais abundantes em humanos e camundongos, este estudo é focado apenas no perfil bacteriano. O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias e centenas de cepas bacterianas1. A microbiota intestinal normal desempenha um papel vital na manutenção de um estado saudável no hospedeiro, regulando as funções (ou seja, a manutenção de uma barreira do intestino intacto, metabolismo alimentar, homeostase energética, inibição da colonização por organismos patogénicos, e regulação das respostas imunes)2,3,4,5. As perturbações composicional da microbiota intestinal (disbiose intestinal) têm sido ligadas a uma série de doenças humanas, incluindo distúrbios gastrointestinais6, obesidade7,8, acidentevascular cerebral9, câncer10, diabetes8,11, artrite reumatóide12, alergias13, e doenças relacionadas ao sistema nervoso central, tais como esclerose múltipla (MS)14,15e Alzheimer doença (AD)8,16. Portanto, nos últimos anos, tem havido crescente interesse em ferramentas para identificar a composição bacteriana em diferentes locais do corpo. Um método confiável deve ter características como ser de alta produtividade e fácil de usar, ter a capacidade de classificar a microbiota bacteriana com alta resolução, e ser de baixo custo.
Técnicas microbiológicas baseadas na cultura não são sensíveis o suficiente para identificar e caracterizar o complexo microbioma intestinal devido à falha de várias bactérias intestinais para crescer na cultura. O advento da tecnologia baseada em sequenciamento, especialmente o seqüenciamento metagenomico baseado em rRNA 16s, superou alguns desses desafios e transformou a pesquisa em microbioma17. A avançada tecnologia de sequenciamento 16S rRNA tem ajudado a estabelecer um papel crítico para o microbioma intestinal na saúde humana. O projeto do microbioma humano, uma iniciativa nacional dos institutos de saúde18, e o projeto metahit (uma iniciativa européia)19 ajudaram a estabelecer um quadro básico para a análise do microbioma. Essas iniciativas ajudaram a iniciar vários estudos para determinar o papel do microbioma intestinal na saúde humana e na doença.
Vários grupos demonstraram disbiose intestinal em pacientes com doenças inflamatórias12,14,15,20,21,22. Apesar de ser amplamente utilizado para o perfilamento taxonômico devido à capacidade de multiplex e de baixos custos, não há nenhum protocolo uniforme para o perfilamento taxonômico 16S rRNA-baseado. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido às leituras de seqüenciamento menores (150 BP ou 250 BP) e o uso de apenas seqüenciamento de encaminhamento lido (R1) devido a leituras de seqüenciamento reverso de baixa qualidade (R2). No entanto, os avanços na tecnologia de sequenciamento ajudaram a superar alguns desses desafios, como a capacidade de sequenciar leituras mais longas usando leituras de extremidade emparelhada (por exemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).
A tecnologia de sequenciamento atual pode sequenciar 600 BP leituras de boa qualidade, que permite a mesclagem de leituras R1 e R2. Essas leituras de R1 e R2 mais longas mescladas permitem melhores atribuições taxonômicas, especialmente com a plataforma de acesso livre com base em R divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 utiliza atribuições baseadas em variante de sequência de amplicon (ASV) em vez de atribuições de unidade taxonômica operacional (OTU) com base na similaridade de 97% utilizada pelo QIIME23. As correspondências do ASV resultam em uma correspondência exata de sequência no banco de dados dentro de 1 a 2 nucleotídeos, o que leva à atribuição em níveis de gênero e espécie. Assim, a combinação de leituras mais longas, de boa qualidade pareadas e melhores ferramentas de atribuição taxonômica (como DADA2) transformaram estudos de microbioma.
Fornecido aqui é um guia passo-a-passo para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 de rRNA 16S e análise de dados usando DADA2, Phyloseq e METAGENassist pipelines. Para este estudo, os camundongos transgênicos de classe II de Antígeno leucocitário humano (HLA) são usados, pois certos alelos HLA classe II estão vinculados a uma predisposição a doenças auto-imunes, como a MS20,24,25. Entretanto, a importância de genes da classe II de HLA em regular a composição da microbiota do intestino é desconhecida. Hipótese que a molécula da classe II de HLA influenciará a comunidade microbiana do intestino selecionando para bactérias específicas. Os camundongos Knockout de classe II (AE. ko) ou camundongos que expressam moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 foram usados para compreender a importância das moléculas HLA classe II em moldar a comunidade microbiana do intestino. Acredita-se que este fluxo de trabalho completo e simplificado com análise de dados baseada em R servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.
A geração de camundongos que faltam genes de classe II Murina endógena de MHC (AE. KO) e AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * (HLA-DQ8) camundongos transgênicos com um fundo C57BL/6J tem sido descrito anteriormente26. Amostras fecais são coletadas de camundongos de ambos os sexos (8 – 12 semanas de idade). Os camundongos foram previamente criados e mantidos na instalação animal da Universidade de Iowa de acordo com o NIH e as diretrizes institucionais. Estratégias de controle de contaminação, como o desmame dos camundongos dentro de um armário de fluxo laminar, a mudança de luvas entre diferentes cepas de camundongos, e a manutenção adequada de camundongos são passos críticos para o perfilamento do microbioma intestinal.
O equipamento de proteção individual (EPI) adequado é altamente recomendado durante todo o procedimento. Controles negativos apropriados devem ser incluídos na realização de isolamento de DNA, amplificação PCR1 e PCR2 e etapas de sequenciamento. Recomenda-se o uso de suprimentos estéreis, livres de DNase, RNase e sem Pirogênios. O pipetador designado para o trabalho do microbioma e as pontas filtradas da pipeta devem ser usados durante todo o protocolo. A análise da microbiota consiste em sete etapas: 1) coleta e processamento de amostras fecais; 2) extração de DNA; 3) amplificação do gene 16S rRNA; 4) construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado; 5) limpeza e quantificação de PCR indexada (biblioteca); 6) sequenciamento de MiSeq; e 7) processamento de dados e análise de sequências. Um diagrama esquemático de todas as etapas do protocolo é mostrado na Figura 1.
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Protocol
O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Iowa.
1. coleta e manuseio de amostras fecais
- Esterilizar as caixas divisórias (ver tabela de materiais, Figura complementar 1) com 70% de etanol.
- Pré-rótulo de tubos de microcentrífuga (um por mouse) com o ID de amostra e grupo de tratamento (se aplicável).
- Coloc os ratos em umas caixas esterilizadas do divisor e permita que defecar normalmente para até 1 h.
- Colete as pelotas fecais em um tubo de microcentrífuga vazio, pré-rotulado de 1,5 mL usando fórceps estéril e feche o tubo firmemente. Esterilizar o fórceps após a coleta de cada rato.
- Coloque o tubo de microcentrífuga contendo pellets fecais em um freezer-80 ° c até o processamento adicional.
Nota: As caixas do divisor são vantajosas porque permitem a coleção simultânea de amostras fecais dos ratos múltiplos (até 12) em uma vez.
2. extração de DNA
- Retire as amostras fecais (rato ou humano) do congelador e descongelar à temperatura ambiente (RT).
Nota: É aconselhável descongelar amostras de fezes humanas durante a noite a 4 ° c, conforme necessário para coletar 200 mg ou a quantidade necessária de amostras de estoque. - Use 200 mg de materiais de partida e DNA eluto para um volume final de 50 μL.
- Inclua um kit de isolamento de DNA em branco em que nenhuma amostra fecal é adicionada, mas é processada através de todas as etapas de extração de DNA.
Nota: Utilizou-se um kit de isolamento de DNA específico (ver tabela de materiais), pois contém reagentes específicos para remover materiais inibidores como biossólidos, material vegetal não digerido e compostos heme de glóbulos vermelhos lisados presentes em fezes humanas e de rato Amostras. - Coloc o tubo do grânulo em um homogeneizador (veja a tabela de materiais) e Homogeneize as amostras para 45 s em RT e uma velocidade de 4,5 m/s.
Nota: Grânulo-batendo homogeneizador de qualquer fabricante pode ser usado. No entanto, recomenda-se padronizar o método, especificamente a velocidade e a duração da homogeneização, ao usar homogeneizador de batida de talão de outro fornecedor. - Isole o DNA de amostras fecais de camundongo individuais usando um kit de isolamento de DNA bacteriano seguindo o protocolo do fabricante (ver tabela de materiais) com pequenas modificações. Quantificar o DNA isolado carregando 1 μL do DNA em um fluorímetro ou no chip de eletroforese de alta sensibilidade (ver tabela de materiais).
Nota: O rendimento esperado do DNA pode variar de 500 – 2500 ng quando se inicia com 200 mg da amostra fecal. - Ajuste a concentração de DNA para 4 – 20 ng/μL utilizando tampão de eluição. Requantify o ADN (como feito na etapa 2,5) antes de prosseguir à amplificação do gene do rRNA 16S (PCR1), se PCR1 não é executado no mesmo dia.
3. amplificação do gene do rRNA 16S (PCR1)
- Configurar a amplificação do gene 16S rRNA (PCR1) em uma placa de PCR 96 bem usando um volume de reação de 25 μL.
- Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 12,5 μL de 2x mistura de enzima polimerase de alta fidelidade, incluindo tampão, além de dNTPs (ver tabela de materiais): 40 ng de DNA em até 10,5 μL de volume total (ajustar o volume total com água de grau PCR): 1 μl (cada) de avanço e primers reversos a 1 μM de concentração.
Nota: As sequências dos primers são as seguintes:
Forward primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' primer reverso = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Inclua um jogo em branco da etapa 2,3 (controle do reagente do jogo) na placa do PCR. - Sele a placa do PCR e Centrifugue em 1.000 x g em 20 ° c por 1 minuto em um centrifugador da placa do tabletop (veja a tabela dos materiais) e realize o PCR em um ciclador térmico programado para: 95 ° c por 3 minutos; 25 ciclos de 1) 95 ° c para 30 s, 2) 55 ° c para 30 s, 3) 72 ° c para 30 s; extensão final a 72 ° c por 5 min; e segure a 4 ° c.
Nota: Embora este método de amplificação do gene 16S rRNA deva trabalhar com diferentes tipos de bioespécimes, é aconselhável padronizar o número de ciclos de amplificação ao iniciar um novo projeto. - Confirme o tamanho do produto PCR1 carregando 1 μL do DNA em um chip de eletroforese de alta sensibilidade. Alternativamente, execute 5 μL do produto 16S rRNA-amplificado em um gel do agarose de 1,5% para confirmar 550 BP do produto PCR1.
Nota: A limpeza do produto 16S rRNA amplificado é opcional e depende do kit de isolamento de DNA/método que está sendo usado. Se usando um método de isolamento de DNA em casa, PCR1 produto pode ser limpo utilizando um kit de purificação de DNA de microbioma conforme o protocolo do fabricante (ver tabela de materiais). O kit de isolamento de DNA utilizado aqui produz um DNA ultrapura e não requer limpeza do produto PCR1.
4. construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado (PCR2)
-
Coloque o índice 1 e o índice 2 primers com código de barras em um rack especial (consulte tabela de materiais) para 96 bibliotecas.
- Organize o primer do índice 1 nas colunas 1 – 12 e primer do índice 2 nas linhas A – H do rack especial.
- Adicione 2,5 μL do índice 1 nas colunas 1 – 12 e primer do índice 2 nas linhas A – H usando pipetas multicanal. Coloque a nova tampa (ver tabela de materiais) no índice 1 e no índice 2 iniciadores de adoptor e guarde-o num congelador de-20 ° c.
- Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 12,5 μL de 2x mistura de enzima polimerase de alta fidelidade contendo um tampão, além de dNTPs (Ver tabela de materiais); 5 μL da água da classe do PCR e 2,5 μL do produto 16S rRNA-amplificado.
Nota: Adicione índices exclusivos a cada amostra para multiplexação de mais de 96 bibliotecas em uma única execução, conforme descrito em Kiernan et al.27. O presente protocolo utiliza adaptadores de um kit comercial (por exemplo, NextEra XT index Kit) de acordo com as instruções do fabricante fornecidas no método de sequenciamento de metagenômica 16S (por exemplo, Illumina). - Sele e Centrifugue a placa indexada do PCR em 1.000 x g em 20 ° c por 1 minuto e realize o PCR em um ciclador térmico programado para: 95 ° c por 3 minutos; 8 ciclos de 1) 95 ° c para 30 s, 2) 55 ° c para 30 s, 3) 72 ° c para 30 s; e extensão final a 72 ° c por 5 min.
- Confirme o tamanho 630 base do produto de PCR indexado carregando 1 μL de DNA em um chip de eletroforese de alta sensibilidade. Alternativamente, funcione 5 μL do produto indexado do PCR em um gel do agarose de 1,5% para confirmar o tamanho e a intensidade do produto.
5. limpeza do PCR indexado (PCR2) e quantificação
- Pool 5 μL de PCR2 amplicon usando pipetas multicanais de cada poço em uma bandeja de reservatório multicanal livre de DNase detectável, RNase, DNA humano e bactérias pirogênicas (ver tabela de materiais).
- Transfira o produto em pool da bandeja de reservatório multicanal para um tubo de microcentrífuga e Vortex vazio pré-rotulado de 1,5 mL para misturar.
- Purify o produto PCR2 usando o jogo magnético padrãodos grânulos (veja a tabela de materiais) como por a instrução do fabricante. Sele e armazene os 20 μL restantes de PCR2 na mesma placa em-80 ° c para uma utilização mais adicional, se necessário.
- Prepare o etanol fresco de 80% adicionando 4 mL de etanol a 100% a 1 mL de água de grau PCR.
- Equilibre o cordão magnético para RT e Vortex para 30 s para dispersar as contas uniformemente.
- Momentaneamente Vortex e gire para baixo as amostras agrupadas do amplicon PCR2.
- Adicione 80 μL de grânulos magnéticos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-rotulado e estéril com 80 μL de produtos de PCR agrupados, depois vórtice e gire brevemente para resuspender uniformemente os grânulos magnéticos.
- Incubar o conteúdo em RT sem perturbar os tubos por 15 min.
- Coloque o tubo com o DNA e os grânulos magnéticos em um suporte magnético (Ver tabela de materiais) por 5 min.
- Retire e elimine cuidadosamente 150 μL do sobrenadante.
- Adicionar 200 μL de etanol preparado na hora 80% sem perturbar os grânulos e incubar por 30 s.
- Retire cuidadosamente e descarte todo o sobrenadante.
- Repita os passos 5.11 – 5.12. Retire o volume restante com uma pipeta P10. Deixe os grânulos secar ao ar por 15 minutos, com o tubo do PCR do índice restante no carrinho magnético.
- Retire do suporte magnético. Adicionar 33 μL de tampão de eluição (o tampão de eluição do kit DNA é aceitável). Vortex bem, e executar uma rotação rápida para remover qualquer líquido remanescente no lado. Incubar por 2 min e coloque no suporte magnético por 5 min.
- Transfira 30 μL do sobrenadante (produtos de PCR limpos) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-rotulado.
- Quantifique a piscina purificada carregando 1 μL da piscina purificada em um fluorímetro ou chip de eletroforese de alta sensibilidade, pois isso será necessário durante o seqüenciamento. Execute MiSeq conforme detalhado abaixo.
6. sequenciamento de MiSeq
- Crie uma folha de amostra contendo informações de código de barras específicas de amostra para fluxo de trabalho de metagenômica e demultiplexação no instrumento MiSeq (Consulte tabela de materiais). Faça o upload desta folha de amostra para o software (por exemplo, Illumina Experiment Manager).
- Diluir as bibliotecas agrupadas da etapa 5,15 para 4 nM.
- As bibliotecas agrupadas de denature combinando 5 μL do pool da biblioteca de 4 nanômetro com 5 μL de NaOH recentemente preparado de 0,2 M em um tubo do microcentrifugador de 1,5 mL. Vortex brevemente para misturar, centrifugar brevemente e incubar por 5 min em ambiente RT.
- Adicionar 990 μL de tampão de hibridação gelada (tampão HB) e pipetar suavemente para misturar. Isso produzirá uma biblioteca de 20 pM.
- Combine 2 μL da biblioteca de controle de 10 nM com 3 μL de tampão EBT (10 mM de Tris-HCl, pH = 8,5, com 0,1% de Tween 20) para produzir uma biblioteca de controle de 4 nM. Adicione 5 μL de NaOH 0,2 N recém-preparados e vórtice brevemente para misturar. Incubar por 5 min em RT.
-
Adicionar 990 μL de tampão de hibridação gelada (tampão HB) e pipetar suavemente para misturar. Isso produzirá 20 bibliotecas de controle pM.
Nota: as bibliotecas de controle denatured 20 pM podem ser armazenadas em-20 ° c até por 4 semanas. Após 4 semanas, os números de cluster tendem a diminuir.- Combine 210 μL da biblioteca de 20 pM com 40 μL da biblioteca de controle de 20 pM (concentração final = ~ 18%), e adicione 350 μL de tampão HB. Carregar a biblioteca em uma concentração final de 7 pM.
Nota: Detalhes de entrada devem ser ajustados de acordo com o desempenho de execução.
- Combine 210 μL da biblioteca de 20 pM com 40 μL da biblioteca de controle de 20 pM (concentração final = ~ 18%), e adicione 350 μL de tampão HB. Carregar a biblioteca em uma concentração final de 7 pM.
- Incubar amostras durante 2 min a 96 ° c. Colocar gelo por 5 min. carregar 600 μL do conjunto final no poço adequado dos cartuchos de MiSeq.
Nota: A seção 6 acima pode ser executada em uma instalação do núcleo de Genomic/DNA.
7. processamento de dados e análise de sequências
- Use o software R (versão 3,5) para processamento e análise de dados do DADA2. Para as etapas 7.1 – 7.4, use o software de acesso aberto conforme descrito no tutorial online desenvolvido anteriormente DADA2 encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >.
Nota: Um script R prontamente utilizável foi anexado como um arquivo suplementar 2, e os usuários devem alterar o nome e a origem dos arquivos de seqüenciamento (por exemplo, SAMPLENAME_R1_001. fastq e SAMPLENAME_R2_001. fastq). - Visualize os perfis de qualidade das leituras Forward e Reverse usando o comando Plotqualityprofile .
- Aparar nucleotídeos de leituras para frente e para trás com base no gráfico de qualidade. Esses parâmetros são especificados pelo parâmetro truncLen em DADA2.
Nota: Aqui, 280 é usado como o limite de comprimento para o qual as leituras de encaminhamento seriam descartadas e 260 é usado como o limite de comprimento para o qual as leituras reversas seriam descartadas. - Processe os dados brutos de 16S como arquivos fastq pelo pipeline DADA2 conforme descrito no tutorial on-line (encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >) para mesclar as leituras R1 e R2 e as variantes de sequência de amplicon (ASVs), que são usadas para atribuir com o banco de dados de referência da Silva23.
Nota: uma tabela de variante de sequência de amplicon de exemplo gerada a partir do pipeline DADA2 está incluída como ficheiro suplementar 3. Um banco de dados de referência da Greengene ou Silva pode ser usado, pois não foram encontradas diferenças na classificação bacteriana usando qualquer uma dessas bases de dados. - Gere um arquivo de mapeamento definido pelo usuário que contenha os metadados (ou seja, genótipo, sexo, tratamento, etc.) para cada amostra. Um arquivo de metadados de exemplo foi incluído como arquivo suplementar 4.
- Calcule a diversidade alfa (índice de Shannon) e a diversidade beta usando a análise de coordenadas principais (PCA) com base nas contagens de Otu rarefeito usando phyloseq28 conforme descrito no tutorial on-line, encontrado em < https://benjjneb.github.Io/dada2/tutorial.html >.
- Realize a seguinte análise no METAGENassist29.
Nota: realize a análise de abundância diferencial usando o teste de Rank-Sum de Wilcoxon no nível do gênero. Mapas de calor e táxons diferencialmente abundantes são destacados usando o METAGENassist29, um pipeline de análise disponível publicamente e baseado na Web.- Carregue a tabela de abundância taxonômica (formato CSV) e selecione amostras na coluna.
- Carregue o arquivo de mapeamento (formato CSV) e selecione amostras em uma linha.
- Selecione opções para remover variáveis com mais de 50% de zeros e exclua leituras não atribuídas e não mapeadas.
- Selecione opções para normalizar linhas por soma e log normalizar colunas.
- Faça um gráfico de vulcão, PCA ou plsda clicando no mesmo na coluna da esquerda e clique em remover nome de amostras para fazer o gráfico.
- Realize um teste t(se apenas dois grupos) ou ANOVA (se maior que dois grupos) para visualizar os recursos (bactérias) que diferem entre os grupos. Clique em feições selecionadas para visualizar bactérias específicas que diferem entre os grupos.
- Clique em Dendrogram ou mapa de calor para criar respectivos gráficos. A análise adicional, como a visualização de amostra por grupos ou os recursos do Top 25 com base em t-Test/ANOVA, pode ser realizada.
- Clique em Randomforest para criar gráficos mostrando recursos que podem ser usados para classificação. Clique na guia variância na parte superior para criar gráficos para os principais recursos que diferem entre/entre grupos. Clique em detalhes do recurso para ver uma lista de bactérias que diferem entre os grupos e clique em cada bactéria para criar um resumo gráfico do mesmo.
- Clique na guia outlier na parte superior para Visualizar amostras que são outliers.
- Finalmente, clique em baixar e selecione 1) um arquivo ZIP contendo toda a análise realizada ou 2) os recursos desejados para download. Este arquivo deve ser salvo como um nome exclusivo e precisará ser descompactado antes de usar.
Nota: Para os testes estatísticos detalhados realizados durante a análise do microbioma, consulte as obras de Chen et al. e hugerth et al.14,30.
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Representative Results
Como as moléculas da classe II de MHC (HLA nos seres humanos) são os jogadores centrais na resposta imune adaptativa e mostram associações fortes com uma predisposição a MS24,25,26, foi supor que a molécula da classe II de HLA influenciaria a composição microbiana do intestino. Conseqüentemente, os ratos que faltam o gene da classe II de MHC (AE. KO) ou expressando o gene humano de HLA-DQ8 (HLA-DQ8) foram utilizados para compreender a importância de moléculas da classe II de HLA em moldar a comunidade microbiana do intestino.
Amostras fecais foram coletadas dos camundongos transgênicos AE. KO (n = 16) e HLA-DQ8 (n = 12), DNA bacteriano, e a região v3-v4 do gene 16S rRNA foi amplificada. O tamanho do amplicon (550 BP) foi confirmado pela execução das amostras em um gel de agarose 1,5% (Figura 2a, faixas 1–6). A confirmação adicional do tamanho do amplicon do rRNA 16S (550 BP) foi executada carregando 1 μL do produto PCR1 em uma microplaqueta elevada da electroforese da sensibilidade (Figura 2b, pistas 1–7).
Um electroferograma foi gerado do produto do PCR de 16s rRNA, que mostrou regiões máximas com os fragmentos feitos medida ~ 550 BP (Figura 2C). Os índices duplos e os adaptadores de sequenciamento foram anexados usando o PCR indexado (PCR2) que atribuiu uma identidade exclusiva a cada amostra e permitiu a multiplexação de muitas amostras em um único seqüenciamento de MiSeq executado. A confirmação da PCR indexada foi realizada por eletroforese em gel de agarose (Figura 2a, faixas 7–12) e um chip de eletroforese de alta sensibilidade (Figura 2b, faixas 8–12), Figura 2D]. Todas as amostras de PCR2 foram agrupadas, purificadas e carregadas em um sequenciador de próxima geração que rendeu R1 e inverter R2 leituras de boa qualidade (Figura 3). A mediana obtida lê após a filtragem e o aparamento da qualidade eram 88.125 (escala do 9597-111848).
A análise da ecologia comunitária foi realizada utilizando-se o pipeline de análise DADA2 e visualizado com Phyloseq e METAGENassist para demonstrar diferenças na diversidade alfa (Figura 4) e diversidade beta (Figura 5), bem como diferenças na gênero e espécies entre os grupos. A análise DADA2 gerou uma tabela de abundância com valores separados por vírgulas em formato CSV, que foi usado para posterior análise a jusante usando uma plataforma baseada na Web (ou seja, Phyloseq e/ou METAGENassist). As análises de diversidade alfa e beta foram realizadas com base em categorias definidas pelo usuário listadas em um arquivo de mapeamento.
A análise da diversidade de Shannon revelou uma diversidade alfa mais baixa global para camundongos AE. KO em comparação com camundongos transgênicos HLA-DQ8 (Figura 3). A ordenação com a análise de coordenadas principais mostrou um agrupamento espacial distinto entre camundongos AE. KO e camundongos transgênicos HLA-DQ8 (Figura 5). Uma tabela da abundância de DADA2 foi usada igualmente para executar uma análise metagenômica detalhada usando o software de acesso aberto metagenassist29. O agrupamento baseado em mapa de calor de abundância bacteriana (nível de gênero) (Figura 6a) e um gráfico de caixa para bactérias específicas mostrando as diferenças entre dois grupos (Figura 6B) foram gerados utilizando um pipeline metagenassist.
A análise do mapa de calor mostrou que determinadas bactérias tais como o allobacullum, o desufovibrio, e o rikenella eram mais abundantes em ratos transgênicas HLA-DQ8. Em contrapartida, a Biolophila foi mais abundante em camundongos ae. ko (Figura 6B). As abundâncias relativas de bactérias individuais (bilophila e rikenella) são mostradas em um gráfico de caixa representativo (Figura 6B). Ao todo, os dados demonstram que os camundongos AE. KO possuem uma comunidade microbiana distinta comparada à dos camundongos transgênicos HLA-DQ8, com ausência de bactérias específicas em camundongos AE. KO. Os dados igualmente sugerem que as moléculas da classe II de MHC jogam um papel importante na abundância de determinadas bactérias. Em suma, este protocolo simples e detalhado ajudará os pesquisadores que são novos no campo do microbioma, bem como aqueles que necessitam de atualizações sobre os métodos para alcançar maior resolução taxonômica.
Figura 1: fluxograma do sequenciamento do microbioma intestinal. Todas as etapas do sequenciamento de microbioma (coleta de amostras para análise de dados de microbioma) são exibidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: amplificação do gene 16S rRNA e análise de controle de qualidade da região v3-v4. (A) imagem de eletroforese de gel de agarose representativa do amplicon 16s (PCR1, tamanho 550 BP) e PCR indexada (PCR2, tamanho = 630 BP) de camundongos ae. ko (faixas 1 – 3 e 7 – 9) e camundongos transgênicos HLA-DQ8 (faixas 4 – 6 e 10 – 12). (B) imagem de gel representativa do amplicon 16s (PCR1, tamanho = 550 BP) e PCR indexada (PCR2, tamanho = 630 BP) de camundongos ae. ko (faixas 1 – 3 e 8 – 10) e camundongos transgênicos HLA-DQ8 (faixas 4 – 7 e 11 – 12) resolvidos por eletroforese. (C) o electroferograma representativo do amplicon 16s (PCR1) mostrou uma região máxima que contem os fragmentos que foram feitos medida ~ 550 BP. (D) o electroferograma representativo da PCR indexada (PCR2) mostrou uma região máxima que compreende dos fragmentos feitos medida ~ 630 BP. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: perfil de qualidade de leituras de encaminhamento (R1, superior) para duas amostras representativas e leituras inversas correspondentes (R2, inferior) para as mesmas amostras. A análise foi realizada por meio de um pipeline DADA2, no qual o eixo x mostra o comprimento de leitura (0 – 300 bases) e o eixo y mostra a qualidade das leituras. A linha verde representa o escore de qualidade mediana, enquanto a linha laranja representa quartis da distribuição da Pontuação de qualidade em cada posição base. As leituras de encaminhamento (R1) sempre mostraram melhor qualidade do que as leituras inversas (R2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: medidas de diversidade alfa (diversidade de Shannon) de camundongos ae. ko e camundongos transgênicos HLA-DQ8. Cada ponto representa a diversidade α (diversidade de Shannon) em uma amostra de um único mouse. A diversidade de Shannon foi mais baixa para camundongos AE. KO em comparação com camundongos transgênicos HLA-DQ8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ordenação com parcela de análise de dimensão baseada em mínimos quadrados. A trama mostra uma separação clara entre camundongos AE. KO e camundongos transgênicos HLA-DQ8. Cada ponto representa a composição bacteriana dentro de uma amostra, e os eclipses pontilhados indicam 80% de intervalos de confiança. As parcelas de PLS-DA foram geradas usando METAGENassist. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: camundongos ae. ko mostrando comunidade microbiana distinta em comparação com camundongos transgênicos HLA-DQ8, com ausência de bactérias específicas em camundongos ae. ko. (A) mapa de calor combinado com agrupamento hierárquico aglomerativo mostrando a abundância relativa de bactérias (nível de gênero). (B) parcela de caixa mostrando uma abundância relativa normalizada de duas bactérias representativas (Bilophila e rikenella) em camundongos transgênicos ae. ko e HLA-DQ8. Ambas as parcelas foram geradas usando METAGENassist. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: retrato representativo da caixa divisória para a coleta de amostras fecais de camundongos múltiplos de cada vez. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar 2: DADA2 R-script para gerar a tabela da abundância das seqüências cruas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 3: Tabela de abundância representativa do gênero (formato CSV). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 4: Arquivo de mapeamento representativo (formato CSV). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo descrito é simples, com etapas fáceis de seguir para executar o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica de 16s rRNA de um grande número bioespécimes do interesse. O sequenciamento da próxima geração transformou estudos de ecologia microbiana, especialmente em modelos de doenças humanas e pré-clínicas31,32. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de analisar com sucesso composições microbianas complexas (micróbios cultiváveis e não-culturáveis) em um determinado bioespécime em um nível de alta taxa de transferência e a um custo baixo32. No entanto, vários fatores (ou seja, efeitos de lote, seleção de primers para o gene 16S rRNA e análise de dados de sequência) permanecem um grande obstáculo no uso generalizado desta tecnologia.
Avançado 16s rRNA-based miseq sequenciando tecnologias (2x300bp)33 permitir sequenciamento de ~ 600 nucleotídeos fora do 1.500 nucleotídeo-longo 16s rRNA gene de bactérias, que superou o gargalo anterior de seqüenciamento curto leituras. Os primers específicos para uma região diferente de rRNA, como V1 – V2, v3 – V5 ou V6 – V9, podem ser usados com cada primers específicos da região, mostrando algum viés para a detecção mais ou menos de taxa particular34,35. Alguns grupos preferem a região V1-V221, que mostra um viés aumentado para Clostridium mas subdetecção para determinadas espécies de Bacteroidetes . Em contrapartida, outros grupos preferem as regiões v4, v3 – v4 e v3 – V5, que demonstram a classificação menos tendenciosa dos táxonsbacterianos 15,20,36,37.
O presente protocolo utiliza primers específicos para as regiões v3 – v4 do gene 16S rRNA, pois abrange a região mais longa do rRNA 16S com duas regiões hipervariáveis (v3 e v4) em comparação com a V4 isoladamente. Adicionalmente, o amplicon específico v3-v4 permite fundir das leituras para diante (R1) e reversa (R2), conduzindo a uma melhor definição da classificação bacteriana. Embora a região v3-V5 forneça leituras mais longas e cubra regiões mais hipervariáveis (v3, v4 e V5), é desafiador mesclar as leituras de R1 e R2 devido a não/pouca sobreposição de regiões entre as leituras de R1 e R2. Portanto, vários estudos utilizaram dados apenas de leituras R1 para classificação bacteriana ao executar o sequenciamento metagenomico 16S rRNA usando a região v3 – V514.
O armazenamento e a manipulação apropriados do bioespécime são críticos para a análise do microbioma para impedir a degradação do ADN bacteriano ou da contaminação ambiental38. O armazenamento a longo prazo do bioespécime em RT ou em 4 ° c pode conduzir ao overgrowth de determinadas bactérias ou fungos. As amostras podem ser congeladas imediatamente ou transportadas a 4 ° c (durante 1 – 3 dias), depois congeladas. O bioespécime também pode ser armazenado diretamente em conservantes, como solução de estabilização de ácido nucleico (por exemplo, RNA-mais tarde), 95% de etanol ou um kit de armazenamento comercial. O consenso geral é que qualquer um desses métodos de armazenamento não causa diferenças significativas nos perfis de comunidade bacteriana39,40. Embora uma solução com conservantes permita o armazenamento e o transporte em RT, estas amostras não podem ser usadas para ensaios RNA-baseados, análises do metabolito, ou experimentos de transplantação fecal. Estas edições foram discutidas em detalhe em outra parte39,40.
Uma das etapas críticas neste protocolo é o uso de um método baseado no cordão para o rompimento mecânico de bactérias gram-positivas e Archaea. Um estudo mais adiantado mostrou a diversidade bacteriana a mais elevada usando o método grânulo-batendo-baseado comparado a outros métodos do lysis da pilha41. Uma lise bacteriana incompleta ou contaminação durante a extração de DNA pode introduzir viés no intestino microbioma dados42. Outro ponto importante a ser considerado é a contaminação por reagentes laboratoriais incluídos nos kits chamados kitome43,44,45. Amostras com grande biomassa e rica diversidade bacteriana, como solo ou fezes, mostram menos desses problemas em comparação com amostras com menor biomassa, como a pele. Portanto, um controle de extração de água deve ser incluído em cada extração e processado com outras amostras para identificar a introdução de contaminação potencial devido à extração de DNA43,44,45.
Na análise do microbioma, a diversidade dentro de uma amostra pode ser medida pela diversidade alfa, uma medida da riqueza de espécies, ou a diversidade beta, que estima as dissimilaridades entre amostras/grupos. Métodos populares para medir a diversidade α incluem a UniFrac (ponderada e não ponderada) associada a técnicas estatísticas multivariadas, como a análise de coordenadas principais (PCoA) ou a dissimilaridade de Brey-Curtis. Embora a UniFrac seja baseada em distâncias filogenéticas, a análise de dissimilaridade de Brey-Curtis utiliza a abundância bacteriana para gerar parcelas. Em descrições de profundidade sobre α-e β-diversidade iare discutido em outros lugares30,46,47. Vários métodos estatísticos podem ser utilizados para comparar as diferenças entre as comunidades microbianas entre os grupos14,48. É aconselhável usar valores de p ajustados em vez de valores-p brutos para corrigir vários testes14.
Há uma variedade de software de Bioinformática para analisar dados de sequenciamento direcionados de forma independente49. O protocolo proposto usa pacotes de software de código aberto baseados em R, que permite a criação de perfil amigável e rápida de táxons bacterianos através de pipelines baseados em R DADA2. A tabela da abundância gerada de DADA2 pode ser usada para a análise a jusante usando phyloseq e METAGENassist. DADA2 pipeline é vantajoso sobre QIIME porque não requer recursos especiais (ou seja, instalação de máquinas virtuais ou contêineres do Docker), que necessitam de recursos computacionais relativamente grandes e especialização técnica especial. Especialmente para iniciantes para a análise 16S, R é atraente, como é gratuito e permite aos usuários tirar proveito de tutoriais on-line acessíveis e scripts de análise que são fáceis de executar. É importante ressaltar que essas ferramentas de análise exigem recursos computacionais relativamente pequenos e podem ser executadas em uma plataforma baseada em PC, Macintosh ou Linux. Adicionalmente, o METAGENassist pode usar tabelas de abundância geradas a partir de pipelines DADA2, bem como arquivos de matriz de observação biológica (BIOM) gerados a partir de QIIME/MG-RAST para realizar análises como PCA, análise discriminante de quadrados mínimos parciais (PLS-DA), parcelas do vulcão, testes t(comparando dois grupos), ANOVA (comparando três ou mais grupos), gráficos de mapa de calor, análise de floresta aleatória, etc. METAGENassist foi encontrado ser muito fácil de usar.
Em resumo, este protocolo descreve um pipeline de perfilamento metagenômica de 16s rRNA simples, com um guia detalhado na coleção da amostra, na extração do ADN, na preparação metagenômica da biblioteca, em arranjar em seqüência em Illumina miseq, e na análise de dados user-friendly usando livremente plataformas disponíveis (i.e., DADA2, phyloseq e METAGENassist). Embora o perfilamento taxonômico metagenômica 16s rRNA-baseado seja de confiança para a caracterização das bactérias atuais nos bioespécimes particulares, arranjar em seqüência metagenômica da espingarda pode ser uma aproximação melhor para a análise metabólica detalhada da via e a estirpe-específica identificação bacteriana.
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Disclosures
A. M. recebeu royalties da Mayo Clinic (pago pela Evelo Biosciences) como um dos inventores de uma tecnologia reivindicando o uso de Prevotella histicola para o tratamento de doenças auto-imunes.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o financiamento do NIAID/NIH (1R01AI137075-01), o Carver Trust Medical Research Initiative Grant, e do centro de pesquisa de ciências ambientais de saúde da Universidade de Iowa, NIEHS/NIH (p30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
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