Summary
Vi beskriver teknikker til differentiering induktion af to bryst epitellinjer, HC11 og EpH4. Mens begge kræver føtal kalv serum, insulin, og prolaktin til at producere mælkeproteiner, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i mammsfærer i tre-dimensionel kultur. Disse komplementære modeller er nyttige til undersøgelser af signaltransduktion af differentiering og neoplasi.
Abstract
Cadherins spiller en vigtig rolle i reguleringen af celledifferentiering samt neoplasi. Her beskriver vi oprindelsen og metoderne til induktion af differentiering af to musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4, og deres anvendelse til at studere komplementære stadier af mælkekirtlen udvikling og neoplastiske transformation.
DEN HC11 mus bryst epitelcelle linje stammer fra mælkekirtlen af en gravid Balb / c mus. Det differentierer, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i medium, der indeholder føtal kalv serum og Hydrocortison, jegnsulin og Prolactin (HIP medium). Under disse betingelser producerer HC11-celler mælkeproteiner β-kasein og vallesyreprotein (WAP), svarende til diegivende mælkeepitelceller, og danner rudimentære mælkekirtellignende strukturer kaldet "kupler".
Den EpH4 cellelinje blev afledt af spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel celler isoleret fra en gravid Balb / c mus. I modsætning til HC11, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i sfæller (også kaldet mammosfærer), når dyrket under tre-dimensionelle (3D) vækstbetingelser i HIP medium. Celler trypsiniseres, suspenderes i en 20% matrix bestående af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkomceller, belagt oven på et lag koncentreret matrix belægning en plast petriskål eller flerbrøndplade, og dækket med et lag på 10% matrix-holdige HIP medium. Under disse betingelser danner EpH4-celler hule sfæller, der udviser apical-basal polaritet, en hul lumen og producerer β-kasein og WAP.
Ved hjælp af disse teknikker, vores resultater viste, at intensiteten af cadherin / Rac signal er afgørende for differentiering af HC11 celler. Mens Rac1 er nødvendig for differentiering og lave niveauer af aktiveret RacV12 øge differentiering, høje RacV12 niveauer blokere differentiering samtidig inducerende neoplasi. I modsætning hertil repræsenterer EpH4-celler en tidligere fase i mælkeepiteldifferentiering, som hæmmes af selv lave niveauer af RacV12.
Introduction
I normale væv eller tumorer, celler har omfattende muligheder for vedhæfte til deres naboer i en tre-dimensionel organisation, og dette efterlignes i kultur ved høj tæthed cellevækst. Celle-til-celle vedhæftning formidles hovedsageligt gennem cadherin receptorer, som definerer celle og væv arkitektur. Interessant, det blev for nylig vist, at cadherins også spille en stærk rolle i signal transduktion, især i overlevelse signalering1. Paradoksalt nok, nogle af disse celle-til-celle vedhæftning signaler stammer fra cadherins blev for nylig anset for at være delt af både differentiering og neoplasi2. Her beskriver vi metoder til induktion og vurdering af differentiering i to repræsentative typer af musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4.
HC11 mus bryst epitelcellelinje kan give en nyttig model for studiet af epitelcelle differentiering. HC11 celler er en KOMMA-1D-afledt cellelinje, der stammer fra mælkekirtlen i en midgravid Balb/c mus3. I modsætning til andre KOMMA-1D-afledte kloner har HC11-klonen ikke noget krav om udefrakommende tilsat ekstracellulær matrix eller samdyrkning med andre celletyper til in vitroinduktion af det endogene β-kaseingen ved laktogene hormoner3. Denne cellelinje er blevet anvendt i udstrakt grad i differentieringsundersøgelser, fordi den har bevaret vigtige egenskaber ved det normale mælkeepitel: HC11-celler kan delvist rekonstruere kanalepitel i en renset mælkefedtpude4. Desuden, de kan differentiere i en to-dimensionel (2D) kultur, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i overværelse af et steroid som Hydrocortison eller Dexamethason, ud over jegnsulin og Prolactin (HIP medium) mangler epidermal vækstfaktor (EGF), en hæmmer af differentiering5,6,7. Under disse omstændigheder producerer HC11-celler mælkeproteiner såsom β-kasein og WAP, som kan påvises ved vestlig blotting inden for 4 dage efter induktion. Samtidig danner en del af HC11 celler rudimentære mælkekirtellignende strukturer, der kaldes "kupler" på en stokastisk måde. Kupler er synlige 4-5 dage efter induktion og gradvist stigning i størrelse op til dag 10, samtidig med en stigning i β-kasein produktion8. Interessant, HC11 celler besidder mutant p539, og derfor repræsenterer en præneoplastisk tilstand. Af denne grund er HC11-modellen velegnet til at studere signalnetværk af differentiering i forbindelse med neoplasi i samme cellesystem.
EpH4 celler, et derivat af IM-2 celler, er en nontumorigenic celle linje oprindeligt stammer fra spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel epitelceller isoleret fra en mid-gravid Balb /c mus10. EpH4 celler danner kontinuerlig epitelmonolag i 2D-kultur, men skelner ikke i kirtellignende strukturer10,11. Men efter 3D-vækst i et materiale, der består af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af EHS mus sarkomceller12 (EHS matrix, matrix, eller Matrigel, se Tabel over materialer),ud over stimulation med HIP, EpH4 celler kan opsummere de indledende faser af mælkekirtlen differentiering. Under disse betingelser danner EpH4-celler sfæller (også kaldet mammøsfærer), der udviser apical-basal polaritet og et hult lumen, og er i stand til at producere mælkeproteiner β-kasein og WAP, svarende til lakterende mælkeepitelceller. I modsætning til HC11 celler, som er udifferentierede, og nogle udtrykke mesenkymale markører13, EpH4 celler udviser en rent luminal morfologi14. EpH4 celler er også blevet rapporteret til at producere mælkeproteiner i 2D-kultur gennem stimulation med dexamethason, insulin, og prolaktin15. Men, denne tilgang udelukker undersøgelse af lovgivningsmæssige virkninger, der efterligner mælkekirtlen mikromiljø i 3D-kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating HC11 Celler
- I en laminar flow hætte ved hjælp af sterile teknikker forberede en flaske med 50 ml HC11 celle medium: RPMI-1640 med 10% føtal kvæg serum (FBS), 5 μg/ml insulin, og 10 ng /mL EGF (se Tabel over materialer).
- Plade ca 400.000 celler pr 3 cm petriskål: Pass to 10 cm, 50% sammenflydende Petri retter i tyve 3 cm retter i HC11 medium. Cellerne skal være godt spredt ud, men tørring skal undgås.
- Aspirere mediet ind i en kolbe ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Der tilsættes 250 μL trypsin (se Materialetabellen)pr. 10 cm plade. Hvirvle og ramte pladen fra siderne og samtidig holde den vandret for at sprede trypsin og for at løsne de vedhæftede celler
- Overhold mikroskopi i fasekontrast med et 4x mål for at sikre, at cellerne er begyndt at løsne sig fra kanterne, før der pipetterer.
- Aspirate ca 1,5 ml HC11 medium i en steril, 9 tommer Pasteur pipette og sprøjte det lodret mod cellerne. Roter petriskålen, mens du sprøjter for at løsne alle celler. Du skal arbejde hurtigt for at undgå tørring af cellerne.
- Overfør alle celler til flasken med HC11 medium og hvirvle.
- Pipette 2 ml celleaffjedring i hver 3 cm petriskål. Rock petriskålene på tværs for at sprede sig jævnt. Cellerne anbringes i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Den næste dag, eller når cellerne er ~ 90-100% flydende, aspirere mediet, og erstatte det med medium med FBS og insulin, men mangler EGF.
2. Differentiering induktion, overvågning og kvantificering af HC11 Celler
- Efter dyrkning af celler i medium mangler EGF i 24 timer, tilsættes differentieringmedium (HIP medium) til ti 3 cm plader: RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortison (se Tabel over materialer),5 μg/mL Insulin og 5 μg/ml Prolactin (se Tabel over materialer)i op til 10 dage.
- Opbevar de øvrige 10 3 cm plader som kontrol: Skift til et medium med 10% FBS og 5 μg/ml insulin mangler EGF og HIP.
- Skift mediet hver 2-3 dage til både HIP-behandlede celler og kontrolelementer. Pipette mediet omhyggeligt for at sikre, at cellerne ikke løsner sig.
- For at overvåge differentieringen (dvs. dannelsen af "kupler"), observere cellerne under fase kontrast mikroskopi (Figur 1A, venstre panel). Hvis cellerne udtrykker grønt fluorescensprotein (GFP), skal der under fluorescensmikroskopi (excitation = 485/20; emission = 530/25; forstørrelse 240x; 20x objective)(figur 1A, højre panel).
- For at quantitate graden af differentiering, udtrække proteiner fra en petriskål hver af HIP-behandlede celler og kontrol, en gang om dagen i alt 10 dage og sonde vestlige blots for β-kasein (se Tabel over materialer)(figur 1B).
- Skrab cellerne på is med 1,5 ml iskold fosfatbuffer (PBS) i et 1,8 ml plastcentrifugerør.
- Pellet cellerne ved 350 x g, 1 min, 4 °C.
- Vask hurtigt pellet 2x med iskold PBS. Dræn eventuelle rester.
- Lav en lysis buffer: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM phenylmethylsulphonyl fluorid (PMSF), 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin16. Der tilsættes 100 μL pr. 3 cm petriskål.
- Afklare lysat ved centrifugering ved 10.000 x g i 10 min i kulden.
- Proteinkoncentrationen (se Materialetabellen)og belastning 10-20 μg protein fra hver prøve på en 10% polyacrylamid-SDS-gel.
- Elektroforer i 15 timer ved 45 V, eller ved 100 V for ~ 2-2,5 h.
- Overfør til en nitrocellulose- eller PVDF-membran ved hjælp af et elektroblottingoverførselsapparat (se Materialetabel).
- Blok med 5% kvæg serum albumin (BSA) i Tris-buffered saltvand med 0,1% Tween-20 (TBST).
- Tilsæt det primære antistof, gede anti-β-kasein fortyndet 1:2.000 eller mus anti-β actin fortyndet 1:1.000 (se Tabel over materialer).
- Vask 3x med TBST, 5 min hver gang.
- Tilsæt det sekundære antistof, peberrodperoxidase (HRP) forbundet æsel anti-ged fortyndet 1:2,500, eller HRP forbundet hest anti-mus antistof fortyndet 1:10,000.
- Vask 3x med TBST, 5 min hver gang.
- Tilføj ECL reagenser til membranen i henhold til producentens anvisninger (se Tabel over materialer).
3. Plating og 3D-vækst af EpH4-celler i EHS Matrix
BEMÆRK: Matrixen er flydende ved temperaturer <10 °C og fast ved temperaturer over. Opbevares ved -80 °C. Tø op ved 4 °C natten før brug. Forchill vævskulturpladerne og pipettespidserne ved -20 °C før håndtering og holde matrix, plader og pipettespidserne på is for at forhindre, at de størkner.
- Dyrk EpH4-celler i 2D i RPMI-1640-mediet med 10% FBS og 5 μg/ml insulin (EGF er ikke påkrævet).
- EpH4-vækstmediet suppleret med 10 % (v/v, 3.500 μL) eller 20 % (v/v 2.000 μL) matrix i to 50 ml koniske rør. Hold på is, indtil klar til brug.
- Coat 10 brønde (1 cm2 hver) af en 24 brøndplade med 150 μL ufortyndet matrix. Spred matrixen ved hjælp af en pipettespids. Undgå at skabe bobler. Tryk forsigtigt på siderne af pladen, mens du holder den vandret for at sikre, at matrixen fordeles jævnt over bunden af brønden.
- Inkuber 24 brøndpladen ved 37 °C i 1 time, så matrixen størkner.
- Trypsinisere EpH4-celler som beskrevet ovenfor for HC11-celler og tælle dem med et hæmocytometer. Overfør 5 x 104 celler pr. brønd til et 1,5 ml sterilt konisk centrifugerør og spin ved 250 x g i 5 min.
- Forsigtigt aspirere mediet og læg røret på is.
- Opslæmningsceller i 350 μL EpH4 vækstmedium suppleret med 20% matrix ved hjælp af en 1 ml pipettespids, samtidig med at det koniske rør holdes på is. Undgå bobler. Det er vigtigt at sikre en enkelt celle suspension.
- Når det nederste lag matrix har størknet (matrixen skal vises gennemskinnelig og lysere i farven i forhold til den oprindelige belægning af brønde), tilsæt 350 μL celle suspension til hver belagt godt og sted i en CO2 inkubator ved 37 °C for ~ 1 time at tillade 20% matrix lag til at størkne.
- Overhold cellerne mikroskopisk under fase kontrast med en 4x mål. Enkelte celler skal være synlige.
- Der tilsættes 200 μL EpH4-medium, der indeholder 10 % matrix oven på 350 μL celler, der er ophængt i 20 % matrix. Inkuber ved 37 °C.
4. Differentiering induktion af EpH4 celler dyrket i 3D(figur 2)
BEMÆRK: Udover differentiering, EpH4 celler kan også gennemgå tubulogenese når stimuleret med HGF (hepatocyt vækstfaktor) i 3D-kultur. Rørformede udvækster kan ses efter 10 dages HIP og HGF stimulation.
- Begynd differentiering induktion af EpH4 celler 1 dag efter plating i matrixen. Fjern forsigtigt 150 μL topmedium, der indeholder 10% matrix, fra brøndene ved hjælp af en plastikpipettespids. Der tilsættes 200 μL EpH4-medium, der indeholder HIP og 10 % matrix.
- Udskift 10% matrix-HIP-mediet hver 2. Dyrk kontrolceller i det samme matrixmedie på 10 % uden HIP.
- Overvåg mammosfæredannelse under fasekontrast(figur 3A, nederste panel).
5. Tubulogenese Induktion af EpH4 Celler dyrket i 3D(figur 3A og 3C)
- Forbered 24 brøndplader og EpH4-celler til vækst i matrix som beskrevet i trin 3.1-3.9. Dagen efter plating af cellerne i matrixen fjernes 150 μL EpH4-medium, der indeholder 10 % matrix, fra brøndene ved hjælp af en plastikpipettespids. Der tilsættes 200 μL EpH4-medium, der indeholder 10 % matrix, HIP og 20 ng/mL HGF (se Materialetabel).
- Udskift 10% matrix/HIP/HGF-mediet hver 2.
- Monitor tubule dannelse mikroskopisk ved hjælp af en 20x eller 40x mål(Figur 3A,højre panel).
6. Kvantificering af differentiering: Western Blotting for β-kasein
- Forsigtigt pipette off 10% matrix-HIP medium fra brøndene. Skyl 20% matrix lag 2x med 350 μL iskold PBS. Sfænoiderne skal stadig være til stede i matrixlaget.
- Der tilsættes 700-1.000 μL iskold PBS med 1 mM ethylenediamintetraeddikesyre (EDTA) direkte i brøndene. Fjern forsigtigt det nederste lag af 100% matrix en brønd med en pipettespids for at inddrive sfæroider til stede i dette lag. Ryst forsigtigt i 30 min ved 4 °C.
- Overfør forsigtigt sfænoide suspensionen til et konisk rør. Skyl brøndene med ~ 500 μL PBS-EDTA at inddrive eventuelle resterende sfænoder i brøndene og tilføje til det koniske rør.
- Rock på is i yderligere 30 min. Sørg for, at matrixen er helt opløst. Hvis synlige matrixklumper ses, skal du tilføje flere PBS-EDTA eller ryste længere.
- Centrifugereopløsningen til pellet sfænoider ved 350 x g i 5 min.
- Aspirere supernatant, lyse sfællerne i iskold lysis buffer, og sonde for β-kasein, cyclin D1, og p120RasGAP af vestlige blotting som i trin 2,5 over16. Som primære antistoffer, brug gede anti-β-kasein fortyndet 1:2,000, kanin anti-cyclin D1 fortyndet 1:2,000, og mus anti-p120 fortyndet 1:2,000. For sekundære antistoffer skal du bruge HRP-forbundet æsel anti-ged fortyndet 1:2.500, HRP-forbundet æsel antikanin fortyndet 1:2.500, og HRP-forbundet hest anti-mus fortyndet 1:10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har længe været kendt, at differentieringen af epitelceller og adipocytter kræver sammenløb og engagement af cadherins2. Vi og andre viste, at celle-til-celle vedhæftning og engagement af E- eller N-cadherin og cadherin-11, som opstår med sammenløbet af dyrkede celler, udløser en dramatisk stigning i aktiviteten af den lille GTPases Rac og celle division kontrol protein 42 (Cdc42), og denne proces fører til aktivering af interleukin-6 (IL6) familie cytokiner og Stat3 (signal transducer og aktivator af transskription-316,17)1,18,19. Da mange komponenter i cadherin/Rac/IL6/Stat3-vejen kan deltage i både differentiering og neoplastisk transformation, giver de molekylære håndtag til undersøgelse af indbyrdes sammenhængende processer.
Ved hjælp af de teknikker, der er beskrevet ovenfor, viste vi en slående afhængighed af differentiering på styrken af Rac signal i HC11 celler: Mens endogencRac1 er nødvendig for differentiering, og på lavt niveau mutationsaktiverede RacV12 forårsager en klar stigning i differentiering kapacitet, høj RacV12 niveauer udløse en dramatisk blok af differentiering, mens inducerende neoplasi (Figur 1B). I modsætning hertil blokerede selv lave niveauer af RacV12-udtryk differentieringen i EpH4-celler2. Selv om RacV12 aktiverer Stat3 i mange cellesystemer, herunder HC1116, blokerede mutationsaktiveret Stat3C desuden differentiering, mens den inducerer neoplastisk transformation20.
Vi undersøgte yderligere differentieringsegenskaberne for EpH4-celler i en 3D-matrixkultur. Mens β-kaseinproduktionen toppede ved 8-10 dage, var cyclin D-1-udtrykket maksimeret 4-6 dage efter HIP-stimulering (figur 3B). Disse resultater understøtter en omvendt sammenhæng mellem spredning og differentiering i EpH4-modellen. Ved hjælp af DAPI (nuklear) farvning og konfokal mikroskopi til at bestemme placeringen af individuelle epitelceller, observerede vi indre celledød og dannelsen af hule lumen i mammsfærer (Figur 3A,C). Vi viste endvidere, at tilsætning af HGF (20 ng/ml) ved 48 timer til HIP-mediet resulterede i dannelsen af rørformede strukturer (figur 3A, C), i overensstemmelse med tidligere elektronmikroskopiundersøgelser21. Disse tilgange ved hjælp af EpH4-modellen gør det muligt at karakterisere specifikke træk ved mælkeepiteldifferentiering og deres tilknytning til forskellige signaltransduktionsveje.
Figur 1: Vurdering og kvantificering af HC11 celledifferentiering. (A) En kuppel dannet i HC11 celler, der udtrykker lave niveauer af GFP-RacV12 på 10 dage efter induktion af differentiering. Venstre: Fasekontrast; Højre: Fluorescens af samme felt (fotos ikke offentliggjort før). Skalastang = 100 μm; Forstørrelse = 240x; 20x mål. (B) Virkningen af RacV12 på HC11 differentiering: Lav (bane 19-24), mellemliggende (bane 13-18), eller høje (baner 7-12) niveauer af en RacV12-GFP fusion konstruktion blev udtrykt i HC11 celler. Efter vækst i fraværet af EGF i 24 timer blev cellerne tilskyndet til at differentiere med HIP-tilsætning eller ej som angivet. Vaskemiddelekstrakter blev fremstillet på det angivne antal dage senere og undersøgt for β-kasein eller β-actin som belastningskontrol. Bemærk den dramatiske stigning i β-kasein i lav RacV12-GFP udtrykke celler (baner 21-24 vs 3-6), og den dramatiske reduktion ved udtryk for høj RacV12-GFP(baner 9-12). NE = Kontrolkulturer, der dyrkes uden Globaliseringsfonden, men ikke tilskyndet til at differentiere (Niit et al.2, gengivet med tilladelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skemaaf overlay metode til dyrkning af EpH4 celler i 3D matrix kultur. (A) Brøndene i en 6 brøndplade blev oprindeligt belagt med 100% EHS-matrix, som fik lov til at størkne ved 37 °C, der dannede en geléseng af kældermembranen, der måler ca. 2-5 mm i tykkelse. EpH4 celler blev seedet på denne seng som en enkelt celle suspension i HIP medium med 20% matrix. Dette blev overlejret med 10% matrix i HIP medium. Matrixmediet på 10 % blev udskiftet hver anden dag. Celler formeret og begyndte at danne mammsfærer efter 4-5 dage i kultur (se protokolafsnit). (B) Fase kontrast billeder af EpH4 celler i 2D (monolayer) og 3D (mammøsfæren) kultur blev fanget ved hjælp af et mikroskop udstyret med et digitalt kamera (300x forstørrelse). Repræsentative billeder på hvert trin vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Begivenheder i 3D acinar morfogenese af EpH4 i 3D-kultur. A) EpH4-celler blev dyrket i matrixbelagte 6 brøndplader og vedligeholdt i komplet 3D-medium som i figur 2. I de tidlige stadier af morfogenese, celler spredt, dannet klynger, og organiseret i to grupper: (1) et ydre lag af polariserede celler og (2) en indre klynge af uorganiserede celler, der gennemgik celledød, svarende til apoptose som vist tidligere12. Sidstnævnte førte til dannelsen af en hul lumen, karakteriseret ved mørkning af midten af mammsfærerne som set ved fase kontrast mikroskopi. Tilsætning af HGF (20 ng/ml) til mediet resulterede i dannelsen af rørformede strukturer. Mere end 60% af HGF-induceret aggregater viste tubulogenese, sammenlignet med ubehandlede kontrol aggregater, som ikke. Et repræsentativt fasekontrastfotografi af celler på hvert trin blev fanget ved hjælp af et mikroskop udstyret med et digitalt kamera (300x forstørrelse; Skalastang = 100 μm). Resultaterne er repræsentative for mindst tre forsøg. Schematic blev tilpasset fra Starova et al.22. B) EpH4-celler, der dyrkes i 3D, blev høstet på de angivne dage. Proteinkoncentrationerne blev normaliseret, og lige store proteinmængder (20 μg) blev udsat for SDS-PAGE efterfulgt af vestlig blotting og sondering med de angivne antistoffer. En homogeniseret mælkekirtlen fra en ammende mus (MGT) blev brugt som en in vivo sammenligning. p120RasGAP blev anvendt som en uafhængig belastningskontrol. Cyclin D1 udtryk øget forbigående falder sammen med prolifererende celler i løbet af de første 3-4 dage. I modsætning hertil toppede β-kasein udtrykket på 8-10 dage, svarende til dannelsen af modne mammomsfærer. Resultaterne er repræsentative for to forsøg. (C) Lumendannelse og tubulogenese af mammøsfærer blev bekræftet ved hjælp af DAPI farvning af nukleart DNA (fluorescerende blå) i aggregater dyrket på matrixbelagte glasdækslips. Cellerne blev fastgjort i 3% paraformaldehyd, permeabiliseret med 25 μg/ml cL-citonin, og uspecifik binding blev blokeret med 3% BSA. Celler blev derefter plettet for nukleart DNA med DAPI (blå). Coverslips blev monteret på glasdias ved hjælp af et monteringsmedium. Fotomikrografer blev taget af det centrale XY-akseplan ved hjælp af et multifoton konfokalmikroskop (Skalabar = 100μm). Billeder i paneler B og C er tilpasset fra Starova et al.22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HC11 celler er velegnede til studiet af differentiering i forbindelse med neoplastisk transformation. En ekstra fordel er, at HC11 celler er let inficeres med Mo-MLV-baserede retrovirale vektorer til at udtrykke en række gener. I vores hænder, EpH4 celler var vanskeligere at inficere med de samme retrovirale vektorer end HC112.
Celle-til-celle kontakt og vækst anholdelse er centrale forudsætninger for HC11 celle differentiering. Således, for at opnå ensartet differentiering på tværs af cellelaget, er det vigtigt at opnå en ensartet fordeling af celler i petriskålen på tidspunktet for såning. Dette er især vigtigt, hvis der ønskes kvantificering af differentiering. Trypsinisering skal optimeres, så en enkelt celle suspension opnås, og celler ikke mister levedygtighed på grund af manipulationer.
Celler, der trypsiniseres, skal være subconfluent (50-70%), fordi celler dyrket til høje tætheder tendens til stærkt at holde sig til hinanden, og adskille dem er vanskeligt. For at undgå tørring af cellerne, aspirere med petriskålen fladt på gulvet i laminar flow hætte, derefter vippe til at dræne hurtigt. Dæk petriskålen med låget. Hvis det er nødvendigt, kan du fremskynde trypsinens virkning ved at placere petriskålen i en 37 °C-inkubator.
Fordi cellerne er meget flydende i løbet af de 10 dage efter induktion, er det vigtigt at erstatte de næringsstoffer, der er forarmet. Når mediet ændres, skal der også udvises forsigtighed for at undgå, at cellerne løsnes, hvilket måske ikke passer særlig godt til plasten på grund af høj celletæthed. Stadig, i vores erfaring er det ikke nødvendigt at bruge Petri retter belagt med fibronectin, kollagen, eller CellTak at opnå gode differentiering resultater, i modsætning til differentiere preadipocytter såsom 3T3L123 eller Balb / c3T3 derivater.
Nøjagtig proteinbestemmelse for blotting-eksperimenterne er kritisk. Da serumproteiner har tendens til at binde sig til vævskulturkvalitetenplast, er det vigtigt at skrabe og vaske cellerne i et 1,5 ml plastrør, der ikke tiltrækker proteiner, og tilat tilføje lysisbufferen på cellepelletiet i stedet for at lyse cellerne direkte på petriskålen24.
Med hensyn til proteinudvinding er det meget vigtigt at holde alle vaske- og lysisopløsninger iskolde og petriskåle eller EpH4 mammsfærer på is hele vejen igennem. Dette skyldes, at i mangel af calcium i PBS vaske kadriner er ikke engageret og som et resultat Stat3-ptyr705 er hurtigt dephosforrylated25.
Størrelsen af petriskåle, der er beskrevet for HC11-celler, er tilstrækkelig til 3-4 vestlige blots (dvs. mængden af protein, der genvindes pr. petriskål, er ca. 50 μg pr. 3 cm fad). Vi foretrækker at bruge 3 cm petriskåle til differentieringsforsøg for at lette proteinekstraktion. Hvis en 6 brønd bakke bruges i stedet, er det vanskeligt at udtrække proteiner fra en brønd i kulden og samtidig holde resten af brøndene sterile. Desuden er CO 2-koncentrationen vigtig for differentiering, og det er vanskeligt at vedligeholde den for resten af brøndene, da proteiner udvindes fra en brønd på bænken.
I vores erfaring, i modsætning til differentiering af preadipocytter23, flere masser af føtale kalv serum er i stand til at støtte væksten samt differentiering af HC11 eller EpH4 celler. En masse nyfødte kalv serum testet støttede ikke differentiering, selv om det kunne støtte normal vækst: cellerne syntes at differentiere i første omgang, men mistede deres evne til at differentiere efter tre passager i nyfødte kalv serum.
I modsætning til HC11 celler, differentiering af EpH4 celler er tæt forbundet med den omgivende 3D matrix arkitektur. Vi beskriver de trin, der kræves for EpH4 differentiering i 3D-kultur modificeret fra tidligere undersøgelser26,27,28 og efterfølgende proteinekstraktion til analyse af β-kaseinproduktion. EHS-matrixen er flydende ved lave temperaturer (<10 °C) og størkner ved højere temperaturer. Det opbevares normalt ved -80 °C, men bearbejdningaf aliquots kan opbevares ved -20 °C. Matrixen opkøs ved 4 °C natten før brug og før chillvævskulturplader og pipettespidser ved -20 °C før håndtering. For en nøjagtig vurdering af proteinkoncentrationen er det vigtigt at fjerne matrixen helt før ekstraktion med kold PBS-vask, fordi matrixen er rig på protein, hvilket kan forvirre proteinbestemmelsesresultaterne.
EpH4 afhængigheden af matrixen for differentiering er blevet påvist i flere forsøgsmodeller: Reichman et al.10 viste, at EpH4-celler fremkaldt af laktogene hormoner produceret β-kasein inden for områder med laminindeposition og intensiveret cytokeratinudtryk. Somasiri et al.11 viste, at PI3-kinase er nødvendig for klæbende krydsafhængige sfænoidedannelse og differentiativt genekspression af mælkeprotein. Brinkmann et al.21 påviste endvidere, at udtryk for transfected HGF cDNA i EpH4-celler induceret forgrening tubulogenese af sfæller i en 3D-kulturmodel, svarende til den observerede HGF-inducerede tubuledannelse set her (figur 3A,C). Disse resultater illustrerer fordelene ved EpH4 cellelinjemodel for at studere signalering af hændelser, der regulerer mælkekirteldifferentiering.
EpH4 celler kan også danne mammsfærer, når belagt i koncentrationer af føtal kalv serum lavere end de 10% beskrevet. Interessant, de kan danne mammsfærer ved lavere koncentrationer, eller endda i mangel af 20% eller 10% matrix, når belagt på toppen af et lag på 100% matrix22,27. I mangel af matrix i celleaffjedringen undgås nedkøling af cellerne. En ekstra fordel er, at alle celler findes i et enkelt plan, så de er lettere at fotografere.
Betydning: Cadherin engagement i dyrkede celler, som tilnærmer den fysiologiske tilstand af en celle in vivo, kan aktivere Rac/IL6/Stat3 vej. Dette kan være særligt vigtigt i epitelcelledifferentiering. Ved hjælp af de beskrevne teknikker, vores resultater udsat intensiteten af signalet stammer fra denne vej som en central determinant i balancen mellem celleproliferation vs differentiering, to fundamentalt modsatte processer2. Den dybtgående undersøgelse af E-cadherin/Rac/Stat3-aksen kan afdække nye amphiboløse komponenter i vejen afhængigt af ekspressionsniveauet, der kan udnyttes som mål for kræftbehandling. For sådanne mål, fuldstændig hæmning ville ikke være nødvendigt at vende den neooplastiske fænotype. Delvis hæmning ville endda være gavnligt, fordi de resterende mængder faktisk kan blokere transformation og fremme differentiering. Dette kan variere med målet samt den type tumor pågældende, som vist fra den forskellige adfærd RacV12 vs Stat3C, i HC11 vs EpH4 celler2,20.
Fremtidige anvendelser: Cadherin/Rac/IL6/Stat3-vejen kan spille en lignende rolle i differentieringen af andre epitelceller, såsom det menneskelige bryst MCF10A eller hundenyrene MDCK29 cellelinjer samt andre former for differentiering, som afhænger af cellesammenløb, såsom preadipocytter og myoblaster30, som udtrykker forskellige typer kadreriner. Endelig kan denne teknik udnyttes til undersøgelse af stat531's rolle og andre komponenter i differentiative veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Den HC11 celle linje blev venligt leveret af Dr. D. Medina (Houston, TX). Forfatterne er taknemmelige for Dr. Andrew Craig fra Queen's University for mange reagenser og værdifulde forslag. EpH4 celler var en gave fra Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ydede fremragende teknisk bistand til 3D-kulturstudier.
Den finansielle bistand fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), den canadiske Institutes of Health Research (CIHR), den canadiske Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario kapitel), den canadiske Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centre of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) og Clare Nelson arv fond gennem tilskud til LR er taknemmeligt anerkendt. BE modtaget tilskud støtte fra CIHR, CBCF, BCAK og Cancer Research Society Inc. PTG er støttet af en Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC og Canadian Cancer Society. MN blev støttet af et studenterprogram fra Terry Fox Training Program i Transdisciplinary Cancer Research fra NCIC, en Graduate award (QGA), og en Dean's Award fra Queen's University. MG blev støttet af postdoc stipendier fra den amerikanske hær Breast Cancer Program, Ministeriet for Forskning og Innovation i provinsen Ontario og det rådgivende forskningsudvalg for Queen's University. VH blev støttet af en CBCF ph.d.-stipendium og en postdoc stipendium fra Terry Fox Foundation Training Program i Tværfaglig Cancer Research i partnerskab med CIHR. Hanad Adan var modtager af et NSERC sommerstudenteri. BS blev støttet af en Queen's University graduate award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
