Summary
Burada sunulan bir protokol antikor özgüllüğünü test etmek için yetişkin bal arısı beyninde bir protein üretimini azaltmak için CRISPR-Cas9 sistemi kullanmaktır.
Abstract
Küme Düzenli Olarak Uzaydan Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) gen fonksiyonu çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir gen düzenleme tekniğidir. Bu çalışmada, haşere GABAA reseptör alt birimi Dieldrin direnç (RDL) ve metabotropik glutamat reseptör mGlutR1 (mGluRA) karşı geliştirilen antikorların özgüllüğünü kontrol etmek için bu yöntemi kullanın. Antikorlar tavşanlarda meyve sinerelerine özgü konjuge peptidlere(Drosophila melanogaster)ve bal arılarına(Apis mellifera)karşı üretilmiştir. Bu antikorları bal arısı beyinlerinde reseptörlerin dağılımını incelemek için bal arısı beyin bölümlerinde kullandık. Antikorlar peptide karşı saflaştırılmış ve immünoblotting ve peptid konjugat ile preadsorpsiyon klasik yöntem ile antikorlar karşı yetiştirilen karşı ilgili peptid konjugat özgü olduğunu göstermek için test edildi. Burada, ilgili reseptör için tasarlanmış kılavuz RNA'lar ile CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra beyindeki protein hedeflerinin 48 h azaltılmasını test etmek için CRISPR-Cas9 tekniğini geliştirdik. CRISPR-Cas9 yöntemi, bir veya birden fazla genin değiştirilmesi gerektiğinde yetişkin arılarda davranışsal analizlerde de kullanılabilir.
Introduction
Yakın zamanda keşfedilen CRISPR/Cas9 sistemi, çeşitli model sistemlerinde ve organizmalarda genomik DNA'yı değiştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. Genom modifikasyonunu önceki yöntemlere göre daha verimli ve sağlam hale getirerek biyomedikal araştırmaları ve önemli teknolojik atılımları hızlandırmıştır1. S. pyogenes bakterilere özgü olan sistem, aktivitesi DNA'da çift iplikli kırılmalara (DSB) yol açan cas9 enonukleazve Cas9 proteinini belirli, diziye bağlı bir konuma yönlendiren bir kılavuz RNA'ya (gRNA) dayanır2. CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan çift iplikli molalar homolog olmayan son birleştirme (NHEJ), frameshifts yol açabilir bir hata eğilimli bir süreç veya bir donör şablonu mevcut olduğunda homoloji doğrudan onarım yoluyla onarılabilir. GRNA kendisi bir hedefe özgü CRISPR RNA (crRNA) ve evrensel bir trans-aktive crRNA oluşur (tracrRNA) kimyasal olarak sentezlenebilir ve bir ribonükleoprotein kompleksi olarak saflaştırılmış Cas9 nükleaz ile teslim edilebilir (RNP)2,3. gRNA veya Cas9 nükleazının floresan etiketlemesi, moleküler bileşenlerin floresan mikroskopi ile algılanmasına ve hücre içi görselleştirilmesine olanak sağlayabilir4.
Mevcut çalışmamızda crispr-Cas9 sisteminden yararlanarak yetişkin bal arısı beyinlerindeki protein seviyelerini azaltıyoruz. Metabotropik glutamat reseptörü (mGluR) ve anti-mGlutR1 reseptör antikorları ve GABAA reseptör alt birimi RDL ve anti-RDL antikorları üzerinde çalıştık. Yetişkin bal arının beynindeki protein miktarını azaltmak için basit bir yöntem geliştirdik ve buna karşılık gelen proteinlere karşı geliştirilen antikorların ek testlerini yapmak için kullandık. CRISPR-Cas9 floresansının izlenmesi, proteinin azaltılmasında rol oynayan alanları ve hücreleri tahmin etmemizi sağladı.
Bu yöntemi kullanarak, biz de konjuge peptid karşı tavşan yapılan anti-mGlutR1 antikorlar karakterize. Bal arısı genomu yüksek derecede korunmuş AmGluRA kodlar (NCBI adlandırma göre mGlutR1 adlı) metabotropic glutamatreseptörü 5. Bal arısı mGlutR1 geni, NCBI veritabanına göre tahmin edilen dört splice varyantına sahiptir. Hem pupal hem de erişkin arı evrelerinin merkezi sinir sisteminde (CNS) ifade edildiği ve uzun süreli hafıza oluşumunda rol aldığıbildirilmiştir 5. mGlutR1'e karşı geliştirilen antikorlar bal arılarında öğrenme ve hafıza sürecinde glutamaterjik sistemin incelenmesi için gerekli bir araç olabilir.
Çalışmalarımızda, Apis mellifera RDL reseptör alt ünitesinden konjuge peptidler ile aşılanmış tavşanlarda geliştirilen anti-RDL antikorlarını da karakterize ettik. Bal arısı Rdl geni AmRdl (XM_006565102.3, NCBI veritabanı), 14 tahmin edilen splice varyantları vardır. NCBI veritabanı AF094822.1'de kısmen klonlanmış bir parça bildirilmiştir. RDL reseptör fonksiyonu ve fizyolojisi iyi böcekler de çalışılır6,7,8, bal arıları dahil9,10,11. Anti-RDL karşı geliştirilen antikorlar bal arılarında öğrenme ve hafıza sürecinde GABAerjik sistemi incelemek için önemli bir araç olabilir.
Ahtapotamin ve tiramin reseptörlerinin rolü üzerinde daha önceki bir çalışmada RNAi Batı leke tarafından protein miktarının sonraki bir test ile beyne enjekte kullanılan12,13. Ancak, RNAi bazı önemli sınırlamalar vardır. RNAi enjeksiyonundan sonra protein indüksiyonunun oluştuğu sadece kısa bir zaman dilimi vardır13. CRISPR-Cas9 bal arısı embriyolarında çok yakın zamanda tüm hayvan14,15,16genleri silmek veya değiştirmek için kullanılmıştır. Biz yetişkin bal arısı protein miktarını azaltmak için CRISPR-Cas9 kullanımını bildirdi. Biz kontrollü laboratuvar koşulları altında öğrenme ve bellek davranışsal çalışmalara çift yeteneği nedeniyle bal arıları için bu yaklaşımı geliştirdi17.
Bu çalışmada, iki reseptöre karşı antikorlar geliştirdik ve protein CRISPR-Cas9 enjeksiyonu ile azaltıldıktan sonra yetişkin bal arısı beyin bölümlerinde test ettik. Aynı zamanda, davranışsal deneyler için yöntemin kullanılmasına olanak sağlayan deneysel bir tasarım oluşturduk.
Protocol
Burada açıklanan protokol Arizona State Üniversitesi'nin hayvan bakım yönergelerine uyar.
1. Apis mellifera Beyinlerinden Toplam Protein İzolasyon
NOT: Bu deney için bilinmeyen yaş Apis mellifera Yeni Dünya Carniolan foragers kullanın.
- Forager arılar yakalamak için kovan girişine alüminyum örgü ekran yerleştirin17. Her bir kap küçük bir delik ile bir şişe her arı yakalamak. Vücut ısılarını düşürmek ve hareketsiz hale getirmek için arıları buza yerleştirin. Arıları en fazla 3 dakika buzda bırakın.
- Hareketsiz arıları önceden hazırlanmış metal tutuculara sabitle. Metal tutucuların arının küçük koli bandı parçalarıyla sabitlenebilmesi, ancak yine de arka göğüs kafesi, kanatları ve başı açıkta kalması için inşa edildiklerinden emin olun.
DİkKAT: Arıların tutuculara yerleştirmeye çalışmadan önce tamamen hareketsiz hale gelmelerini sağlayın. - Arıları 5 mL şırınga kullanarak 1 M sakaroz çözeltisi ile besleyin. Nemli bir ortam sağlamak için ıslak kağıt havlu ile bir kutu içinde güvenli arılar yerleştirin.
- Barraquer Iris makası ile başı keserek arının beynini hızla inceleyin (Malzeme Tablosu'nabakın) ve başı önden açmak için makas kullanın.
- Beyni kafa kapsülünden kesin, #5 forceps ile beyni alın ve 100 μL soğuk (4-8 °C) lysis tamponuna yerleştirin. Lysis tamponu 120 mM Tris-HCl, %2 sodyum dodecyl sülfat (SDS), %5 gliserol, 0.2 mM dithiothreitol, %1 Triton X-100 ve 1-5 μg/mL proteaz inhibitörleri PMSF (fenilmethylsulphonylfluoride), aprotinin, benzamidin (pH 6.8) 4 °C.'de. Yaklaşık 2 dakika boyunca bir pestisit çevirerek lysis çözeltisi beyin homojenize.
- Numuneyi 12.000 x g'de 20 dk. Süpernatantın 90 μL'lik aspire edin ve peletini atın.
- Bir florimetre kullanarak toplam proteini quantitate için supernatant 1 μL alın. Toplam proteinin yaklaşık konsantrasyonu arı başına 2-3 mg/mL arasındaydı. Supernatant 10 μL alın ve 10 μL lysis tampon ve 10 μL 6x Laemmli tampon18ekleyin. Kısa bir süre spin ve 3 dakika kaynatın, sonra buz üzerinde soğutun. Tüm enkaz kaldırmak için 1 0.000 x g 1 dakika spin. Arı beyninin onda biri yaklaşık 25 ng toplam protein içerir.
2. Batı Lekelenme19
- 12,15 mL ultra saf distile su içeren %10 çalışan jelin 30 mL'sini yapın, 7,5 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,3 mL %10 SDS, 10 mL %30 akrilamid-bis akrilamid çözeltisi, 0,15 mL %10 amonyum persülfat (APS) ve 20 μL tetrametiletilenedamin (TEMED ).
- Jeli, boşluklar tarafından ayrılmış iki cam plaka arasına atın.
- 12,1 mL ultrasaf distile su, 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 5,0 mL, %10 SDS'de 0,2 mL, akril-bis akrilamid 2,6 mL, 0,1 mL %10 APS ve 20 μL TEMED içeren 20 mL istifleme jeli yapın.
- Çalışan jel katılaşmadığında bir istifleme jeli dökün. Dikkatlice kabarcıklar kaçınarak, yükleme şeritdöküm için plastik ayırıcı ekleyin. Jel katılaştırınakadar 15-30 dk bekleyin.
- Jeli 5 μL protein standardı kullanarak yüklemeye başlayın. Bir arı beyninin ~1/15'ine veya şerit başına toplam proteinin ~16 ng'sine karşılık gelen, şerit başına 1,8 adımdan lysate karışımının 20 μL'sini yükleyin. Örnekleri istifleme jelinde 16 mA'da 3,5-4 h toplam, çalışan jelde ise 32 mA'da çalıştırın. Boya jelden çıkınca dur.
- Proteinleri transfer tamponunda nitroselüloz membranlara (25 mM Tris-HCl, 192 mM glisin, %15 metanol) 0,45 mA'da 4 °C'de 1 saat 30 dakika boyunca aktarın.
- İmmünblotlamadan önce SDS-PAGE'den sonra protein transferinin verimliliğini değerlendirmek için Ponceau S boyama solüsyonu ekleyin (suya 0.1 g Ponceau S ve 5 mL asetik asit ekleyin ve 100 mL'lik son hacmine asetik asit ekleyin). 4 °C'de 1 dakika saklayın ve distile su yla hızla durulayın.
- Her şeridi bir tükenmez kalemle etiketleyin, beyin homojenve protein belirteci ile bir şerit içeren iki şeritli membranı kesin ve her birini Batı lekeli kuluçka kutusuna yerleştirin. % 0.1 Ara 20 (PBS-Tw) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) 5 dakika her yıkama.
- Membranı %10 NGS (1 mL'den 10 mL'ye kadar normal keçi serumu ile 10 mL PBS-Tw) batılı bir leke kuluçka kutusunda 1 saat boyunca bloke edin. Anti-RDL1 ve anti-RDL2 seyreltmeleri (her biri 10 mL'lik 10 mL'de 5 μL antikor). Her kutudaki blokaj çözeltisini seyreltilmiş antikorlarla değiştirin ve geceleyin (16-24 saat) 4 °C'de bırakın.
- Membranı 5 dakika boyunca PBS-Tw'da 5 dakika yıkayın. Membranı 1:10.000'de %10 NGS PBS-Tw'da anti-tavşan IgG KONjuge ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. PBS-Tw'da 3x, PBS'de 1x'i yıkayın.
- Batı kemilüminesans HRP substrat kullanarak bantları tespit edin. RT'de 1:1 (v/v) iki substratı karıştırın, tüm membranları aynı kutuya koyun ve RT'de 2 dakika (kırmızı ışıklı karanlık bir odada) için substrat karışımıyla kaplayın. Genellikle bir antikor iki veya üç şerit ve ağırlık marker ile bir şerit üzerinde beyin homojen aynı seyreltme içeren bir membran üzerinde test edilir.
3. İmmünositokimyasal Prosedürler
- İmmünsitokimya için bal arısı beyinlerini incelemek için bal arılarını buzda 30 s.'lik bir süre hareketsiz hale getirin. Arılar hareketsiz hale alındıktan sonra arının kafasını makasla ayırın ve başı PBS'de %4 paraformaldehit çözeltisi halinde yerleştirin. Duman kaputunun altında çalış.
DİkKAT: Karın hala decapitation sonra sokabilir çünkü vücut dikkatle bertaraf edilmelidir. - Dikkatle ama hızlı bir şekilde anten, bileşik gözleri kaldırmak ve Barraquer Iris makas ile üst dış iskelet etrafında tüm kesti. Kafaları 10 dakika boyunca fiksatif çözelti içinde oturup izin verin. Başın dış iskeletgeri kalanı çıkarın ve kalan tüm trakea kesti.
- Her beyni en az 1 mL 4 paraformaldehit çözeltisi içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve gece boyunca 4-8 °C'de bırakın.
- Erlenmeyer şişesinde 3,8 g agarose ve 50 mL distile suyu karıştırarak %7,6 agarose çözeltisi yapın. Mikrodalga agarose sıvılaştırın kadar çözelti.
NOT: Isıtma sırasında agarose çözeltisinin taşmasını önlemek için şişenin açılışına küçük bir kağıt parçası konulabilir. - Sabit bal arısı beyinlerini (3-4 beyin) 35 mm Petri kabına yerleştirin ve kağıt mendil ile aşırı fiksatifi çıkarın. Beyin üzerinde sıvı agarose çözeltisi dökün. Anten lobları yukarı bakacak şekilde beyinleri agarose'a yönlendirin. Agarose soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
- Agarose katıldıktan sonra, her biri beyin içeren agarose bloklarını kesip kesin.
- Vibratom kesitiçin, her bir kuyu alt kısmında hidrofobik örgü ile bir sepet içeren bir 24 iyi plaka hazırlamak. Her kuyuya 600 μL PBS doldurun.
- Vibratome makinesini kullanarak her bloğu 70 μm'lik kesitlere kesin ve PBS içeren bölümleri sepete yerleştirin.
NOT: Aynı beyinden bölümlerin aynı sepete yerleştirildiğinden emin olun. - Bölümlerde fiksatif kalmamasını sağlamak için beyin kesitlerini 10'ar dakika boyunca PBS-TX ile yıkayın. Çok kuyulu plakayı orbital shaker'a yerleştirin ve beyni 210 rpm'de yıkayın. Her yıkamadan önce PBS-TX çözeltisini taze PBS-TX solüsyonuile değiştirdiğinden emin olun. Son yıkama sırasında % 1 normal eşek serumu ile blok.
- Anti-mGlutR1 primer antikortest etmek için, 15 mL santrifüj tüpe 80 μL anti-mGlutR1 antikorlarına 9 mL PBS-TX ekleyerek anti-mGlutR1 antikorlarının 1:112 seyreltilmesini hazırlayın. Girdap tüp kısaca iyice karıştırmak için. Antikorların çalışma seyreltilmesi ön deneylerde tespit edilmiştir.
- Anti-RDL primer antikortest etmek için, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 30 μL anti-RDL peptid 1, 30 μL anti-RDL peptid 2 ve 6 mL PBS-TX ekleyerek 1:100 anti-RDL antikor seyreltme hazırlayın. Girdap tüp kısaca iyice karıştırmak için. Antikorların çalışma seyreltilmesi ön deneylerde tespit edilmiştir.
- Plakadaki her kuyuya 800 μL antikor çözeltisi ekleyin. Çok kuyulu plakayı kapatın ve ışığa maruz kalmanın bozulmasını önlemek için alüminyum folyoya sarın. Bir orbital shaker üzerinde alüminyum folyo sarılı plaka yerleştirin ve 2 saat için 210 rpm sallayın. Sonra titremeden RT gecede bırakın.
- Beyin bölümleri bir gecede bırakıldıktan sonra PBS-TX ile 10 dk. Yıkama adımını 6kat tekrarlayın.
- 9 mL PBS-TX'e 40 μL ikincil antikor ekleyerek ikincil antikorları (eşekten anti-tavşan) 1:225 ikincil antikor seyrelterek hazırlayın.
- Her kuyuya 800 μL ikincil antikor seyreltme ekleyin. Plakayı kapatın ve alüminyum folyoya sarın. Orbital shaker üzerinde alüminyum folyo sarılı plaka yerleştirin ve 2 saat için 210 rpm sallayın. O zaman bir gece de RT'de bırak.
- Beyin kesitlerini her biri 10 dakika boyunca PBS-TX ve 3x normal PBS solüsyonu ile yıkayın.
- Slaytlara bölümleri yerleştirmek için Rodriguez ve ark.20'denmodifiye edilmiş montaj ortamı/gliserol katıştırma çözeltisini hazırlayın. 20 mL PBS'de 5 g montaj ortamı ekleyin ve manyetik karıştırıcı ile 16 saat karıştırın. Gliserol 10 mL ekleyin ve manyetik karıştırıcı ile başka bir 16 saat karıştırın. 4.000 x g15 dakika santrifüj, sıvı homojen supernatant almak ve 1 mL tüpler aliquot. -20 °C'de tutun
- 3.17 adımda hazırlanan montaj ortamının bir damlası ile bölümleri slaytlara yerleştirin ve her slaytın bir beyinden kesitler içerdiğinden emin olun.
- Konjuge peptidler ile immünboyama preadsorpsiyon kontrolü
- Anti-RDL ve konjuge peptidler için, anti-RDL antikorlarının çalışma seyreltme ile ilgili peptid konjuge gecede RT shaker: durum 1) 500 μg peptid Anahtar deliği Limpet Hemocyanin ile konjuge (KLH) glutaraldehit yoluyla; koşul 2) herhangi bir eşlekap olmadan.
- 10.000 x g 10 dakika için her karışımı santrifüj ve her iki koşul (adım 3.19.1) supernatant toplamak.
- Bal arısı beyninin seri bölümlerini her bir süpernatant ile kuluçkaya yatırın ve yukarıda açıklanan ikincil antikorlarla işlem edin. Seri kesitler vibratom kesiti işlemleri sırasında birbirini takip eden bölümlerdir, bu nedenle beynin aynı kısmı pozitif ve negatif kontrollere maruz kalır.
- Anti-mGlutR1 ve konjuge peptid için, 10-4 M peptid içeren KLH konjuge peptid (durum 1) ve herhangi bir konjuge olmadan RT anti-mGlutR1 antikorların çalışma seyreltme inkübün (durum 2).
- 10.000 x g 10 dakika için her karışımı santrifüj ve her iki kontrolden supernatant toplamak.
- Bal arısı beyninin seri bölümlerini ikincil antikorlarla hem koşullardan hem de prosesten süpernatant ile inkübe edin (3.14-3.15. adım).
- Katıştırma ortamı (adım 3.17) kullanarak her iki koşuldan bölümleri slayta gömün.
4. İlgili CRISPR-Cas9 Sisteminin Enjeksiyonu Sonrası Bal Arısı Beyninde İmmünsitokimya ile RDL ve mGlutR1 Protein Ekspresyonunun Test Edilmesi (bölüm 3)
- Kılavuzları amrdl (XM_006565102.3) genomik DNA dizileri ve mGlutR1 (XM_006566244.3) dizileri kullanarak bir online CRISPR-Cas9 tasarım aracı21 kullanarak tasarla(XM_006566244.3) (Tablo 1). 5'in sonunda floresan boya ATTO550 ile Cas9 crRNA ve Cas-9 tracrRNA olarak sipariş edin. Cas9 Nuclease V3 siparişi (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Nükleaz içermeyen su kullanarak her kılavuz crRNA ve tracrRNA'nın 100 μM'lik stoğu yaparak bileşenleri CRISPR-Cas 9 sistemi için hazırlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın. Cas-9 çözeltisinin çalışma konsantrasyonunu, enjeksiyon için gRNA ve RNP'yi yapmak için 47,5 μL nükleotitsiz tampona 2,5 μL Cas 9 nükleaz V3 (10 mg/mL) ekleyerek hazırlayın.
- Her kılavuz RNA için gRNA karmaşık formasyonu ayrı ayrı hazırlayın (guideRNA:tracrRNAATTO550)
- GRNA adı ile bir test tüpü etiketleyin, 92 μL nükleotitsiz tampon, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 ve 4 μL kılavuz crRNA çözeltisi ekleyin. Yavaşça karıştırın ve döndürün.
NOT: RDL için gRNA tüplerinin etiketleme örneği: GRDL1, GRDL2, GRDL3 (Tablo 1'dekiRDL kılavuzlarıRNA'ya karşılık gelen). mGlutR1 için gRNA tüplerinin etiketleme örneği: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (Tablo 1). - Çözeltiyi 5 dk için 95 °C'ye ısıtın ve gRNA oluşturun. Karışımı RT'de 10 dk soğutun.
- GRNA adı ile bir test tüpü etiketleyin, 92 μL nükleotitsiz tampon, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 ve 4 μL kılavuz crRNA çözeltisi ekleyin. Yavaşça karıştırın ve döndürün.
- RNP kompleks oluşumu (gRNA: S.p Cas9Nuclease), dağıtım karışımları ve kontrol hazırlayın.
- RNP adı ile bir test tüpü etiketleyin, 6 μL gRNA çözeltisi ve 6 μL 0,5 g/μL S.p Cas9 Nuclease V3 ekleyin. Çözeltileri enjeksiyondan önce 10 dk boyunca 37 °C'de hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
NOT: RNP tüp etiketleri örneği: RRDL1, RRDL2, RRDL3. - Bir RNPRDLmix olun. Enjeksiyonlar için kullanılan son karışımı hazırlamak için RDL'den her RNP'nin 4 μL'sini birlikte ekleyin. RNP/RDL karışımı = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3.
- Bir RNPmGlutR1mix olun. Enjeksiyonlar için kullanılan son karışımı (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3'ü hazırlamak için mGlutR1'den her RNP'nin 4 μL'sini karıştırın.
NOT: RNP tüp etiketleri örneği: RMG1, RMG2, RMG3. - KılavuzRNA yerine 4 μL tracrRNA, 92 μL arabellek ve 4 μL su karıştırarak bir kontrol noguideRNA çözeltisi yapın (bkz. bölüm 4.3). Kontrol enjeksiyon çözeltisini üretmek için bu noguideRNA çözeltisinin 6 μL'sini ve 6 μL 0,5 g/μL Cas9 Nuclease V3'ü (adım 4.4.1) karıştırın.
- RNP adı ile bir test tüpü etiketleyin, 6 μL gRNA çözeltisi ve 6 μL 0,5 g/μL S.p Cas9 Nuclease V3 ekleyin. Çözeltileri enjeksiyondan önce 10 dk boyunca 37 °C'de hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
5. Enjeksiyon Prosedürü
- Her arıyı 1.3'te açıklandığı gibi hareketsiz hale getirin ve 1.4 adımdaki gibi besleyin. Daha sonra, iki tahta kutu iki set injekten sonra içine arılar serbest bırakmak için hazırlamak: beyaz bir kutu (deneysel durum) ve bir kara kutu (kontrol). Her kutu küçük bir tarak ve bir besleme Petri çanak içermelidir. Her kutunun bir tarafı gözlem için izin vermek için camdan yapılmıştır.
- Petri tabaklarını besle. 35 mm Petri kabının kapağını alın, yüzeyin içine balmumu yerleştirin ve Petri kabının alt kısmını balmumuüzerine yerleştirin. Plakayı kutuya sabitleyin.
- 5 mL şırınga kullanarak, kapağı ve yemeğin alt kısmı arasında 1M sakaroz çözeltisi enjekte edin. Arılar hızlı bir şekilde iki plaka arasında hortumları koyabilirsiniz ve 48 saat kuluçka süresi boyunca kuru kalacak. Her kutuya bir tabak koyun.
- Mikroenjeksiyon sistemini hazırlamak için, kılcal damarları hava kabarcığı olmadan mineral yağ ile doldurun. Kılcal damarları mikroenjeksiyon sisteminin enjektör tutucuya yerleştirin. Kapilleri istenilen enjeksiyon çözeltisi ile yüklemek için, düz bir yüzeye hidrofobik bir film yerleştirin ve çözeltiyi üzerine pipetleyin. Kılcal damarlardan yağ enjekte edin ve karışımı ilgili RNP karışımıyla değiştirin.
- Mikroenjeksiyon sistemini kullanarak, her arının median ocelli içine doğrudan 345 nL RNP karışım çözeltisi enjekte edin.
- RDL-CRISPR-Cas9 enjeksiyonu için, adım 4.4.2'de açıklandığı gibi hazırlanan RNPRDLmix ile sekiz arı enjekte edin. Enjeksiyondan sonra 1M sakaroz ile besleyin. Küçük tarak ile beyaz (deneysel) kutuiçinde bırakın ve 48 saat petri çanak besleme.
- mGlutR1 CRISPR-Cas9 için, adım 4.4.3 açıklandığı gibi hazırlanan RNPmGlutR1mix ile dokuz arı enjekte. Kontrol için, adım 4.4.4'te açıklandığı gibi hazırlanan kılavuzsuz (RNAmix_noguide) olmadan sekiz arıya RNA karışımı enjekte edin. Enjeksiyondan sonra 1M sakaroz ile besleyin. Bölüm 5.1'de açıklandığı şekilde arıları sahiplerinden beyaz kutuya (deneysel durum) veya kara kutuya (kontrol) bırakın.
- Kutuları nem için ıslak kağıtiçeren polistiren bir kapta yerleştirin. 48 saat arılar bırakın ve yeterli gıda ve iyi nem olduğundan emin olmak için günde 2x gözlemleyin.
- Bölüm 3'te açıklandığı gibi 48 saat (adım 3.1) ve immünositokimya için süreç sonra her arının beyin diseksiyon. Anti-mGlutR1 immünboyamaiçin adım 3.11 ve anti-RDL immünostainings için adım 3.12 kullanın.
- Bağışıklık-lekeli beyin bölümlerinde floresan düzeyini değerlendirmek için konfokal görüntüleme gerçekleştirin.
- İmmün etiketli beyinlerde proteinin azstresini değerlendirmek için, hem kontrol hem de enjekte edilen beyinler için aynı kazanç düzeyinde konfokal görüntü koleksiyonunu kullanın.
6. CRISPR Cas9 RNPRDLmix Enjeksiyonundan Sonra Modifiye Genomik RDL DNA 48 H'yi Değerlendirmek için qPCR tabanlı Bırakma Testi
- CRISPR-Cas9 enjeksiyonu ile modifiye edilen DNA miktarını değerlendirmek için astarları, kontrol sondasını ve bırakma sondasını tasarla. Her astar en az bir CRISPR-Cas 9 kılavuzunu yanlar ve amplicon boyutu 132 bp olacak şekilde tasarlanmıştır. Kullanılan astar lar ve problar aşağıda verilmiştir:
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+C+CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA+C+G+T+CA+A+GT/3IABkFQ/- Astarların alana özgü benzersiz dizilere karşılık olduğundan emin olun. Bırakma sondasının RDL-CRISPR-Cas9 kılavuzuyla çakışan alan için tasarlandığından emin olun.
- Kılavuz alanında gDNA'da bir değişiklik olup olmadığını test etmek için, ocelli'ye adım 5.3.1'de tanımlanan RNP_RDL karışımı ile 12 arı enjekte edin ve sekiz enjekte edilmemiş arıyı kontrol olarak kullanın.
- Enjeksiyonlardan sonra optik loblar olmadan arı beyinlerini parçalara ayırın ve üreticinin protokolünü takip eden kiti kullanarak enjekte edilen her bir arı beyninin gDNA'sını ayıklayın ve (optik loblar olmadan) kontrol edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Çıkarılan gDNA'nın miktarını, kalitesini ve saflığını bir spektrofotometre kullanarak değerlendirin.
- QPCR tabanlı bırakma protokolü ve gerçek zamanlı PCR döngüsü kullanarak AmRDL'nin değiştirilmiş gDNA'sının göreli ifadesini ölçün.
- Oligoları 100 μM'ye geri alın, astarları 10 μM'ye, probları ise 5 μM'ye seyreltin.
- Bir gDNA numunesi için burada gösterildiği gibi 96 kuyu plakasında PCR reaksiyonunu ayarlayın (3 tekrar): 10 μL ana karışım (Malzeme Tablosunabakınız), 1 μL ileri astar, 1 μL geri dönüş probu, 1 μL kontrol probu, 2 μL gDNA (50 ng), 4 μL nükleazsız su hacmine son reaksiyonu getirmek için 20 μL.'ye ayarlayın.
NOT: Kontroller numuneler yerine çözelti, problar yerine su. - Bisiklet programını gerçek zamanlı PCR döngüsü için aşağıdaki gibi ayarlayın: 3 dk için 95 °C ve ardından 15 s için 95 °C'lik 40 devir, 1 dk için 60 °C.
- 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl gen modifikasyonu değerlendirmek, nerede
Ve
Ve
7. RNPRDLmix Enjeksiyonsonrası RDL RNA 48 H'nin Göreli Nicelliği
- RDL mRNA'da azalma olup olmadığını test etmek için, adım 5.3.1'de açıklandığı gibi RNP_RDL ocelli'ye 20 arı enjekte edin ve kontrololarak 12 enjekte edilmemiş arı kullanın. Arı beyinlerini (optik loblar olmadan) 48 saat sonra inceleyin, enjekte edilen her arıdan toplam mRNA'yı alın ve üreticinin protokolünü kullanarak ayırın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Dna içermeyen bir kit kullanarak örnekte kalan DNA kalıntısını çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Çıkarılan RNA'nın kalitesini ve saflığını bir spektrofotometre kullanarak değerlendirin.
- 384 kuyu plakası için üreticinin protokolünü kullanarak gerçek zamanlı PCR döngüsünde ticari olarak kullanılabilen floresan yeşil RT-PCR kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak AmRDL ifadesini ölçün.
NOT: Bu deneyde, daha önce yayınlanmış astarlar kullanılmıştır. AmRDL (GGTCGATGGGCTACTACCTG AmRDL_F için; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 ve bir referans geni olarak aktin astarlar [AmActin_F TGCCAACACTGTTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]23. Bağıl gen ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi (adım 6.6) kullanılarak hesaplandı.
8. QPCR Tabanlı bırakma Testi Modifiye Genomik DNA değerlendirmek için 48 H RNPmGlutR1mix Enjeksiyon sonra
- CRISPR-Cas9 enjeksiyonu ile modifiye edilen DNA miktarını değerlendirmek için astarları, kontrolü ve bırakma problarını tasarla. Astarları en az bir CRISPR-Cas 9 kılavuzunu yanlaştırabilecek şekilde tasarla ve amplicon boyutu 96 bp'dir.
mGlutR1_For: GGTGAAACGAACGACGGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA+CGA+GT/3IABkFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA+C+A+C+CG+TC/3IABkFQ/
NOT: Astarların değiştirilmesi gereken alana özgü benzersiz dizilere karşılık olduğundan emin olun. Bırakma sondası CRISPR-Cas9 kılavuzuyla örtüşen alan için tasarlanmıştır. - Kılavuz alanında gDNA'da bir değişiklik olup olmadığını test etmek için, adım 5.3.1'de açıklandığı gibi RNP_ ocelli'ye 12 arı enjekte edin ve kontrol olarak sekiz enjekte edilmemiş arı kullanın.
- Arı beyinlerini (optik loblar olmadan) 48 saat sonra inceleyin ve üreticinin protokolünü kullanarak her enjekte edilen her bir arı beyninden gDNA alın ve (optik loblar olmadan) arı beynini kontrol edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Çıkarılan gDNA'nın miktarını, kalitesini ve saflığını bir spektrofotometre kullanarak değerlendirin.
- QPCR bırakma protokolü kullanarak ve 6.5 adımda açıklandığı gibi gerçek zamanlı PCR döngüsü için gDNA AmGlutR1'in göreli modifikasyonunu ölçün.
- 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl gen modifikasyonu değerlendirmek, nerede
Ve
Ve
9. RNPmGlutR1mix Enjeksiyonsonrası mGlutR1 RNA 48 h'nin ölçülmesi
- mGlutR1 RNA mRNA'da bir azalma olup olmadığını test etmek için, adım 5.3.2'de açıklandığı gibi RNP_RDL ocelli'ye altı arı enjekte edin ve kontrol olarak altı enjekte edilmemiş arı kullanın. Arı beyinlerini (optik loblar olmadan) 48 saat sonra inceleyin, enjekte edilen her arıdan toplam mRNA'yı alın ve üreticinin RNA izolasyonu protokolünü kullanarak ayırın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Dna içermeyen bir kit kullanarak örnekte kalan DNA kalıntısını çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Çıkarılan RNA'nın kalitesini ve saflığını bir spektrofotometre kullanarak değerlendirin.
- 384 kuyu kiti için sağlanan protokol ile gerçek zamanlı PCR çevrimleyici üzerinde bir SYBR Yeşil RT-PCR kiti (Malzeme Tablosubakınız) kullanarak mGlutR1 ifadesini ölçün. MGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCCTTCATA; mGlut_R TGCCGTTGTGTGTTCCGATTT) ve referans geni [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG AmActin_F aktin astarlar için aşağıdaki astarları kullanın; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. 2-ΔΔCt yöntemini (adım 8.6) kullanarak bağıl gen ekspresyonunu hesaplayın.
Representative Results
Anti-RDL antikor testleri
Antikorlar Şekil 1A'dagösterildiği gibi RDL peptid konjugatlarına karşı üretildi. Anti-RDL antikorları karakterize ilk adım anti-RDL antikorları ve HRP etiketli keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor(Şekil 1A, eklemek) ile batı leke kullanarak arı beyninden çıkarılan proteinhomojen kontrol etmektir. Her iki anti-RDL antikorları ~ 50-60 kD (ok) bulunan bant tanıdı, RDL alt birim isoform proteinlerin tahmini ağırlığına karşılık. Anti-RDL antikorlarının beyin dilimlerindeki peptidi tanıdığını göstermek için bir pizsorpsiyon kontrolü kullandık (Şekil 1B,C). Antikorlar konjuge peptidlerle preincubated edildiğinde, kesitteki lekelenme yoktu. Bu, anti-RDL antikorlarının yetiştirildikleri konjuge peptidi tanıdığını göstermiştir. Anti-RDL antikorlarının sabit beyin dokusundaki proteini tanıdığını göstermek için hücrelerde RDL proteini üreten RDL genini yok etmek için CRISPR-Cas9 kullandık. Şekil 1D1-3,anti-RDL antikorları ile etiketlenmiş kontrol frontal arı beyin kesitleri gösterir. Bu arıRDL-CRISPR-Cas9 RNP enjekte edilmedi. Şekil 1D1'de,arı beyninin ön kısmında anti-RDL etiketleri nöropiller. Şekil 1D2'deki aynı frontal bölüm ATTO550'den floresan olmadığını göstermektedir, çünkü RDL-CRISPR-Cas9 kompleksi enjekte edilmemese.
Şekil 1E1-E3, RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen ve daha sonra Şekil 1D1-D3'tekikontrol beyniyle aynı miktarda antikor ile işlenen bir arının beyin bölümünü gösterir. Anti-RDL boyama enjeksiyondan sonra tüm beyinde 48 saat önemli ölçüde azaldı ve beyindeki ATTO550 boyama dağılımı(Şekil 1E2) arorta ocelli RDL-CRISPR-Cas 9 enjeksiyonlarının başarısını gösterir. Beynin birden fazla dağınık hücreleri ATTO550 sergiler. RDL-CRISPR-Cas 9'un başarılı enjeksiyonu, protein ekspresyonunu kontrole göre azaltmıştır(Şekil 1E1-3). Sekiz immünosül arı beyninden, sadece bir beyin mantar vücut hücrelerinde RDL-CRISPR-Cas9 dağılımı yüksek düzeyde vardı, protoerebrum, ve anten lob, diğer beyinler mantar vücut kalyx ATTO550 ile hücre boyama vardı ise, merkezi kompleks, ama anten lob değil. Bu arılarda, redüksiyon anti-RDL immünboyama şekil 1E1'degösterilen beyindeki kadar dramatik olmadığını belirtmek önemlidir.
Daha sonra, RDL-CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra arılar 48 h'deki modifiye RDL gDNA düzeyini tahmin etmek için, bırakma sondasının RDL gRNA'larından birinin alanına uyacak şekilde tasarlandığı bir qPCR bırakma testi gerçekleştirdik. Bu deneylerde, RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen arı beyinlerinde floresan'ın göreceli azalması örneklerdeki modifiye gDNA sayısına karşılık gelmektedir. Testlerimizde RDL-CRISPR-Cas9 enjekte edilen 12 arıda gDNA'da bu kılavuza karşılık gelen alan enjekte edilmeyen arılarda gDNA ile karşılaştırıldığında % 64 ± (ortalama ± %30 SD) idi(Şekil 3A).
Daha sonra, enjeksiyondan sonra 48 h arılarda RDL RNA düzeyini tahmin etmek için ayrı bir arı grubunda qRT-PCR uyguladık (Şekil 3B). RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen arıların RDL RNA düzeyini (n = 19) enjekte edilmedi arılarda RNA düzeyi ile karşılaştırdık (n = 12). Bu deneylerde mRNA RDL'nin bağıl azalması enjekte edilmeyen arılarda RNA düzeyine kıyasla %59 ± (ortalama ± %15 SE) idi. Her arıdaki RDL RNA düzeyini tek tek incelediğimizde, 19 arıdan sadece 13'ü RNA'da önemli bir azalma göstermiştir. Bu veriler, rdl-CRISPR-Cas9'un ocelli üzerinden enjeksiyonunun her zaman çok sayıda beyin hücresine ulaşamayabileceğini göstermektedir, bu da RDL immün lekeli RDL-CRISPR-Cas9 enjekte edilen arılarla ilgili verileri doğrulamaktadır. Bu preparatlarda, 8 arıdan sadece birinde rdl CRISP-Cas9 birçok beyin hücrelerinde (mantar gövdesi, protocerebrum ve anten lob) diğer arı beyinleri ile karşılaştırıldığında, RDL-CRISPR-Cas9 dağılımı protocerebrum (mantar vücut kaliks ve merkezi kompleks) hücrelerinde yoğunlaşmıştır ama anten lob(Şekil 4A-D)vardı.
Anti-mGlutR1 antikor testleri
Tavşanda üretilen anti-mGlutR1 antikorlarını Drosophila melanogaster'e özgü konjuge peptidlere karşı kullandık (Şekil 2A). Bu peptid in dizilimi arı peptidi (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Şekil 2Aile %94 kimlik gösterir. Önce immünoblotting kullanarak arı beyin proteinine karşı antikorları kontrol ettik. Arı beyin homojenate ile ayrılmış 10% SDS-PAGE ve elektroforetik bir nitroselüloz membran transfer ve anti-mGlutR1 ile lekeli. Şekil 2 A'daki kesici uç, iki isoform'a karşılık gelen tahmini ağırlıklara (103 ve 83 kD) sahip iki bant gösterir. Bu antikorları bal arısı beyinleri üzerinde test ettiğimizde, şekil 2B,D'degösterildiği gibi arı beyin bölümlerindeki nöropiler profilleri ve hücreleri etiketlediklerini bulduk. Konjuge-mGlutR1 peptid ile anti-mGlutR1 antikor preadsorpsiyon sonra, özel boyama arı beyin diliminde kayboldu(Şekil 2C). Bu, anti-mGlutR1 antikorlarının peptidi tanıdığını doğrular (Şekil 2C). Daha sonra median ocelli'ye mGlutR1-CRISPR-Cas9 karışımı enjekte ettik ve kontrol noguideRNA'sını kullandık. Kontrol arılarında (n = 7), ATTO550'den gelen floresan hücrelerde yoğunlaşmamıştır. Bazı beyinler dağınık floresan ATTO550 etiketleme vardı. Bu nedenle Şekil 2D1-3'teki kontrol hazırlığı beyinde anti-mGlutR1 boyamasını gösterir, ancak ATTO50 floresansını göstermez. mGlutR1-CRISPR-Cas9 ocelli içine enjekte edilip birçok hücre tarafından alındığında, fonksiyonel mGlutR1RNP'yi alan bölgede sekonder antikorların floresans seviyesi önemli ölçüde azaltıldı (Şekil 2E1-3). Arılar 48 saat boyunca izlendi ve her deneysel durumdan bir arı ölü bulundu. Böylece, bu deneyde, yedi kontrol arıları ve sekiz CRISPR-Cas9 arıkontrol. CRISPR-Cas9 enjekte edilen tüm arılarda mGlutR1-CRISPR-Cas9 içeren hücreler vardı. Bu hücrelerin çoğu mantar vücut kaliks, merkezi kompleks ve posterior protocerebrum idi. Yedi arıdan sadece ikisi mantar gövdesindeki, merkezi kompleksteki ve anten lobdaki birçok hücrede ATTO550 etiketi ni gösterdi. Bu arılardan birinin bir örneği Şekil 2E'degösterilmiştir. Bu preparatlarda mGlutR1 boyama düzeyinin azaltılması anlamlıydı. Diğer beş arının mantar gövdesinde ve posterior protocerebrum'da mGlutR1 CRISPR-Cas9'un başarılı bir şekilde teslim edilmesine karşılık gelen ATTO550 etiketlemesi vardır, ancak anten loblarında yoktur.
Daha sonra, enjeksiyondan sonra arılarda modifiye edilmiş mGlutR1 gDNA düzeyini tahmin etmek için, bırakma sondasının mGlutR1 kılavuzunun yakınındaki alanda olması için tasarlandığı qPCR tabanlı bırakma testi gerçekleştirdik. Bu deneylerde, mGlutR1-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen arı beyinlerinde, 12 arıda gDNA'nın göreceli modifikasyonu enjekte edilmeyen arılarda gDNA ile karşılaştırıldığında %59 ± (ortalama ± %33 SD) idi (Şekil 3A).
Bu sonuçlar aynı zamanda farklı bir arı grubunda qRT-PCR testleri ile doğrulandı, burada RNPmGlutR1mix(Şekil 3B)ile enjeksiyonlardan sonra arılarda 48 h'de qRT-PCR kullanarak mGlutR1 RNA düzeylerini tahmin ettik . MGlutR1-CRISPR-Cas9 enjekte edilen arıların mGlutR1 RNA düzeyini (n = 6) enjekte edilmedi arılarda RNA düzeyleri ile karşılaştırdık (n = 6). Bu deneylerde enjekte edilen arılarda mRNA mGlutR1'in bağıl azalması enjekte edilmemiş arılara göre %53 ± (ortalama ± %18 SE) idi (Şekil 3B).
Mantar gövdesinin Kenyon hücresinde RNP RDL-CRISPR-Cas9 ifade dört farklı arılar bölümü Şekil 4A-Dgösterilir . Mantar gövdesi ve anten lobda ATTO550 floresan örneği Şekil 4E,F'degösterilmiştir.
| Rehberleri | Dizi | gRNA | RNP |
| [kılavuzRNA:tracrRNA] | [gRNA:Cas9 Nükleaz] | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | GRDL1 | RRDL1 |
| RDL_Guide2 | AACGTCGATCGACTTGACGT | GRDL2 | RRDL2 |
| RDL_Guide3 | CCATGACGAAACACGTGCCC | GRDL3 | RRDL3 |
| mGlu_Guide 1 | CGAAAGTTATCTGACGGTGT | GMGL1 | RMGL1 |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAAGTTCAT | GMGL2 | RMGL2 |
| mGlu_Guide 3 | GCAAACGTCGGTAGGAGTGA | GMGL3 | RMGL3 |
Tablo 1: RDL ve mGlutR1için tasarlanmış kılavuzların nükleotid dizileri.
Şekil 1: Anti-RDL antikorlarının karakterizasyonu. (A) PEMBE dairelerin C-terminus'ta N-terminus ve peptid 1 (hücre içi CVRFKVVHDPKAHSKGGTL-amid) peptid 2 (hücre dışı CVNEKQSYFHIATSNEFIRI-amide) lokalizasyonunu gösterdiği RDL alt biriminin şeması. A eklemek bal arısı beyin özleri batı leke bantları gösterir karşılık gelen anti-RDL antikorları ile işlenmiş (bir anti-RDL pep1 ve anti-RDL pep2 ile). Her immünoblot , RDL alt birimlerinin çeşitli isoform tahmini ağırlıkları karşılık gelen protein ~ 50-60 kD görünür boyutunu gösterir. (B,C) Konjuge peptid 1 ile anti-RDL antikorlarının preadsorpsiyonu. C'deki görüntü, antikorların konjuge peptid 1 ile preinkre edildiğinde kesitteki lekelenmede azalma olduğunu göstermektedir. Fan şekilli gövde (Fb) ve Elipsoid cisim (eb) beyindeki merkezi karmaşık yapılardır. M = mantar gövdesimedial lob. (D1-3) Bir kontrol anti-RDL boyama, enjekte edilmemiş arı beyin bölümü sonra 48 h. Yeşil beyinde anti-RDL pozitif profili gösterir. (D2) Bu arı enjekte edilmedi ve ATTO550 floresan içermez. (D3) D1 ve D3'tenbirleştirilmiş görüntüler. (E1-3) RDL-CRISPR-Cas9 enjeksiyonu 48 saat sonra anti-RDL boyama azaltılmış (E2) HÜCRE çekirdeklerinde ATTO550 floresan başarılı RDL-CRISPR-Cas9 teslimat gösterdi. (E3) Anti-RDL (yeşil) ve ATTO550 (kırmızı) birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm (B-E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Anti-mGlutR1 antikorlarının karakterizasyonu. (A) Bağışıklama için kullanılan Drosophila melanogaster peptid gösteren GCPR mGluR şeması. Karşılaştırma için, Apis mellifera peptid aşağıda gösterilmiştir. Daire mGlutR1 reseptör ülerler bulabilen hücre dışı etki alanının N-terminusundaki peptitin lokalizasyonunu gösterir. A'daki ekleme, anti-mGlutR1 antikorlarının batıdaki arı beyinlerinin ~103 kD ve ~83 kD'sinde bilinen izoformların tahmini ağırlıklarına karşılık gelen iki bandı tanıdığını göstermektedir. (B,C) Anten lob glomeruli iki ardışık bölümlerinde anti-mGlutR1 antikor preadsorpsiyon kontrolü. C'deki anten glomerruli bölümündeki anti-mGlutR1 görüntüsü, anti-mGlutR1 antior ile anti-mGlutR1 peptidin preinküsyonu sonucu boyamanın azaldığını gösterir. Bu prosedür, antikor b ile karşılaştırıldığında boyama ortadan kaldırır çözelti, çökelti dışarı çökelti neden olur (kontrol, preinkülasyon peptid yokluğu). (D1) median ocellus bir kontrol enjeksiyonu sonra bir arı beyin diliminde anti-mGlutR1 boyama gösterir. Bu enjeksiyon CRISPR-Cas9 tarafından mGlutR1 reseptörlerinin yıkılmasını sağlayan mGlutR1 gRNA'dan yoksundu ve böylece anti-mGlutR1 antikorunun boyanması azaltılmamadı (yeşil). (D2) ATTO550 floresan yokluğu beyinde fonksiyonel CRISPR-Cas9 eksikliği gösterir. (D3) Anti-mGlutR1 ve ATTO550'nin birleştirilmiş görüntüleri. (E1-E3) median ocellus mGlutR1-CRISPR-Cas 9 ile enjeksiyondan sonra mGlutR1-CRISPR-Cas 9 ile enjeksiyondan sonra mGlutR1'in kalıcı olarak yere yığıldöldüğü bir beyin bölümünde anti-mGlutR1 boyamasını gösterir. Böylece, bu beyinde boyama büyük ölçüde birçok hücrede mGlutR1 başarılı nakavt nedeniyle azalır. (E2) Arı beyinlerinde birçok hücre çekirdeğinde ATTO550 boyama mGlut1-CRISPR-Cas 9 enjeksiyonunun başarılı olduğunu göstermektedir. (E3) ATTO550 (kırmızı) ve anti-mGlutR1 (yeşil) birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Arı beyinlerinde 48 h enjeksiyondan sonra modifiye gDNA ve RDL ve mGlutR1 mRNA'nın mRNA ekspresyonu 345 nL ilgili RPN CRISPR-Cas9 ile değerlendirilmesi. (A) Bir modifikasyon alanı ile gDNA miktarını değerlendirmek için qPCR tabanlı bırakma testi 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı ve kontrol, enjekte edilmemiş beyinlere karşı normalleştirildi. Veriler ortalama + SD. (B) TheqRT-PCR testi CRISPR-Cas9 enjekte edilen ve enjekte edilmemiş arılarda mRNA miktarını değerlendirmek için kullanılmıştır. AmActin referans geni olarak kullanılmıştır. Bağıl gen ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmış ve kontrole karşı normalleştirilmiş, enjekte edilmemiş beyinler. Veriler ortalama + SE olarak ifade edilir.
Şekil 4: RNP CRISPR-Cas9'un arı beyinlerinde ATTO550 floresan ile dağılımına örnek. (A-D) Mantar vücudunun Kenyon hücresinde RNP RDL-CRISPR-Cas9 ifade dört farklı arıların beyin bölümleri. (E,F) RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9 ile enjeksiyondan sonra iki beyin 48 saat örneği. Ölçek çubuğu = 150 μm (A-F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Anti-RDL ve anti-mGlutR1 karakterizasyonu
İlk olarak, anti-RDL ve anti-mGlutR1 antikorlarını sabit bal arısı beyin dilimlerinde immünoblot ve pre-adsorpsiyon ile karakterize ettik. Her antikor bilinen tüm izoformları tanımak için yapıldı, ve Batı analizi onların öngörülen molekül ağırlıklarına karşılık gelen bantları tanıdıklarını gösteriyor. Daha sonra, her iki antikor da bal arısı beyin kesitlerinde üretildikleri konjuge peptid tarafından bloke edildi.
Çalışmamızdaki ilk amaçlardan biri, spesifik konjuge peptide karşı üretilen antikorların sabit beyin dokusundaki proteinine özgü olduğunu saptamaktı. Bu amaçla CRISPR-Cas9 sisteminden yararlandık. Bal arısı RDL ve mGlutR1 için özel kılavuzlar tasarladık ve her birini CRISPR-Cas9'u floresan prob ATTO550 ile etiketlenmiş yapmak için kullandık. Her reseptör için, biz ocelli üç farklı CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinlerin bir karışımı enjekte yetişkin bal arısı beyninde hedeflenen protein miktarını azaltmak için bizim tasarlanmış Cas9 sistemi aldı hücrelerde karşılık gelen geni ortadan kaldırarak. Çalışmamızda bu adımı başardık.
Bu deneylerin başarısı için ilk önemli adımlardan biri uygun kılavuz RNA'lar tasarlamaktır. Gen dizisinin başında, ortasında ve sonunda bulunan en fazla beş kılavuz RNA tasarlamanızı öneririz. İlk çalışmamızda, onları üç ila beş arı üzerinde çeşitli kombinasyonlarda test ettik. Ayrıca enjeksiyonlar farklı konsantrasyonlarda çalıştı, enjeksiyon sonrası kez, ve enjeksiyonlarda RNP çeşitli karışımları. Beyinleri inceledik ve anti-RDL ve anti-mGlutR1 antikorları kullanarak inceledik. Bu ilk testlerde, enjeksiyon için uygun kombinasyonu, enjeksiyon sonrası zamanı ve enjeksiyon için CRISPR-Cas9 konsantrasyonunu ve miktarını belirledik. Bu ilk testler burada ayrıntılı olarak açıkladığımız deneyleri ayarlamak için temel teşkil ediyordu.
Amaç iki aşamalıydı: 1) bir arıda antikor boyamamızın CRISPR-Cas9 ile tedaviden sonra azaldığını ve 2) davranışsal çalışmalar için en iyi deneysel koşulları gözden geçirmek olduğunu göstermekti. Bu nedenle, birçok hücre çekirdeği enjeksiyondan sonra CRISPR-Cas9 48 h içeriyorsa, anti-RDL ve anti-mGlutR1 boyama nın azaltılmasının önemli olduğunu gösteriyoruz. Ayrıca, test edilen antikorların özellikle bal arısı beyin hazırlığında mGlut1 ve RDL proteinini tanıdığını ve bal arısı beyninde lokalizasyon çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektedir.
Davranışsal çalışma için crispr-Cas9'un deneysel ayarı
Daha sonra, CRISPR-Cas9'un davranış salçalarında kullanılabilsi için deneyleri kurduk. Sekiz ya da dokuz bal arıları kontrol ve deneysel tedaviler için toplandı. Enjeksiyondan önce ve sonra davranışsal olarak test edildiler ve daha sonra beyinleri atto550 ve/veya immünositokimya için incelenmiş ve hedef proteinin azaldığını gösteren beyin bölgelerini saptamaktadır. Burada, bir dizi deney için alınan arı sayısının kontrol ve deneysel koşullar için en fazla 8-9 arı ile sınırlı olduğunu belirtmek gerekir. Bu şekilde her iki koşul da aynı gün test edilebilir. Ayrıca CRISPR-Cas9 karışımlarını enjeksiyon için hazırladığımız da olmadı. CRISPR-Cas9 karışımı 3 gün üst üste kullanıldığında potens değişmedi ve 4-8 °C'de tutuldu. Ancak, biz 3 gün sonra test etmedi.
Her iki deneysel enjeksiyon seti ve her iki antikor için sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi, test edilen 16 arıdan sadece üç arı mantar gövdesi, protoerebrum ve anten loblarında büyük bir dağılım ATTO550 gösterdi. Diğer tüm arılarda CRISPR-Cas9'un dağılımı mantar gövdesi, merkezi kompleks ve/veya posterior protocerebrum ile sınırlıydı. Bu enjeksiyon yöntemi kullanılarak hedef proteinin azaltılması arıların çoğunda mantar vücut sadece sınırlı olacağını herhangi bir davranış çalışmaları için anlamak esastır. Bu anten lob veya subesophageal ganglion genişletmek olmaz. Bu nedenle, kullandığımız enjeksiyon tekniği mantar gövdesi ve merkezi kompleksteki reseptörlerin azaltılmasının etkisini davranışsal deneylerde incelemek için uygundur, CRISPR-Cas9'u tanıtmanın farklı bir yöntemi ise diğer beyin bölgelerinin incelenmesi için daha uygun olacaktır.
Sonuç olarak, çalışmamız CRISPR-Cas9'un beyinde antikor boyama için bir kontrol olarak başarılı bir şekilde uygulanmasını göstermiştir. Her iki antikoriçin (anti-RDL ve anti-mGlutR1), mGlutR1-CRISPR-Cas9 veya RDL-CRISPR-Cas9 alımı başarılı olduğunda, karşılık gelen antikor boyama düzeyi de önemli ölçüde azaltıldı. Ayrıca, ocelli enjeksiyon homojen değildi beyinde CRISPR-Cas9 bir dağılıma yol açtığını belirtmek önemlidir. Dağılım, ocelli ve mantar vücudunu çevreleyen minimal bir alandan tüm beyindeki birçok hücreye kadar değişmekteydi. MGlutR1-veya RDL-CRISPR-Cas9 alımının hücreler tarafından değişkenliği büyük olasılıkla enjeksiyonlarda farklılıklara bağlıydı. Verilerimiz CRISPR-Cas9 sisteminin bal arılarında çalıştığını göstermektedir, ancak crispr-Cas9 alımının tek tek arı beyinleri arasında değişkenliğini azaltmak için enjeksiyon yönteminin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu kısıtlamalar içinde, artık davranışsal deneyler için yetişkin arılarda genleri işlemek için bu tekniği kullanmak mümkündür.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma BHS: Human Frontiers Science Program'a verilen ödüllerle desteklenmiştir; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Fikirler Lab (1556337). DmGluRA için peptid ve antikorlar Dr Serge Birman (Marsilya, Luminy, Fransa) laboratuvar da zaman IS Program d'Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 fondation pour la Recherche Medicale tarafından desteklendi tasarlanmıştır. Biz Daniela Junqueira Marosi ve Alex Hanter Entegre DNA Teknolojisi (IDT) RDL kılavuzları ve qPCR bırakma tahlilleri tasarımı ile yardım için müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
