用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

摘要

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8 T细胞并在体外扩增这些细胞的实验方案，旨在获得大量具有功能的T细胞，用于体外和体内实验。

摘要

1型糖尿病（T1D）的特征是胰岛特异性自身免疫反应，导致β细胞破坏以及胰岛素分泌的绝对缺失。在自发性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中，胰岛素是主要的自身抗原靶点，通过基因操作去除该动物模型中单个关键的胰岛素表位即可预防疾病发生。因此，选择性清除携带这一致病性表位的专业抗原呈递细胞（APCs），是一种抑制异常胰岛素特异性自身免疫反应的策略，且可能具有更高的转化应用潜力。

嵌合抗原受体（CAR）可引导T细胞选择性地靶向致病性抗原。该技术是近年来利用细胞工程进行过继性细胞治疗以治疗多种癌症的核心方法。在本方案中，我们描述了一种优化的T细胞逆转录病毒（RV）转导及体外扩增方案，该方案可从少量初始T细胞出发，高效生成大量具有功能的抗原特异性CD8+ CAR-T细胞。此前已有多种CAR-T细胞制备方案被报道，但通常存在转导效率相对较低以及转导后细胞存活率不理想的问题。相比之下，本方案可实现高达90%的转导效率，所获得的细胞在体内可存活超过两周，并在单次输注后显著延缓疾病的发生。我们对细胞维持和转导的详细步骤进行了说明，以便关键操作能够被清晰、准确地执行。从原代细胞分离到CAR表达的整个流程可在14天内完成。该通用方法可应用于任何已知靶点的鼠类疾病模型。同样，本方案的具体应用（靶向致病性肽段/MHC II类分子复合物）也可推广至其他已明确关键复合物的自身免疫性疾病模型。

引言

鉴于抗原特异性免疫疗法（ASI）可能降低非靶向效应的风险，其在治疗如1型糖尿病（T1D）等自身免疫性疾病方面具有广阔前景。越来越多的证据表明，针对（前原）胰岛素的免疫反应在T1D中可能尤为重要¹。在过去十年中，包括我们团队在内的多个研究小组的研究结果强烈提示，由特定MHC II类分子呈递的包含胰岛素B链第9至23位氨基酸的表位（B:9-23/MHCII）在小鼠和人类T1D的发生发展中起着重要作用^2,3,4,5。为了特异性靶向B:9-23/MHCII复合物，我们开发了一种单克隆抗体mAb287，该抗体不与胰岛素激素本身或其他肽段组成的复合物发生交叉反应⁶。mAb287可在体外阻断抗原呈递，每周向糖尿病前期NOD小鼠注射mAb287可使35%的治疗小鼠延缓T1D的发生⁶。为了在体内阻断抗原呈递，通常需要频繁给药以维持较高的循环浓度。我们假设，可利用Ab287的高度特异性来重编程T细胞，从而为T1D提供更优的抗原特异性T细胞治疗策略⁷。

据....

方案

小鼠在转基因小鼠设施中按照特定病原体阴性条件进行饲养，所有动物实验均依照贝勒医学院动物护理与使用委员会批准的方案进行。

注意：本实验需要同时进行病毒和T细胞的制备。表1总结了本实验方案。主要试剂和缓冲液列于材料表中。本方案重点在于生成和扩增靶向特定抗原呈递细胞（APC）群体的CAR-T细胞。

1. 单链Fab抗体（scFab）-CAR的构建与验证。

注意：CAR 通常包含三个关键结构域——抗原靶向结构域、间隔区/跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。每种 CAR 的具体设计取决于其预期靶标，因此，除与逆转录病毒生成相关的构建体关键特征外，本方案中不会详细描述这些设计。本研究所用 CAR 的整体设计如图1所示。简而言之，靶向结构域由亲本单克隆抗体的完整轻链以及重链的可变区和 CH1 结构域组成，二者通过一个半刚性连接肽相连；间隔区/跨膜结构域来源于小鼠 CD28；信号传导结构域则为包含小鼠 CD28、CD137（4-1BB）和 CD247（CD3ζ）元件的融合结构。这些元件可通过标准分子生物学方法（如拼接重叠聚合酶链式反应（PCR））或合成相应的“基因片段”进行组装。mAB287 CAR 构建的具体细节见 Zhang....

结果

通常，使用本方案的转导效率约为 ~60–90%。如图3所示，在分选前，约70%的CD8 T细胞共表达GFP，同时也共表达CD28和CD3（图3C）。重要的是，所有“实验组”GFP⁺细胞均与IA^g7-B:R3四聚体发生共染色，而不与对照四聚体结合（图4）。类似地，经分选的实验组和对照组CAR-T细胞仅在与表达相应配体的靶细胞共培养后，才分泌高水平的IFN-γ（图5）。这证实了转导后的细胞具有CD8效应T细胞表型，并特异性靶向亲本抗体所识别的抗原。

讨论

本方案描述了一种通过逆转录病毒转导高效生成抗原特异性CD8 CAR-T细胞的方法。本方案的转导效率通常较高，且一般可观察到CAR的稳定表达。扩增后的CAR T细胞保留了亲代活化T细胞的关键特性以及抗体特异性，适用于体外和体内实验。我们已将Ab-CAR CD8 T细胞应用于NOD小鼠1型糖尿病的重编程研究⁷。

本方案在先前描述的方法基础上进行了多项关键性改进。首先，我们采用了一种优化的T细胞培养基，可实现更长的激活时间。所述完全培养基含有多种关键添加剂的最佳浓度，能显著提高T细胞激活后的存活率和增殖程度。需要注意的是，小鼠IL-2可替代人源蛋白并获得相当的效果，但目前人IL-2更具成本优势。值得注意的是，使用激活40–48小时的T细胞进行转导，其转导效率显著高于仅激活24小时的细胞。

其次，我们采用了一种改进的转导方法，该方法去除了对T细胞有毒性的聚凝胺B（polybrene B），转而使用纤维连接蛋白（fibronectin），从而进一步提高细胞存活率。需要注意的是，为确保良好的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇（50 mM）	Gibco	21985-023	50 μM
5’ RACE PCR	Clontech	634859
抗小鼠 CD28 抗体	eBioscience	14-0281-86	终浓度为 1µg/ml
抗小鼠 CD3e 抗体	eBioscience	145-2C11	终浓度为 1µg/ml
生物素标记大鼠抗小鼠 IFN-γ	BD Biosciences	554410	工作浓度为 0.5 µg/ml
BSA	Sigma	A7030
无内毒素大提纯试剂盒（Endo-free Maxi-Prep kit）	Qiagen	12362
庆大霉素	Gibco	15750-060	终浓度为 50 µg/ml
热灭活胎牛血清（FCS）	Hyclone	SH30087.03	终浓度为 10% FCS
HEPES（100X）	Gibco	15630-080	1X
IAg7-CLIP 四聚体-BV421	Emory 大学 NIH 四聚体中心	按批准提供	工作浓度为 6 µg/ml
IAg7-胰岛素 P8E 四聚体-BV421	Emory 大学 NIH 四聚体中心	按批准提供	工作浓度为 6 µg/ml
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS 100x）	ThermoFisher	51500056	终浓度为 1x
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS 分离缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒	Miletenyi Biotec Inc	130-104-075
小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-104-075
Opti-MEM 培养基	ThermoFisher	31985070
青霉素-链霉素（5000 U/ml）	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Phoenix-ECO 细胞	ATCC	CRL-3214
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
pMIG II	Addgene	52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	52107
纯化大鼠抗小鼠 IFN-γ	BD Biosciences	551216	工作浓度为 3 µg/ml
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7767
RetroNectin	Takara	T100A	在 PBS 中工作浓度为 50 µg/ml
rhIL-2（储存浓度 105 IU/μl）	Peprotech	200-02	终浓度为 200 IU/ml
rmIL-7（储存浓度 50 ng/μl）	R&D	407-ML-005	终浓度为 0.5 ng/ml
RPMI-1640	Gibco	11875-093
无菌细胞筛	Fisher Scientific	22-363-548
Tryple	Gibco	12605-028