Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Design, syntese, og fotokjemisk egenskaper klikkbare bur forbindelser

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

Summary

En protokoll for syntese og måling av fotokjemisk egenskaper av modulære bur forbindelser med klikkbare andeler presenteres.

Abstract

Bur forbindelser aktivere Foto-mediert manipulering av cellen fysiologi med høy spatiotemporal oppløsning. Men den begrensede strukturelle mangfoldet av tiden tilgjengelig caging grupper og vanskelighetene i syntetisk modifikasjon uten å ofre sine photolysis effektivitet er hindringer for å utvide repertoaret av bur forbindelser for levende celle Programmer. Som kjemisk modifisering av kumarin-type Foto-caging grupper er en lovende tilnærming for utarbeidelse av bur forbindelser med ulike fysiske og kjemiske egenskaper, rapporterer vi en metode for syntese av klikkbare bur forbindelser som kan endres enkelt med ulike funksjonelle enheter via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Den modulære plattform molekylet inneholder en (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe som en foto-caging gruppe, som viser en høy photolysis effektivitet i forhold til de av konvensjonelle 2-nitrobenzyls. Generelle prosedyrer for utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser som inneholder aminer, alkoholer, og carboxylates presenteres. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og celle målretting evne kan lett innlemmes i klikkbare bur forbindelser. Videre ble den fysiske og fotokjemisk egenskaper, inkludert photolysis Quantum yield, målt og ble funnet å være overlegen de tilsvarende Bhc bur forbindelser. Den beskrevne protokollen kan derfor betraktes som en potensiell løsning for mangelen på strukturell mangfold i de tilgjengelige bur forbindelser.

Introduction

Bur forbindelser er utformet syntetiske molekyler som opprinnelige funksjoner er timelig maskert av covalently vedlagt Foto-flyttbare beskytte grupper. Interessant, bur forbindelser av biologisk relevante molekyler gir en uunnværlig metode for spatiotemporal kontroll av cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterte Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl Ester fra leiren som en membran gjennomtrengelig og photolabile derivat av cAMP7. Året etter, rapporterte Kaplan 1-(2-nitrophenyl) etanol Ester av ATP (NPE-ATP) og navngitt denne forbindelsen "bur" ATP8. Siden da, en rekke photochemically flyttbare beskytte grupper som 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (kumarin-4-YL) methyls14,15,16 har blitt brukt for utarbeidelse av bur forbindelser.

Syntesen av bur forbindelser med ønskelig ekstra egenskaper som membran permeabilitet, vannløselighet, og cellulære målretting evne ville være forventet å lette celle biologiske applikasjoner. Siden de fysiske og fotokjemisk egenskapene til disse molekylene først og fremst avhenger av den kjemiske strukturen til photochemically som er flyttbare, og beskytter grupper som brukes til å forberede dem, kreves det et mangfoldig repertoar av foto caging grupper. Imidlertid er det strukturelle mangfoldet i tiden tilgjengelige caging grupper som utviser høy photolysis effektivitet begrenset. Dette kan være et hinder for å øke bruken av bur forbindelser.

For å løse dette problemet, har repertoaret av foto-caging grupper blitt utvidet ved kjemisk modifisering av eksisterende photoremovable beskytte grupper eller utformingen av nye photolabile chromophores med overlegen photophysical og fotokjemisk egenskaper. Eksempler inkluderer nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4, 5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (DMNPB)18,19, en kalsium-følsom 2-nitrobenzyl photocage20, erstattet coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM-azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl kumariner24), cyanine derivater (CyEt-Pan)25, og BODIPY derivater26,27.

I tillegg har vi tidligere utviklet (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe og med hell syntetisert ulike bur forbindelser av nevrotransmittere28, andre Messengers29,30, og oligonukleotider31,32,33 utstilling stor en-og to-Foton eksitasjon tverrsnitt. Hvis flere egenskaper kan installeres lett inn i caging grupper uten å svekke deres foto, så repertoaret av bur forbindelser kan utvides34,35,36, 37,38,39. Vi har derfor designet modulære bur forbindelser som består av tre deler, nemlig Bhc gruppen som en foto-responsive kjerne, kjemiske håndtak for installasjon av ekstra funksjonalitet, og molekyler som skal være maskert40, i 41.

Dermed gir denne artikkelen en praktisk metode for utarbeidelse av bur forbindelser av biologisk relevante molekyler. Den nåværende protokollen beskriver metoder for utarbeidelse av en klikkbar plattform for foto-caging grupper, innføring av ytterligere funksjonalitet for å utvide repertoaret av bur forbindelser, måling av deres fysiske og fotokjemisk egenskaper, og cellen-type selektiv målretting av en klikkbar bur sammensatte for videre mobilnettet programmet.

Protocol

1. syntese av den modulære caging paBhc gruppe for klikkbare bur forbindelser28,41

  1. Fremstilling av (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) methyl klorid (Bhc-CH2CL)
    1. Plasser 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) i en 100 mL rund bunn kolbe utstyrt med en stirrer bar.
    2. Legg til CONC. H2så4 (98%, 30 ml) til flasken og rør blandingen å oppløse.
    3. Tilsett etanol 4-chloroacetoacetate (10 mL, 74 mmol) dråpevis.
    4. Fortsett omrøring av blandingen ved omgivelsestemperatur i 5 dager.
    5. Separat, Legg knust isbiter (~ 200 mL) i en 500 mL Erlenmeyer kolbe.
    6. Hell reaksjonen blandingen i isen og rør kraftig i 30 min til en fint pulverisert utfelling er innhentet.
    7. Samle inn utfelling via vakuum filtrering. Vask lyset brune utfelling med vann fem ganger.
    8. Tørk utfelling under vakuum over natten for å gi BhcCH2CL som et lett brunt pulver (13,57 g, 46,9 mmol).
  2. Utarbeidelse av (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metanol (BhcCH2Oh)
    1. Plasser den tilberedte BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) og 1 M HCl (300 ml) i en kolbe på 1 L bunn som er utstyrt med en Dimroth-kondensator. Rør blandingen ved 140 ° c i 5 dager. Etter denne tid, kjøle blandingen til omgivelsestemperatur.
    2. Fjern vannet fra reaksjonen ved roterende fordampning under vakuum for å gi BhcCH2Oh (1) som et lett brunt pulver (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% yield).
      Merk: bruk av 250 mL 1 M HCl per 1 g BhcCH2CL gir et tilfredsstillende resultat.
  3. Utarbeidelse av paBhcCH2Oh (2) via Mannich reaksjon
    1. Sted paraformaldehyde (446,4 mg, 14,9 mmol) i en 50 mL rund bunn kolbe. Tilsett vannfri etanol (5 mL) og N-methylpropargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) til flasken.
    2. Rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 1 time under en AR-atmosfære.
    3. Legg BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) til flasken. Varm opp blandingen til 80 ° c med et blokk varmer apparat, og Fortsett å røre ved blandingen ved 80 ° c i 2 timer under en AR-atmosfære.
    4. Stopp blokk varmeren og Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur.
    5. Samle den resulterende lys brun-gul utfelling av vakuum filtrering. Vask utfelling to ganger med en liten mengde vannfri etanol (1 mL hver gang).
    6. Fjern overflødig etanol under vakuum å gi paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).

2. utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser

Merk: følgende prosedyrer kan brukes til utarbeidelse av andre klikkbare bur forbindelser som inneholder hydroksyl, amino, og carboxylat funksjonelle grupper.

  1. Generell prosedyre 1: utarbeidelse av en klikkbar bur Amin
    1. Place paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) og n,n '-karbonyl diimidazole (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) i en 30 ml rund bunn kolbe. Tilsett tørr CH2CL2 (6 ml) og rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 1 time.
    2. Tilsett 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) og tert-butyl (6-aminohexyl) carbamate (533,1 mg, 2,46 mmol). Rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 3 timer.
    3. Fjern løsemiddel og andre flyktige materialer ved hjelp av en roterende fordamper under vakuum. Rens rester direkte ved hjelp av silica gel Flash kolonne kromatografi.
  2. Generell prosedyre 2: utarbeidelse av en klikkbar bur alkohol
    1. Plasser paklitaksel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) i en flaske med 30 mL rund bunn utstyrt med en treveis stopcock og en AR-ballong. Tilsett tørr CH2CL2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol), og 4-nitrophenyl chloroformate (26,0 mg, 0,13 mmol).
    2. Rør løsningen ved omgivelsestemperatur for 2,5 h under en AR-atmosfære.
    3. Legg til 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) og paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) til løsningen. Fortsett omrøring av blandingen ved omgivelsestemperatur i 17 timer.
    4. Tilsett CHCl3 (10 ml) og 15% vandig NaHCO3 (5 ml) til blandingen. Rør blandingen kraftig i ca 3 min. Fjern det vandige laget med en pipette.
    5. Tilsett 0,5 M sitronsyre (5 mL) til flasken som inneholder det organiske laget. Rør blandingen og fjern det vandige laget som ovenfor.
    6. Skill det organiske laget ved hjelp av en fase skille kolonne. Fjern løsemidler med en roterende fordamper under vakuum. Rens produktet ved hjelp av standard silica gel Flash kolonne kromatografi.
  3. Generell prosedyre 3: utarbeidelse av en klikkbar bur kar bok syls syre
    1. Løs opp arachidonic yre (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol), og 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 MMOL) i tørr ch2CL2 (2 ml). Tilsett n,n gepatotoksičnost-diisopropylcarbodiimide (DIPC, 17,0 μL, 0,110 mmol) og rør oppløsningen ved omgivelsestemperatur i 140 min.
    2. Fjern løsemiddel under vakuum. Rens rester direkte ved hjelp av silica gel Flash kolonne kromatografi.

3. installasjon av en funksjonell enhet i klikkbare bur forbindelser

  1. Løs opp kobber (II) sulfat-pentahydrate (249 mg) i ion-utvekslet vann (IEW, 10 mL) for å gi en 0,1 M CuSO4 -løsning.
  2. Løs opp 2 gepatotoksičnost-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 mikromol), Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA, 17,5 mg, 40,3 mikromol), natrium l-ascorbate (162,4 mg, 0,825 mmol), og 15-klor-3, 6, 9-trioxapentadecyl Natriumazid (3,1 mg, 11 mikromol) i et blandet løsemiddel av 0,1 M fosfat buffer (2,5 mL, pH 7,2) og dimethyl sulfoxide (DMSO, 0,5 mL).
  3. Tilsett 0,1 M CuSO4 -oppløsning (81,2 μL, 8,1 mikromol) i reaksjonsblandingen. Rør blandingen ved omgivelsestemperatur i 80 min. Overvåk fremdriften til reaksjonen ved hjelp av høyytelses flytende kromatografi (HPLC).
  4. Løs opp precipitates ved å tilsette en 75% acetonitril/vannoppløsning (3,5 mL). Påfør den resulterende løsningen direkte på semi-preparativ HPLC system for å rense det ønskede produktet.
    Merk: Oppløseliggjøringen av reaksjonsblandingen ved tilsetning av tert-butanol kan akselerere progresjonen av reaksjonen.

4. photolytic uncaging reaksjon av bur forbindelser

  1. Utarbeidelse av aksjen løsninger
    1. Oppløse den ønskede bur sammensatte (5 mikromol) i DMSO (500 μL) for å forberede en 10 mM lagerløsning. Dispensere en alikvot av hver løsning (10 μL) i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør og oppbevares i en fryser (− 20 ° c) inntil like før bruk.
    2. 6 mM K3[fe (C2O4)3] (100 ml): løs opp recrystallized kalium ferrioxalate (0,295 g, 0,675 mmol) i 80 ml vann. Tilsett 0,5 M H2så4 (10 ml) og en passende mengde IEW som utgjør volumet til 100 ml.
      Merk: kalium ferrioxalate bør renses via omkrystallisering fra varmt vann og oppbevares i mørket. Recrystallized kalium ferrioxalate oppnås som trihydrat; Derfor er dens formel K3[fe (C2O4)3] · 3t2o og en formel vekt på 491,24 bør vurderes under utarbeidelse av lagerløsning. Kontroller renheten på 6 mM-løsningen ved å måle dens absorpsjon ved 510 NM. Hvis absorbansen er < 0.02, er den egnet for bruk i eksperimentet.
    3. 0,1% buffer-Phen (30 mL): oppløse NaOAc · 3t2O (7,35 g), 1, 10-fenantrolin (Phen) · H2O (30 mg), og CONC. h2så4 (0,9 mL) i IEW (20 ml). Legg til IEW for å gjøre volumet til 30 mL.
      Merk: løsningen inneholder 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2så4, og 0,1% 1, 10-fenantrolin.
  2. Måling av antall fotoner ved hjelp av ferrioxalate actinometry
    1. Plasser 6 mM K3[fe (C2O4)3] (V1 L) i en kvarts Cuvette. Irradiate løsningen med 350 Nm lys for 5 s.
    2. Overfør den bestrålt løsningen til en Pyrex-Cuvette med banelengde på l [cm].
    3. Legg 0,1% buffer-Phen (V2 L) til bestrålt prøve løsning og bland godt med pipettering. Mål absorbansen av prøven ved 510 NM. Beregn gjennomsnittlig absorpsjons endring per enhets tid (ΔA510 [s− 1]).
    4. Beregn antall føflekker av genererte Fe2 + ioner per enhet tid i henhold til følgende ligning:
      nFe2 + [mol s− 1] = ((v1 + V2) [L] × ΔA510 [s− 1])/(L [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]),
      hvor (v1 + V2) er volumet av prøven for absorpsjon måling, l er den optiske banen lengden på Cuvette, og ε510 er molar absorptivitet av Fe2 +- Phen kompleks ved 510 NM.
      Merk: i typiske eksperimentelle forhold, verdier av v1 = 2,0 × 10− 3 l, V2 = 0,33 × 10− 3 l, l = 1,0 cm, og ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 ble brukt.
    5. Beregn antall føflekker av fotoner som når prøven (i0) ved hjelp av følgende formel:
      I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = nFe2 +/Φ350
      der Φ 350 er Quantum effektiviteten til photoreduction av ferrioxalate ved 350 NM.
      Merk: selv om Quantum effektiviteten til kalium ferrioxalate actinometer ved 350 Nm ikke rapporteres, ble den rapporterte verdien av 1,2542 ved 358 NM ansatt.
  3. Quantum effektivitets målinger ved 350 Nm
    1. Fortynne prøven lagerløsning (i DMSO, 10 μL) med K-MOPPER buffer (pH 7,2, 10 mL) for å gi en 10 μM løsning i K-MOPPER som inneholder 0,1% DMSO.
      Merk: K-MOPPER buffer besto av 100 mM KCl og 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (mopper) titrert til pH 7,2 med Koh.
    2. Overfør en alikvot av oppløsningen (V1 L) inn i samme Cuvette som brukes i photoreaction av den kjemiske actinometer. Irradiate eksempel løsningen med samme oppsett som beskrevet i trinn 4.2.1.
    3. Fjern en alikvot (50 μL) fra den bestrålt løsningen med jevne mellomrom og analyser ved hjelp av HPLC.
    4. Bestem bestråling tid, i sekunder, der 90% av Start materialet reagerte (t90%) ved å tilpasse tomter i den tidsavhengige forsvinningen av Start materialet.
      Merk: absorbansen av bestrålt prøven må opprettholdes ved < 0.1 slik at den indre filtreringen av strålingen kan bli neglisjert. Det er ønskelig at photolytic forbruket av utgangsmaterialet kan bli rundet av enkelt-eksponentiell forfall, slik at det er ingen uønsket sekundær effekt som forstyrrer photolysis prosessen.
    5. Beregn kvante utbyttet av forsvinning (Φdis) ved hjelp av følgende ligning28:
      Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350)
      der t90% [s] er bestråling tiden der 90% av Start materialet ble konsumert, jeg0 [Einstein cm− 2 s− 1] er antall føflekker av fotoner, og σ350 [cm 2 mol− 1] er den decadic utryddelse koeffisienten i prøven ved 350 NM.
      Merk: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].

5. målretting av en klikkbar bur sammensatte med en HaloTag ligand

Merk: før bruk, opprettholde jakten cellene i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM, lav glukose, natrium pyruvat, l-glutamin) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) inneholder 1% antibiotika (Streptomycin sulfat, penicillin G, og amfotericin) på 37 ° c og 5% CO2.

  1. Fjern mediet og trypsinize cellene ved å behandle med Trypsin-ethylenediaminetetraacetic yre (EDTA, 1 mL) ved 37 ° c i 1 min. Legg DMEM (4 mL) til cellene og re-suspendere cellene ved pipettering forsiktig. Seed ca 5 × 105 celler per tallerken i 35 mm glassbunn RETTER i DMEM (2 ml) 24 h før transfeksjoner.
  2. For fire retter, i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør, fortynne plasmider DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) i det reduserte serum mediet (700 μL). Separat, fortynne lipofection reagens (5 μL) i det reduserte serum mediet (150 μL) i hver av fire rør og la dem stå ved omgivelsestemperatur i 5 min.
  3. Tilsett en del av det fortynnede plasmider DNA (150 μL) til hver av de fortynnede lipofection reagens prøvene. Ruge ved omgivelsestemperatur i 5 min.
  4. Etter å ha opprettholdt cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 h, aspirer DMEM og skyll cellene med fosfat-bufret saltvann (PBS, 2 ml). Tilsett det reduserte serum mediet (1,5 mL).
  5. Tilsett plasmider-lipofection reagens (150 μL) kompleks på hver tallerken. Oppretthold cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 48 h.
  6. Aspirer mediet, tilsett en del av ferskt tilberedte DMEM (1 mL) som inneholder 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 i 30 min.
  7. Aspirer mediet som inneholder den bur sammensatte og skyll cellene to ganger med PBS + (1 mL per skylling) for å fjerne eventuelle ubundne forbindelser. Tilsett det reduserte serum mediet (500 μL) og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 i 30 min for å fjerne forbindelsene som kom inn i cellene.
    Merk: PBS + er fosfat-bufret saltvann supplert med 2 mM CaCl2 og 1 mm MgCl2.
  8. Fjern mediet og skyll cellene to ganger med PBS + (1 mL). Legg til en del av et medium (1 mL) som ikke inneholder fenol rødt. Record fluorescens bilder av laserskanning konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi.

6. Photomediated modulering av en kinase lokalisering ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte

Merk: før bruk, opprettholde CHO-K1 cellene i ham ' s F-12 medium supplert med 10% FBS ved 37 ° c og 5% CO2.

  1. Forbered en 100 × arbeids løsning (1 mM) av paBhc-AA (5) i DMSO.
    Merk: en 10 mM lagerløsning av forbindelsen tilberedes og oppbevares i en fryser (-20 ° c).
  2. Seed ca 5 × 105 celler per tallerken i 35 mm glassbunn RETTER i DMEM (2 ml) 24 h før transfeksjoner.
  3. Transfect CHO-K1 celler med en plasmider koding for GFP-DGKγ 48 h før uncaging eksperimenter.
    Merk: Transfeksjoner utføres i henhold til trinn 5.2 – 5.5.
  4. Skift ut mediet med et redusert serum medium (2 mL). Tilsett 100 × paBhc-AA arbeids løsning (20 μL) og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for mellom 5 min og 1 time.
    Merk: innlastingstiden avhenger av sammensatt ansatt.
  5. Plasser cellene på den objektive fasen av et invertert fluorescerende mikroskop utstyrt med en dobbel lyskilde fluorescens belysning.
  6. Ta et fluorescerende bilde hver 10 s. irradiate cellene med 330 – 385 NM lys gjennom et mikroskop objektiv for et passende tidspunkt. Alternativt, irradiate cellene med 405 NM lys ved hjelp av en XE lampe gjennom fleksible kvarts fibre.
  7. Fortsett å ta opp fluorescerende bilder i 10 minutter.

Representative Results

Klikkbare bur forbindelser av noen biologisk interessante molekyler, inkludert arachidonic syre og paklitaksel, ble vellykket syntetisert (figur 1)28,41. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og cellulær målretting evne ble innført i paBhcmoc-PTX via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering ("Klikk" reaksjon) (figur 2). Disse klikkbare bur PTXs ble deretter photolyzed å produsere sine foreldre PTXs upon bestråling på 350 Nm (Figur 3), og den fysiske og fotokjemisk egenskaper av klikkbare bur forbindelser er oppsummert i tabell 1. Quantum rentene av klikkbare bur forbindelser 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX (Φdis 0,14) og PaBhc-AA (Φdis 0,083) var mer enn dobbelt de av konvensjonelle BHC bur forbindelser 2 gepatotoksičnost-Bhcmoc-PTX (Φdis 0,040) og Bhc-AA (Φdis 0,038)43. I tillegg ble det observert en forbedret vannløselighet for 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX, som inneholder en glukose moiety.

I live celle eksperimenter, målrettingen av paBhc-hex-FITC/Halo til kultivert pattedyrceller midlertidig uttrykker en fusjon protein av en HaloTag protein og epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) ble oppnådd vellykket. Grønn fluorescens av fluorescein moiety av paBhc-hex-FITC/Halo ble observert på cellemembranen (Figur 4). Foto-mediert modulering av subcellulære lokalisering av en kinase ble oppnådd ved hjelp av en paBhc bur sammensatte. Translokasjon av diacylglycerol kinase γ (DGKγ) er rapportert å være aktivert i nærvær av arachidonic syre (AA)44. CHO-K1 celler midlertidig uttrykker GFP-DGKγ ble behandlet med enten AA eller paBhc-AA (5). Tilsetting av AA forårsaket modulering av subcellulære lokalisering av DGKγ (figur 5A, B). Lignende endringer i lokalisering av DGKγ ble observert for paBhc-AA-behandlede celler etter eksponering for UV-lys (figur 5C, D).

Figure 1
Figur 1: utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser.
(A) reagenser og betingelser: A. etanol 4-chloroacetoacetate/CONC. H2så4/RT/7 dager/91% avkastning, b. 1 M HCL/reflux/3 dager/97% yield. c. N-methylpropargylamine/HCHO/EtOH, deretter legge til (1) og varme på reflux for 17 h/79% yield. (B) synteser av klikkbare bur Amin, PTX, og arachidonic syre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: installasjon av funksjonelle enheter i klikkbare bur forbindelser.
(A) syntese av et VANNLØSELIG bur PTX via kobber (i)-katalysert Huisgen syklisering. (B) strukturer av klikkbare bur forbindelser som inneholder HaloTag ligand for mobilnettet målretting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Photolysis av 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX (6).
Prøver (10 μM) i K-MOPPER-oppløsning (pH 7,2) ble bestrålt ved 350 NM. (A) typiske HPLC spor for photolysis av 6 (målt ved 254 NM). Prøvene ble analysert på den angitte bestråling tid. (B) tid kurs for photolysis av 6. Blå sirkler viser forbruket av 6. Den solide linjen viser minst kvadrater kurve passer for en enkel råtnende eksponentiell for 6. Røde firkanter viser utbyttet av PTX. Feilfeltene representerer standardavviket (± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: fluorescens bilder av kultivert pattedyrceller inkubert med paBhc-hex-FITC/Halo (8).
Celler transfekterte med pcDNA3-Halo-EGFR ble inkubert med en 2 μM løsning av sammensatte 8 ved 37 ° c i 30 min. Bildene ble innhentet etter gjentatt vask med PBS +. Mock-behandlet HEK293T celler (A: differensial forstyrrelser kontrast (dic) bilde og D: fluorescens bilde). HEK293T celler (b og E) og jakten celler (C og F) midlertidig uttrykker Halo-EGFR (B og C: dic bilder og e og F: fluorescens bilder). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: fluorescens bilder etter UV bestråling av CHO-K1 celler inkubert med Bhc bur arachidonic syre. CHO-K1 celler ble transfekterte med en fusjon protein DGKγ-EGFP.
(A) et fluorescens bilde av transfekterte celler. (B) 100 s etter tilsetning av en 10 μM løsning av arachidonic syre. (C) celler ble inkubert med en 10 μM løsning av PABHC-AA (5) ved 37 ° c i 5 min. (D) 100 s etter 20-s UV-bestråling (330 – 385 NM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Forbindelser λMax (NM)a εMax (M-1 cm-1)b φdisc εφdisd Løselighet (μM)e
PTX 1,0
2 '-Bhcmoc-PTX 340 10500 0,040 400 55
2 '-paBhcmoc-PTX 359 9300 0,059 670 8,3
2 '-glc-Bhcmoc-PTX 373 12300 0,14 1280 650
Bhc-AA 341 10800 0,038 390
paBhc-AA 366 10300 0,083 750

Tabell 1: fysiske og fotokjemisk egenskaper av klikkbare bur forbindelser.
a. maksimal absorpsjon (NM), b. molar absorptivitet ved λMax (M− 1 cm− 1), c. Quantum yield av forsvinningen av Start materialet ved 350 NM, d. Produktet av molar absorptivitet og Quantum yield av forsvinningen på 350 NM, e. Konsentrasjonen av den mettede oppløsningen i K-MOPPER (pH 7,2) (μg mL− 1).

Discussion

Vi har tidligere utviklet Bhc bur forbindelser av ulike biologisk aktive molekyler som viser høy photolytic effektivitet28,45,46,47. Med sikte på å utvide repertoaret av Bhc caging grupper, har vi også rapportert plattformer av modulære bur forbindelser som kan endres enkelt ved innføringen av ulike funksjonelle enheter32,40,41. Den nåværende protokollen representerer derfor en metode for syntese av en klikkbar forløper for Bhc caging grupper som kan endres via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Syntesen av klikkbare forløper, paBhcCH2Oh (2), ble oppnådd via en fire-trinns reaksjons sekvens som starter fra den kommersielt tilgjengelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen med denne protokollen er at ingen arbeidskrevende rensing trinn (for eksempel kolonne kromatografiske separasjoner) er nødvendig.

Som klikkbar forløper paBhcCH2Oh (2) kan brukes til å maskere ulike funksjonelle grupper, klikkbare bur forbindelser av aminer, alkoholer, og kar bok syls syrer ble syntetisert med 2 som forløperen (figur 1B). Aminer ble modifisert som deres karbamater mens alkoholer ble modifisert som deres karbonater. I de generelle prosedyrene 1 og 2 ble CDI brukt til utarbeidelse av klikkbare karbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformate ble benyttet for utarbeidelse av karbonater. Som indikert av reaksjons mekanismen, kan begge reagensene brukes til fremstilling av karbamater og karbonater. Det bør også bemerkes at avkastningen av ønsket bur sammensatte avhenger av den kjemiske strukturen av molekylet som skal bur. Andre eksempler kan sees i våre tidligere rapporter28,30,33,48.

Klikk modifikasjon ble deretter utført ved hjelp av en liten endring av den rapporterte prosedyren49. Tillegg av Tris (triazolylmethyl) Amin-basert ligander er nødvendig for å oppnå de ønskede produkter i god til høy avkastning. Siden en rekke azider er lett tilgjengelig både fra kommersielle kilder og fra litteratur prosedyrer, kan vi forberede ulike modulære bur forbindelser med flere egenskaper som vannløselighet og cellulære målretting evne (figur 2).

Kvantum utbyttet av photolysis ble deretter målt i henhold til en rapportert prosedyre28,50. Figur 3 viser at photolytic forbruket av 2 gepatotoksičnost-Glc-PABHCMOC-PTX og UTGIVELSEN av PTX ble rundet av enkelt-eksponentiell forfall og vekst, henholdsvis antyder ingen indre filtrering av stråling eller uønskede sekundære effekter. Forbedret photolysis Quantum rentene (Φ) og photolysis effektivitet (εΦ) ble observert for klikkbare paBhc bur forbindelser i forhold til de av tidligere rapporterte Bhc bur forbindelser (tabell 1)41, 43. siden photolysis effektivitet (εΦ) av Bhc bur forbindelser er mer enn 100 ganger høyere enn for 2-nitrobenzyl-type bur forbindelser48, den markerte forbedringen på grunn av tilstedeværelsen av paBhc caging grupper er klart en fordel for dette systemet.

Som et proof-of-Concept eksperiment, en hydrofile moiety ble innført i 2 gepatotoksičnost-paBhcmoc-PTX (4) og en mobil målretting ligand ble innført i sammensatte 3 (figur 2). VANNLØSELIGHET på 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX var 650 ganger høyere enn for den overordnede PTX (tabell 1). Selektiv mobilnettet målretting ble oppnådd ved hjelp av en tag-sonde system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) bærer HaloTag ligand ble vellykket rettet mot cellemembranen av kultivert pattedyrceller uttrykker HALOTAG/EGFR Fusion protein ( Figur 4). Foto-mediert modulering av subcellulære lokalisering av en kinase ble også oppnådd ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte 5 (figur 5).

Avslutningsvis har vi med hell demonstrert en metode for utarbeidelse av klikkbare plattformer for foto-bur forbindelser av biologisk interessante molekyler som kan endres enkelt med flere egenskaper, for eksempel vannløselighet og en mobil målretting evne. Siden paBhc caging-gruppen kan brukes til å klargjøre alle molekyler med funksjonsgrupper som kunne endres, er anvendelsen av den foreliggende protokollen ikke begrenset til molekylene som beskrives her. Ved hjelp av en modulær plattform, nemlig paBhc caging gruppen, den ønskede bur forbindelser kan lett forberedt, og deres fysiske og kjemiske egenskaper kan være modulert via Klikk modifikasjon.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder "Memory dynamikk," og JP19H05778 (TF), "MolMovies."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile, EP Nacalai 00404-75
acetonitrile, super dehydrated FUJIFILM Wako 010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher 15240062
4-bromoresorcinol TCI Chemicals B0654
N,N’-carbonyldiimidazole FUJIFILM Wako 034-10491
chloroform Kanto 07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% FUJIFILM Wako 032-12511
dichloromethane, dehydrated Kanto 11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) TCI Chemicals D0254
4-dimethylaminopyridine TCI Chemicals D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- Kanto 10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW Olympus
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako 054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate TCI Chemicals C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red FUJIFILM Wako 087-08335
hydrochloric acid FUJIFILM Wako 087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71 Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL Biotage 120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt FUJIFILM Wako 196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher 11668027 lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Dojindo 345-01804 MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) TCI Chemicals C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Thermo Fisher 11058021 reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate Nacalai 26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate FUJIFILM Wako W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate Nacalai 31115-05
Sodium Bicarbonate FUJIFILM Wako 199-05985
Sulfuric Acid, 96-98% FUJIFILM Wako 190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ALDRICH 762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate Nacalai 31404-15
Xenon light source, MAX-303 Asahi Spectra

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, G., Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angewandte Chemistry International Edition. 45 (30), 4900-4921 (2006).
  2. Bort, G., Gallavardin, T., Ogden, D., Dalko, P. I. From One-Photon to Two-Photon Probes: Caged” Compounds, Actuators, and Photoswitches. Angewandte Chemistry International Edition. 52 (17), 4526-4537 (2013).
  3. Klan, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113 (1), 119-191 (2013).
  4. Abe, M., et al. Design and Synthesis of Two-Photon Responsive Chromophores for Near-Infrared Light-Induced Uncaging Reactions. Synthesis-Stuttgart. 49 (15), 3337-3346 (2017).
  5. Ankenbruck, N., Courtney, T., Naro, Y., Deiters, A. Optochemical Control of Biological Processes in Cells and Animals. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (11), 2768 (2018).
  6. Hou, Y., Zhou, Z., Huang, K., Yang, H., Han, G. Long Wavelength Light Activated Prodrug Conjugates for Biomedical Applications. ChemPhotoChem. 2, 1005 (2018).
  7. Engels, J., Schlaeger, E. J. Synthesis, structure, and reactivity of adenosine cyclic 3',5'-phosphate benzyl triesters, Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell. Journal of Medicinal Chemistry. 20 (7), 907-911 (1977).
  8. Kaplan, J. H., Forbush, B., Hoffman, J. F. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell ghosts. Biochemistry. 17 (10), 1929-1935 (1978).
  9. Park, C. H., Givens, R. S. New Photoactivated Protecting Groups. 6. p-Hydroxyphenacyl: A Phototrigger for Chemical and Biochemical Probes. Journal of the American Chemical Society. 119 (10), 2453-2463 (1997).
  10. Hasan, A., et al. Photolabile protecting groups for nucleosides: synthesis and photo-deprotection rates. Tetrahedron. 53 (12), 4247-4264 (1997).
  11. Heckel, A., Mayer, G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. Journal of the American Chemical Society. 127 (3), 822-823 (2005).
  12. Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T. Effects of aromatic substituents on the photocleavage of 1-acyl-7-nitroindolines. Tetrahedron. 56 (41), 8197-8205 (2000).
  13. Matsuzaki, M., Ellis-Davies, G. C., Nemoto, T., Miyashita, Y., Iino, M., Kasai, H. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  14. Givens, R. S., Matuszewski, B. Photochemistry of phosphate esters: an efficient method for the generation of electrophiles. Journal of the American Chemical Society. 106 (22), 6860-6861 (1984).
  15. Furuta, T., Torigai, H., Sugimoto, M., Iwamura, M. Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. Journal of Organic Chemistry. 60 (13), 3953-3956 (1995).
  16. Hagen, V., Frings, S., Wiesner, B., Helm, S., Kaupp, U. B., Bendig, J. 7-(Dialkylamino)coumarin-4-yl]methyl-Caged Compounds as Ultrafast and Effective Long-Wavelength Phototriggers of 8-Bromo-Substituted Cyclic Nucleotides. ChemBioChem. 4 (5), 434-442 (2003).
  17. Momotake, A., Lindegger, N., Niggli, E., Barsotti, R. J., Ellis-Davies, G. C. The nitrodibenzofuran chromophore: a new caging group for ultra-efficient photolysis in living cells. Nature Methods. 3 (1), 35-40 (2006).
  18. Specht, A., et al. New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near-UV irradiation. Application to the photocontrolled release of L-glutamate. ChemBioChem. 7 (11), 1690-1695 (2006).
  19. Petersen, S., Alonso, J. M., Specht, A., Duodu, P., Goeldner, M., del Campo, A. Phototriggering of cell adhesion by caged cyclic RGD peptides. Angewandte Chemistry International Edition. 47 (17), 3192-3195 (2008).
  20. Heckman, L. M., et al. Design and Synthesis of a Calcium-Sensitive Photocage. Angewandte Chemistry International Edition. 55 (29), 8363-8366 (2016).
  21. Olson, J. P., Banghart, M. R., Sabatini, B. L., Ellis-Davies, G. C. Spectral Evolution of a Photochemical Protecting Group for Orthogonal Two-Color Uncaging with Visible Light. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15948-15954 (2013).
  22. Gandioso, A., et al. Sequential Uncaging with Green Light can be Achieved by Fine-Tuning the Structure of a Dicyanocoumarin Chromophore. ChemistryOpen. 6 (3), 375-384 (2017).
  23. Bassolino, G., Nancoz, C., Thiel, Z., Bois, E., Vauthey, E., Rivera-Fuentes, P. Photolabile coumarins with improved efficiency through azetidinyl substitution. Chemical Science. 9 (2), 387-391 (2018).
  24. Lin, Q. N., et al. Coumarin Photocaging Groups Modified with an Electron-Rich Styryl Moiety at the 3-Position: Long-Wavelength Excitation, Rapid Photolysis, and Photobleaching. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (14), 3722-3726 (2018).
  25. Nani, R. R., et al. In Vivo Activation of Duocarmycin-Antibody Conjugates by Near-Infrared Light. ACS Central Science. 3 (4), 329-337 (2017).
  26. Umeda, N., et al. Boron Dipyrromethene As a Fluorescent Caging Group for Single-Photon Uncaging with Long-Wavelength Visible Light. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2242-2246 (2014).
  27. Slanina, T., et al. In Search of the Perfect Photocage: Structure–Reactivity Relationships in meso-Methyl BODIPY Photoremovable Protecting Groups. Journal of the American Chemical Society. 139 (42), 15168-15175 (2017).
  28. Furuta, T., et al. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: Photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1193-1200 (1999).
  29. Furuta, T., et al. Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photoreleasable cyclic nucleotides for both one- and two-photon excitation. ChemBioChem. 5 (8), 1119-1128 (2004).
  30. Suzuki, A. Z., et al. Coumarin-4-ylmethoxycarbonyls as phototriggers for alcohols and phenols. Organic Letters. 5 (25), 4867-4870 (2003).
  31. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  32. Teraoka, A., Murakoshi, K., Fukamauchi, K., Suzuki, A. Z., Watanabe, S., Furuta, T. Preparation and affinity-based purification of caged linear DNA for light-controlled gene expression in mammalian cells. Chemical Communications. 50 (6), 664-666 (2014).
  33. Watanabe, T., et al. Synthesis of nucleobase-caged peptide nucleic acids having improved photochemical properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 12 (28), 5089-5093 (2014).
  34. Horinouchi, T., Nakagawa, H., Suzuki, T., Fukuhara, K., Miyata, N. A novel mitochondria-localizing nitrobenzene derivative as a donor for photo-uncaging of nitric oxide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (7), 2000-2002 (2011).
  35. Leonidova, A., et al. Photo-induced uncaging of a specific Re(I) organometallic complex in living cells. Chemical Science. 5 (10), 4044-4056 (2014).
  36. Nadler, A., et al. Exclusive photorelease of signalling lipids at the plasma membrane. Nature Communications. 6, 10056 (2015).
  37. Feng, S. H., et al. Mitochondria-specific photoactivation to monitor local sphingosine metabolism and function. Elife. 7, e34555 (2018).
  38. Wagner, N., Stephan, M., Hoglinger, D., Nadler, A. A Click Cage: Organelle-Specific Uncaging of Lipid Messengers. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (40), 13339-13343 (2018).
  39. Feng, S., Harayama, T., Chang, D., Hannich, J. T., Winssinger, N., Riezman, H. Lysosome-targeted photoactivation reveals local sphingosine metabolism signatures. Chemical Science. 10 (8), 2253-2258 (2019).
  40. Furuta, T., Manabe, K., Teraoka, A., Murakoshi, K., Ohtsubo, A., Suzuki, A. Design, synthesis, and photochemistry of modular caging groups for photoreleasable nucleotides. Organic Letters. 14 (24), 6182-6185 (2012).
  41. Suzuki, A. Z., et al. A clickable caging group as a new platform for modular caged compounds with improved photochemical properties. Chemical Communications. 55 (4), 451-454 (2019).
  42. Hatchard, C. G., Parker, C. A. A new sensitive chemical actinometer - II. Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer. Proceedings of the Royal Society A. 235 (1203), 518-536 (1956).
  43. Furuta, T., Nishiyama, K., Manabe, A., Fukuoka, M., Iwamura, M. Design, synthesis and photochemical properties of caged compounds of lipid mediators. Proceedings of the ISBC. , 124-125 (2003).
  44. Shirai, Y., Segawa, S., Kuriyama, M., Goto, K., Sakai, N., Saito, N. Subtype-specific Translocation of Diacylglycerol Kinase ? and ? and Its Correlation with Protein Kinase C. The Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24760-24766 (2000).
  45. Furuta, T., Noguchi, K. Controlling cellular systems with Bhc-caged compounds. TrAC, Trends in Analytical Chemistry. 23 (7), 511-519 (2004).
  46. Furuta, T. Designing caged compounds for spatiotemporal control of cellular chemistry. Journal of the Synthetic Organic Chemistry Japan. 69 (11), 1164-1169 (2012).
  47. Furuta, T. Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers. Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. Goeldner, M., Givens, R. S. , WILEY-VCH. 29-55 (2005).
  48. Furuta, T., Watanabe, T., Tanabe, S., Sakyo, J., Matsuba, C. Phototriggers for Nucleobases with Improved Photochemical Properties. Organic Letters. 9 (23), 4717-4720 (2007).
  49. Manova, R., van Beek, T. A., Zuilhof, H. Surface Functionalization by Strain-Promoted Alkyne–Azide Click Reactions. Angewandte Chemistry International Edition. 50 (24), 5428-5430 (2011).
  50. Adams, S. R., Kao, J. P. Y., Grynkiewicz, G., Minta, A., Tsien, R. Y. Biologically Useful Chelators That Release Ca2+ Upon Illumination. Journal of the American Chemical Society. 110 (10), 3212-3220 (1988).

Tags

Kjemi bur forbindelser syntese fotokjemi klikk kjemi prodrug kjemisk biologi kjemiske sonder
Design, syntese, og fotokjemisk egenskaper klikkbare bur forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki,… More

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki, H., Sasaki, H., Watahiki, R., Furuta, T. Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds. J. Vis. Exp. (152), e60021, doi:10.3791/60021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter