Summary
Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.
Abstract
Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell'antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell'antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell'antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l'incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l'antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell'antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l'inattivazione di agenti infettivi.
Introduction
La rabbia è un'encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall'infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell'antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il gold standard per la diagnosi dirabbia 4. Il metodo utilizza materiale cerebrale congelato fresco o fresco, un'impronta tattile su un vetrino, fissazione in acetone, colorazione utilizzando anticorpi fluorescenti isotiocianati (FITC) etichettati come monoclonali o policlonali (mAbs / pAbs) e letti dalla microscopia a fluorescenza5. Il test DFA è rapido, sensibile e specifico per il rilevamento dell'antigene della rabbia nel tessuto cerebrale fresco. Recentemente, un test immunoistochimico rapido diretto (DRIT), tecnica di immunoistochimica modificata (IHC), ha dimostrato di mostrare una sensibilità simile al DFA ma offre il vantaggio della microscopia ottica per lavisualizzazione 6. Mentre il metodo di rilevamento utilizzato in DRIT è simile a IHC, la fase iniziale utilizza tessuti freschi o congelati per generare impressioni tattili del campione seguite dalla fissazione in formalina.
L'IHC è una tecnica ampiamente utilizzata per determinare i cambiamenti istologici e il rilevamento di proteine utilizzando anticorpi specifici in tessuti fissati con formalina incorporati in blocchi di paraffina. IHC è un test alternativo consolidato per il rilevamento dell'antigene della rabbia nelle sezioni tissutali7. IHC è stato particolarmente utilizzato per la diagnosi di casi retrospettivi che hanno mostrato malattie neurologiche per determinare il carico dellarabbia 8. I tessuti fissati in formalina incorporati nella paraffina preservano le proteine per il rilevamento anche dopo diversi anni se conservati a temperatura ambiente9. Il trattamento con formalina modifica le proteine attraversando e alterando le catene laterali degli aminoacidi, il che potrebbe rendere gli epitopi non più reattivi contro gli anticorpi10. Mentre il test IHC per il rilevamento dell'antigene della rabbia coinvolge mAbs o pAbs, quest'ultimo è vantaggioso in quanto possono essere rilevati più epitopi e lyssavirus divergenti11.
Le fasi standard coinvolte nell'IHC sono la fissazione della formalina dei tessuti, l'incorporamento in blocchi di paraffina, il sezionamento dei tessuti, la deparaffinizzazione e l'idratazione, il recupero dell'epitopo, la reattività contro gli anticorpi primari e secondari e lo sviluppo utilizzando substrati cromogenici. Questo manoscritto descrive un resoconto dettagliato del protocollo per la diagnosi della rabbia. Per il rilevamento dell'antigene della rabbia, viene utilizzato il siero di topo immunizzato con RABV (pAbs) generato presso i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) di Atlanta, in Georgia, in combinazione con anticorpi secondari anti-topo biotinilati. Gli addominali biotinilati sono rilevati dall'aggiunta del complesso streptaviduina-rafano perossidasi (HRP) seguito dallo sviluppo del colore con substrato amino-etilcarbazolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l'obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre, dovrebbe essere seguito un corretto contenimento e manipolazione di sostanze chimiche pericolose (come formalina, AEC e xilene) (ad esempio, cappe aspiranti).
1. Fissazione della formalina dei tessuti
- Posizionare i tessuti cerebrali di 3-5 mm raccolti dopo l'autopsia13 in una soluzione di formalina tamponata con fosfato al 10% (rapporto tessuto/formalina da 1:20 a 1:50) per 24-72 ore.
ATTENZIONE: La formalina è un fissativo tossico. - Registrare il peso approssimativo del tessuto (dimensioni), il tipo di tessuto (aree cerebrali) e il volume di formalina. È importante che i laboratori documentino e mantengano registri sui tempi di fissazione.
- Per una conservazione più lunga del tessuto dopo la fissazione della formalina e prima della lavorazione, posizionare il tessuto in etanolo al 70%.
2. Lavorazione dei tessuti
- Dopo la fissazione del campione, sezionare il tessuto per includere le aree cerebrali importanti, ad esempio le sezioni trasversali del tronco cerebrale, del cervelletto (3 lobi) o dell'ippocampo (entrambi gli ippocampi) ciascuno tagliato da 3 a 5 mm di spessore e inserito in cassette di elaborazione.
- Elaborare le cassette di tessuto per l'infiltrazione di cera di paraffina, incorporate in blocchi di paraffina e sezionate (da 3 a 6 μm) su un microtomo.
3. Preparazione dei materiali / colorazione dei piatti
- Impostare la macchia14 (Tabella dei materiali) come mostrato nella Figura 1. Riempire ogni piatto con 250 ml di soluzione.
- Preparazione della soluzione stock di substrato 3-ammino-9-etilcarbizolo (AEC)
- Sciogliere una compressa da 20 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) in 5 ml di N,N, dimetilformammide usando una pipetta di vetro.
ATTENZIONE: AEC è cancerogeno.
- Sciogliere una compressa da 20 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) in 5 ml di N,N, dimetilformammide usando una pipetta di vetro.
- Preparazione della soluzione stock di proteasi (ad es. Pronase) per il recupero dell'antigene
- Sciogliere 7 mg della proteasi in 200 ml di PBS.
- Preparazione del tampone di risciacquo PBS-T
- Aggiungere 10 ml di Tween da 80 a 990 mL di PBS. Mescolare bene per formare una soluzione omogenea.
4. Deparaffinizzazione e reidratazione dei tessuti
- Fare una sezione di paraffina da 5 μm usando un microtomo, farla galleggiare a bagnomaria a 38 °C e raccogliere su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna/pennarello resistente ai reagenti.
- Posizionare i vetrini su un vassoio e sciogliere in forno a 55-60 °C per 1 ora. Non alzare la temperatura al di sopra di 60 °C in quanto può distruggere l'antigene virale.
- Togliere i vetrini dal forno e deparaffinizzare immediatamente in 3 risciacqui consecutivi di xilene da 5 min ciascuno nei piatti 1, 2 e 3.
- Reidratare le sezioni sul vetrino mediante immersioni sequenziali diminuendo la diluizione dell'etanolo in acqua deionizzata: (da 4 a 11 è un risciacquo a immersione) piatto 4: xilene/ 100% etanolo (1:1); piatto 5: 100% etanolo; piatto 6: 100% etanolo; piatto 7: 95% di etanolo; piatto 8: 95% etanolo; piatto 9: 80% di etanolo; piatto 10: 70% etanolo; piatto 11: acqua deionizzata (Figura 1. Allestimento del piatto).
ATTENZIONE: Lo xilene è una sostanza chimica pericolosa e il lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante.
5. Recupero dell'antigene proteolitico
- Trattare i vetrini con la proteasi (2,5 μg/mL di PBS) per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico nel piatto 12.
- Quindi risciacquare in PBS-T per 10 minuti (piatto 13).
- Trattare con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti (piatto 14).
- Ancora una volta, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 15).
6. Procedura di colorazione
- Maneggiare le diapositive una alla volta mantenendo le diapositive rimanenti immerse nel buffer (non rimuovere l'intero supporto della slitta - mantenere le diapositive bagnate). Rimuovere un vetrino e asciugare il tampone in eccesso (usando un tovagliolo di carta) da intorno alla sezione del tessuto facendo attenzione a non disturbare la sezione del tessuto. Incubare i vetrini in una camera di umidità, realizzati posizionando asciugamani di carta inumiditi, sul banco da laboratorio14 a temperatura ambiente con normale siero di capra (blocco) per 15 minuti.
- Incubare con l'anticorpo antirabbico primario di diluizione predeterminato ottimale (diluizione 1:250 del siero antirabbico di topo, non pubblicato) (controllo positivo) e anticorpi di controllo negativi a temperatura ambiente come sopra (fase 6.1.) per 60 minuti senza lavaggi intermedi.
- Dopo 60 minuti, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con l'anticorpo biotinilato (specie specifica) in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (manipolazione come al punto 6.1.).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con il complesso Streptavidin-HRP in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (manipolazione uguale a 6.1.).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con substrato di perossidasi, amino-etilcarbazolo (AEC), in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Fare AEC appena prima dell'uso. Per fare ciò, aggiungere 1 mL di soluzione stock AEC a 14 mL di tampone di acetato 0,1M, pH 5,2. Aggiungere 0,15 ml di 3% H2O2. Filtrare la miscela appena prima dell'uso (filtro da 0,45 μm).
NOTA: La soluzione di lavoro di AEC è stabile solo per 2-3 ore. La soluzione stock AEC può essere conservata in frigorifero per periodi più lunghi. - Lavare in acqua deionizzata 10 min (piatto 17)
- Controintagliato con ematossilina di Gill diluita 1:2 con acqua deionizzata per 2 minuti (piatto 18).
- Risciacquare l'eccesso di ematossilina con risciacquo a immersione in acqua deionizzata (piatto 19 e 20).
- Risciacquare nel piatto Scott's Tap water 30 s (soluzione bluing) 21.
- Lavare in acqua deionizzata 10 min (piatto 22)
- Rimuovere le diapositive una alla volta - montare con un mezzo di montaggio solubile in acqua.
- Leggi le diapositive su un microscopio ottico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all'ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cerebrale; Figura 2D-F corrisponde alle cellule del cervelletto e di Purkinje; e figura 2G-I corrispondono all'ippocampo. Figura 2C,F,I sono campioni di controllo negativi. La colorazione rosso magenta dimostra lo sviluppo del colore utilizzando il substrato AEC sullo sfondo blu (hematoxylin counterstain) a causa della reattività degli anticorpi contro l'antigene della rabbia. L'AEC è un substrato di perossidasi che, dopo una reazione di ossidazione, catalizzato dall'HRP, si traduce in precipitato insolubile in acqua osservabile al microscopio ottico.
Un risultato positivo in IHC corrisponde alla colorazione rosso magenta nelle sezioni tissutali. La colorazione di inclusioni citoplasmatiche e inclusioni granulari di varie dimensioni sono indicative di campioni positivi per infezioni da RABV. I campioni sono considerati negativi se non è stata osservata alcuna colorazione rossa specifica o solo lo sfondo blu dovuto all'ematossilina. Oltre alla colorazione positiva, la distribuzione delle inclusioni potrebbe fornire una quantificazione indiretta dei livelli di antigene della rabbia nel campione, che potrebbe corrispondere alla carica virale dei campioni di tessuto. Indipendentemente dai livelli di distribuzione, qualsiasi colorazione specifica classificherà il campione come positivo per il rilevamento dell'antigene RABV.
Figura 1: Diagramma di flusso che indica diversi passaggi per i test IHC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione immunoistochimica del tessuto cerebrale positivo e negativo della rabbia. (A) Inclusioni virali intracitoplasmatiche e rilevamento dell'antigene del virus della rabbia nel tronco cerebrale ingrandimento totale 200x; (B) tronco cerebrale positivo 400x; (C) controllo negativo del tronco cerebrale 200x; (D) inclusioni del virus della rabbia all'interno del cervelletto 200x; (E) cellule di cervelletto e Purkinje 400x; (F) controllo negativo del cervelletto; (G) Inclusioni virali all'interno dell'ippocampo 200x; (H) ippocampo 400x; controllo negativo dell'ippocampo 200x. La macchia rossa indica la presenza di antigene del virus della rabbia utilizzando il metodo di colorazione del complesso Streptavidin-biotina (substrato AEC). Controstain di ematossilina (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A causa dell'elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l'insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l'infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell'antigene RABV. Mentre i tessuti fissati nella formalina hanno proteine stabilizzate a causa della modifica delle catene laterali come la reticolazione, i campioni devono essere elaborati prima del rilevamento dell'antigene. In questo protocollo, gli epitopi sono stati recuperati attraverso la digestione proteolitica parziale dalla proteasi (ad esempio, Pronasi) per consentire il legame degli anticorpi primari al complesso RNP. Mentre gli mAbs reattivi contro la proteina N sono prevalentemente invocati in DFA e DRIT, i pAbs che sono reattivi contro più epitopi sulla proteina N sarebbero preferiti per un test IHC. Inoltre, la reattività o pAbs potrebbe essere più ampia contro diverse varianti di RABV e contro i lyssavirus non rabbici rispetto a mAbs.
Una delle principali limitazioni del test IHC è che il protocollo prevede diversi passaggi sequenziali e richiede circa 6 ore per il completamento. Se il tessuto deve essere fissato in formalina e incorporato in blocchi di paraffina, richiede altri 1 - 2 giorni prima che il tessuto possa essere macchiato. Un'altra limitazione è la non disponibilità di anticorpi antirabbici primari commerciali per il test IHC. Tuttavia, IHC fornisce un'opzione per eseguire la diagnosi di rabbia quando solo i tessuti FF sono disponibili per il test. Il test IHC è particolarmente importante per testare i casi di rabbia se metà dei tessuti sono conservati in formalina (e altri tessuti non fissati testati da DFA) ed è stato necessario testare la sezione trasversale completa del tronco cerebrale e di altri tessuti, come richiesto per la diagnosi. Il rilevamento dell'antigene della rabbia mediante test IHC può essere utilizzato per campioni di cervello umano post-mortem per la diagnosi e / o l'analisi retrospettiva di casi sospetti in base ai sintomi clinici. Mentre l'IHC non è stato approvato come test primario o di conferma per la diagnosi di rabbia, come il DFA, il metodo rileva l'antigene utilizzando anticorpi specifici per la rabbia. Il confronto tra DFA utilizzando tessuti freschi/congelati e FF ha fornito sensibilità e specificità simili15. A meno che gli anticorpi non siano direttamente coniugati al FITC (il requisito per il test DFA), gli anticorpi etichettati HRP possono essere utilizzati in IHC per la colorazione dell'antigene della rabbia. Il vantaggio con il rilevamento basato su HRP è la possibilità di utilizzare un microscopio ottico per l'osservazione. Gli attuali reagenti DFA disponibili in commercio, gli anticorpi specifici della rabbia coniugati FITC (mAbs) non rilevano l'antigene dopo la fissazione della formalina a causa della modifica degli epitopi. Tuttavia, se sono disponibili pAbs specifici per la rabbia coniugata FITC, può essere utilizzato come metodo di colorazione, come raccomandato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità16. Oltre al rilevamento dell'antigene, i tessuti FF possono essere sottoposti all'isolamento dell'RNA seguito dalla PCR e dal sequenziamento utilizzando primer specifici per confermare la presenza di RNA genomico RABV.
Gli altri vantaggi dei tessuti fissati con formalina includono la determinazione dei cambiamenti istologici con il metodo di colorazione dell'ematossilina e dell'eosina. Mentre il trattamento con formalina preserva le proteine, inattiva completamente la maggior parte dei patogeni nel campione a causa dell'ampia reticolazione delle proteine e della degradazione o modifica degli acidi nucleici. Pertanto, il metodo migliora la sicurezza della gestione, della spedizione e dei test dei campioni biologici rispetto al DFA. La fase di fissazione dell'acetone nel DFA non inattiva rabv e deve essere maneggiata con dpi appropriati17. I campioni dopo la fissazione della formalina sono stabili e possono essere conservati a temperatura ambiente, che è adatta per aree a bassa risorsa in cui l'accesso a una cella frigorifera è limitato. Allo stesso modo, i tessuti fissati in formalina incorporati nella paraffina possono essere considerati per la conservazione a lungo termine a temperatura ambiente senza perdere la reattività anticorpale contro le proteine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L'uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l'identificazione e non implica l'approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
