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Chemistry

Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.

Abstract

Se espera que los sistemas microfisiológicos (MPS) que cultivan organoides humanos recientemente introducidos funcionen mejor que los animales en la fase de pruebas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. En este estudio, la barrera intestinal humana (emulada por un co-cultivo de células Caco-2 y HT-29) y el equivalente hepático (emulado por esferoides hechos de células HepaRG diferenciadas y células estelares hepáticas humanas) se integraron en un dispositivo microfluídico chip de dos órganos (2-OC) para evaluar algunas propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas de paracetamol (APAP). El MPS tenía tres conjuntos: Intestina sólo 2-OC, Hígado sólo 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC con el mismo medio perfundiendo ambos organoides. Para las evaluaciones PK, dosificamos el APAP en los medios en los puntos de tiempo preestablecidos después de administrarlo ya sea sobre la barrera intestinal (emulando la vía oral) o en el medio (emulando la vía intravenosa), a 12 m y 2 M respectivamente. Las muestras de medios se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa. Los organoides se analizaron para la expresión génica, para los valores TEER, para la expresión y la actividad de las proteínas, y luego se recogieron, fijaron y sometieron a un conjunto de evaluaciones morfológicas. La técnica de MTT tuvo un buen desempeño en la evaluación de la viabilidad organoides, pero los análisis de alto contenido (HCA) fueron capaces de detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento APAP. Verificamos que el flujo de medios no afecta significativamente la absorción APAP mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente del hígado. La absorción intestinal humana APAP y el metabolismo hepático podrían emularse en el MPS. La asociación entre los datos MPS y el modelado en silicio tiene un gran potencial para mejorar la previsibilidad de los métodos in vitro y proporcionar una mayor precisión que los modelos animales en estudios farmacocinéticos y toxicológicos.

Introduction

Debido a las diferencias genómicas y proteómicas, los modelos animales tienen un valor predictivo limitado para varios resultados humanos. Además, son lentos, caros y éticamente cuestionables1. MPS es una tecnología relativamente nueva que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Son dispositivos microfluídicos que cultivan organoides (unidades funcionales de órganos miméticos artificiales) bajo un flujo de medios que promueve la comunicación organoide-organoides. Los organoides hechos de células humanas aumentan larelevanciatraslacional 2,3,4. Se espera que el MPS funcione mejor que las pruebas en animales porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. Cuando es completamente funcional, el MPS proporcionará resultados más significativos, a mayor velocidad y menores costos y riesgos4. Muchos grupos están desarrollando MPS para varios propósitos, especialmente modelos de enfermedades para probar la eficacia de los medicamentos.

El nivel de exposición es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficacia y toxicidad de los medicamentos5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permite la integración organoidea que emula la exposición sistémica y se espera que funcione mejor que el cultivo tradicional de tejido humano 2D. Esta tecnología puede mejorar significativamente la predicción de la absorción intestinal compuesta y el metabolismo hepático4.

Un MPS que integra el modelo humano equivalente del intestino y el hígado es un buen punto de partida, teniendo en cuenta el papel central de estos dos órganos en la biodisponibilidad de fármacos y la exposición sistémica13,14,15. APAP es un fármaco atractivo para el estudio de un MPS sin un equivalente renal porque su metabolización se realiza principalmente por el hígado16,17.

El 2-OC es un dispositivo microfluídico de dos cámaras adecuado para el cultivo de dos tejidos/organoides equivalentes humanos diferentes interconectados por microcanales16. Con el fin de emular una administración oral/intravenosa humana in vitro de un medicamento y evaluar los efectos de la conversación cruzada entre los equivalentes del intestino y del hígado en la farmacocinética APAP, además de la funcionalidad y viabilidad de los organoides, se realizaron tres conjuntos MPS diferentes: (1) un "Empentí 2-OC MPS" compuesto por un equivalente intestinal basado en un inserto de cultivo que contiene una cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada en el dispositivo 2-OC; (2) un "Liver 2-OC MPS" compuesto por esferoides hepáticos hechos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados en el dispositivo 2-OC; y (3) un "Empo del Hígado 2-OC MPS" compuesto por el equivalente del intestino en un compartimiento del dispositivo que se comunica con el equivalente hepático en el otro por el flujo de medios a través de los canales microfluídicos.

Todos los ensayos se realizaron en condiciones estáticas (sin flujo) y dinámicas (con flujo) debido al impacto de los estímulos mecánicos (compresión, estiramiento y cizallamiento) en la viabilidad y funcionalidades de la célula18,19,20. El presente artículo describe el protocolo para la emulación de administración oral/intravenosa APAP y los respectivos análisis de absorción/metabolismo y toxicológicos en el MPS 2-OC que contiene modelos equivalentes de intestino humano y hígado.

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Protocol

1. Producción de equivalentes de tejido para el cultivo en el 2-OC

  1. Producción equivalente a barrera del intestino delgado
    1. Mantener las células de Caco-2 y HT-29 utilizando el medio equivalente intestinal: DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales, que se nombra como "DMEM S" en este manuscrito.
    2. Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y agregue 8 ml de 0,25% de trippsina/EDTA para disociar las células de Caco-2 cultivadas en matraces de cultivo celular (175 cm2). Incubar durante 5 min a 37oC y detener la reacción añadiendo al menos el doble volumen de inhibidor de la trippsina. Realizar el mismo procedimiento para las células HT-29, ajustando los volúmenes de reactivos ya que se necesita una cantidad menor de estas células y se mantienen en matraces más pequeños (75 cm2).
    3. Centrifugar a 250 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante de ambos tubos, y resuspender los gránulos celulares en 10 ml de DMEM S. Contar las células, asegurando una viabilidad celular superior al 80%. Integrar asépticamente inserciones de cultivo celular en una placa de 24 pocillos previamente llena con 400 l de DMEM S por pozo en el lado basolateral (que representa el torrente sanguíneo humano).
    4. Co-cultivar células Caco-2 y HT-29 en una proporción de 9:121. Utilice 2.25 x 105 Células Caco-2 y 2.5 x 104 HT-29 a cada equivalente intestinal en un volumen final de 200 l de DMEM S. Ajustar los números de celda y el volumen de acuerdo con el número deseado de organoides. Mezcle con cuidado.
    5. Pipetear 200 l de solución celular en el lado apical de cada plaquita (que representa el lado humano del lumen intestinal), sembrando 250.000 células por plaquita. Co-cultivar las células en las inserciones durante tres semanas22. Cambiar el medio al menos tres veces a la semana, aspirando desde los lados apical y basolateral con una pipeta Pasteur estéril, teniendo cuidado de no dañar la barrera celular intacta.
      NOTA: Proceda con la aspiración en el lado apical, para no tocar la barrera celular (aspirar apoyando la pipeta Pasteur en el borde de plástico de la plaquita de celda).
    6. Compruebe la formación de monocapa ajustada midiendo el TEER (resistencia eléctrica transepitelial) cada tres días utilizando un voltímetro23,de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Realice un espacio en blanco, midiendo la resistencia a través de un inserto de cultivo celular sin celdas, pero con el mismo medio celular y en la misma placa de celda.
      2. Calcular la resistencia tisular restando la resistencia en blanco de la resistencia equivalente al tejido, y multiplicar por la superficie efectiva de la membrana del filtro (0,6 cm2). Una buena resistencia a la barrera intestinal está en un rango de 150 a 400 Ω cm2.
        NOTA: Después de 21 días las células deben estar completamente diferenciadas y la barrera intestinal formada, por lo que los equivalentes intestinales están listos para ser integrados en MPS.
  2. Producción de equivalentes hepáticos
    1. Mantener las células hepaRG utilizando el medio equivalente al hígado, que es el medio E de William complementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 5 g/ml de insulina humana y 5 x10 -5 Mcor hidroloneona, y se denomina "Williams E S" en este manuscrito. Renovar los medios de HepaRG cada 2-3 días y mantener el cultivo celular durante dos semanas para iniciar la diferenciación en hepatocitos y colangiocitos.
    2. Después de las dos primeras semanas, agregue 2% DMSO al medio de HepaRG durante dos semanas adicionales para completar la diferenciación celular24,25. Cultivar HHSTeC en Stellate Cell Media (SteC CM), utilizando matraces de cultivo celular recubiertos de poli-L-lisina, cambiando los medios cada dos o tres días.
    3. Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y añada 8 ml de 0,05% de trippsina/EDTA, para disociar las células hepaRG cultivadas en matraz de cultivo celular (175 cm2). Incubar de 5 a 10 min a 37oC y detener la reacción añadiendo al menos el doble del volumen del inhibidor de la trippsina. Realizar lo mismo para HHSTeC, adaptando el volumen del reactivo ya que se necesita una cantidad menor de estas celdas y se pueden mantener en matraces más pequeños (75 cm2).
    4. Centrifugar ambos a 250 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspendir los pellets celulares en el medio Williams E S. Contar las células, asegurando una viabilidad celular superior al 80%.
    5. Generar los esferoides hepáticos combinando células HepaRG y HHSTeC en una proporción de 24:1, respectivamente, en Williams E S medio16. Añadir 4,8 x 104 HepaRG diferenciados y 0,2 x 104 HHSTeC para componer cada esferoide hepático de 50.000 células, en un volumen de 80 l. Ajustar los números de celda y el volumen de acuerdo con el número deseado de esferoides. Mezcle con cuidado.
    6. Usando una pipeta multicanal, dispensar 80 l de la piscina de células combinadas en cada pocóter de 384 microplacas esferoides, que tiene geometría redonda bien inferior.
      NOTA: Después de cuatro días, se forman esferoides de unos 300 m.
    7. Usando puntas de diámetro ancho, transfiera los esferoides hepáticos a placas de 6 pozos de ultra-baja fijación, lo que permite el conteo "uno por uno" requerido.

2. Integración de los equivalentes de intestino e hígado en un MPS de 2 OC

  1. Conjunto de MPS de 2-OC del intestino para ensayo de absorción
    1. Pipetear 500 l de DMEM S en el compartimento más grande de 2-OC y 300 l en el más pequeño. Aspirar los medios basolaterales y apicales de cada barrera intestinal equivalente en las placas de 24 pozos. Usando fórceps estériles, integre una plaquita por circuito 2-OC, específicamente en el compartimiento más grande. Aplicar 200 l del medio intestinal en el lado apical.
      NOTA: Evite la formación de burbujas al integrar los organoides en el MPS.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
  2. Ensamblaje de MPS de hígado 2-OC para ensayo de metabolismo
    1. Pipetear 650 l de Williams E S en el gran compartimiento y 350 l en el compartimiento más pequeño, que recibirá los esferoides. En las placas de 6 pozos de fijación ultrabajo, cuente los esferoides con puntas de diámetro ancho. Cada equivalente hepático se compone de veinte esferoides26. Integre veinte equivalentes hepáticos por circuito, utilizando puntas de diámetro ancho, lo que permite la transferencia de organoides solamente, en el compartimiento más pequeño de un 2-OC.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
  3. Conjunto de MPS de 2 OC del intestino/hígado para el ensayo de absorción y metabolismo
    1. Combinar los dos medios (intest del intestino y del hígado) en una proporción de 1:4, lo que significa 200 l de DMEM S en el lado apical intestinal y 800 l de Williams E S en el lado basolateral. Integrar los equivalentes de intestino e hígado, simultáneamente, en el 2-OC.
    2. Conecte el MPS a la unidad de control, que debe estar conectada a un suministro de aire presurizado. Ajuste los parámetros: una presión de, aproximadamente, ±300 bar y una frecuencia de bombeo de 0,3 Hz. Iniciar el flujo 24 h antes de la administración de la sustancia de ensayo. Al día siguiente, realice el tratamiento APAP.
      NOTA: Para todos los experimentos, realice cada punto de tiempo en triplicado, lo que significa tres circuitos separados de 2 OC (es decir, 1 y 1/2 2 dispositivos DE 2 OC). El volumen total de cada circuito 2-OC es de 1 ml.

3. Preparación para paracetamol (APAP)

  1. Prepare la solución de stock APAP, disolviendo APAP en etanol absoluto. El día del experimento, diluir APAP en el medio respectivo (solución APAP), a una concentración de 12 m para la "administración oral" y de 2 M para la "administración intravenosa".
  2. Asegúrese de que la concentración final de etanol en la solución de control y tratamiento del vehículo sea del 0,5% para ambas administraciones. Para el control positivo (100 mM APAP), la concentración de etanol es del 2%.

4. Administración de sustancias de ensayo y muestreo de medios

  1. Administración "oral" de APAP y muestreo de medios
    1. Aspirar los medios basolaterales y apicales de cada equivalente de barrera intestinal en la pipeta de 2-OC. 500 l del medio de cultivo apropiado en el compartimento grande en el lado basolateral organoid y 300 l en el pequeño compartimiento.
    2. Compruebe si hay burbujas y proceda con el tratamiento equivalente a la barrera intestinal con la sustancia de ensayo en el lado apical, emulando la administración oral. Emular la administración "oral" de APAP añadiendo 200 l de una solución APAP de 12 m en el lado apical de las inserciones de cultivo intestinal, que representa el "lado lumen" intestinal (Figura 1B). Conecte el MPS a la unidad de control.
    3. Recoger el volumen total de los lados apical y basolateral en los siguientes puntos de tiempo: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, y 24 h15,27. Realizar todos los experimentos en triplicado, en condiciones estáticas y dinámicas, y recoger cada muestra, de cada triplicado, en un microtubo separado. Analice las muestras utilizando HPLC/UV.
      NOTA: Separe las muestras apicales y basolaterales.
  2. ApAP Administración "intravenosa" y muestreo de medios
    1. Emular la vía "intravenosa" mediante la administración de 2 M de solución APAP directamente en el compartimiento hepático. Aspirar todo el contenido medio de 2 OC. Pipeta de 650 l de Williams E S que contiene la sustancia de ensayo en el compartimento grande y 350 l del mismo soporte en el compartimiento más pequeño que contiene los 20 esferoides. Recoger todos los volúmenes en los siguientes puntos de tiempo: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h y 24 h27,28.
    2. Realizar todos los experimentos en triplicado, en condiciones estáticas y dinámicas. Recoger cada muestra, de cada triplicado, en un microtubo separado. Analice las muestras utilizando HPLC/UV.

5. Condiciones de instrumentación y cromatografía

  1. Análisis HPLC
    1. Establezca todos los parámetros relevantes para el análisis HPLC de acuerdo con la Tabla 1.
    2. Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,45 m al vacío. Filtrar las muestras a través de un filtro de jeringa PVDF de 0,22 m de tamaño de poro (diámetro 13 mm) y almacenarlas en un vial. Inicie la medición.
  2. Soluciones de stock, estándares de calibración y muestras de control de calidad (QC)
    1. Preparar 10 mM de soluciones de stock APAP en tampón de acetato de amonio (100 mM, pH 6.8) y diluir aún más con medios de cultivo celular DMEM S y Williams E S diluidos con tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) para lograr las soluciones de trabajo que van de 0,25 a 100,00 M.
    2. Incluya un conjunto de muestras de calibración en triplicado, así como muestras de control de calidad a cuatro niveles en triplicado. Prepare estas normas por dilución en serie.
    3. Cree curvas de calibración de áreas pico APAP frente a las concentraciones estándar nominales APAP. Determine el ajuste de regresión lineal para cada curva de calibración. Evalúe la bondad de ajuste de varios modelos de calibración mediante inspección visual, coeficiente de correlación, precisión intra e inter-ejecutar y valores de precisión.
    4. Inyectar muestras en blanco de medios DMEM S y Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) en sextuplicado. Preparar triplicados de muestras de control de calidad en medios DMEM S y Williams E S diluidos con tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) para las concentraciones APAP de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 y 90,00 m.
    5. Asegúrese de que las muestras de control de calidad se preparan a partir de una nueva solución de stock, diferente de la utilizada para generar una curva estándar. Utilice muestras de control de calidad para investigar las variaciones intra e intercote.
  3. Procedimientos de validación
    1. Realice la validación del método bioanalítico siguiendo los procedimientos notificados anteriormente29,30. Llevar a cabo las ejecuciones cromatográficas en cinco o seis ocasiones separadas, considerando los medios de cultivo celular Williams E S y DMEM S, respectivamente.
    2. Asegúrese de que los puntos de calibración que oscilan entre 0,25 y 100,00 m de APAP, en medios de cultivo celular DMEM S o Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v), se tracen en función de las áreas pico de APAP (eje y) frente a las concentraciones nominales respectivas (eje x). Compare las pendientes de estas curvas de calibración estándar con pendientes de curva de calibración preparadas en tampón de acetato de amonio. Asegúrese de que todas las curvas de calibración tengan un valor de correlación de al menos 0,998.
    3. Determine la precisión y precisión (intra e inter-run) para el analito en la matriz suplente utilizando réplicas en cuatro niveles diferentes LLOQ, bajo, medio y control de alta calidad en cinco o seis días diferentes. Realizar mediciones de precisión y precisión intrarmada el mismo día en medios de cultivo celular DMEM S o Williams E S diluidos en tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) que contiene 0,50, 4,50, 45,00 y 90,00 concentraciones de AP de MAP (n.o 3).
    4. Evalúe cada conjunto de muestras de control de calidad que contienen las concentraciones APAP a partir de curvas de calibración obtenidas recientemente. Probar la selectividad de los ensayos por el grado de separación del compuesto de interés y posibles otros picos cromatográficos causados por componentes que interfieren.
  4. Límite inferior de cuantificación (LLOQ) y límite de detección (LOD)
    1. Determine el límite inferior de cuantificación (LLOQ) en función de la desviación estándar de la respuesta y el enfoque de pendiente. Calcular utilizando la fórmula 10o/S, donde α es la desviación estándar de la intercepción y y S es la pendiente de línea recta obtenida mediante el trazado de las curvas de calibración29,30. Estimar el límite de detección (LOD) teniendo en cuenta 3,3 veces la desviación estándar del espacio en blanco, dividido por la pendiente de la curva de calibración29,30.

6. Equivalentes de tejido viabilidad/funcionalidad

  1. Mtt
    1. Realizar un ensayo de MTT para evaluar la viabilidad organoides en todos los puntos de tiempo del ensayo MPS. Como control negativo, utilice medios celulares más vehículo. Como control positivo, tratar los organoides con 100 mM APAP y 1% NaOH diluido en medio celular.
    2. Transfiera los 20 esferoides de cada réplica para pozos individuales en una placa de 96 pozos, y el cultivo celular inserta, que contiene los equivalentes intestinales, a 24 placas celulares de pozo, colocando un equivalente intestinal por pozo. Lave los equivalentes de tejido tres veces con 1x DPBS.
    3. Añadir 300 l de una solución de MTT de 1 mg/ml, diluida en el medio celular respectivo, por pozo. Incubar las placas durante 3 h en condiciones de cultivo celular estándar.
    4. Retire la solución MTT de cada pozo cuidadosamente pipeteando. Extraiga MTT formazan de los equivalentes del intestino y del hígado utilizando 200 l de isopropanol por pozo durante la noche a 4 oC.
      NOTA: Selle la tapa para evitar la evaporación.
    5. Transfiera 200 l de cada sobrenadante al pozo preidentificado respectivo en una placa de prueba micro de 96 pozos. Utilice isopropanol como blanco.
    6. Lea la absorbancia de formazan en un lector de placas a 570 nm. Calcular la capacidad relativa de las células para reducir MTT (%) utilizando la densidad óptica media de cada punto de tiempo, en comparación con el control negativo, considerado como 100% viabilidad celular.
  2. Citoquímica/Histología
    1. Fijar los equivalentes del intestino y del hígado, durante 25 minutos a temperatura ambiente, utilizando 4% (p/v) paraformaldehído en 0,1 M tampón fosfato-salina, pH 7.4. Lave los organoides 5 veces en el tampón de PBS durante 10 minutos cada vez. Mancha los equivalentes intestinales y hepáticos con tetrametilrhodamine isothiocyanate-phalloidin o Alexa Fluor 647 falhalloidin, 1:50 en PBS31.
    2. Transfiéralos al medio de congelación de OCT durante unos minutos para aclimatarse a RT antes de transferirlos al nitrógeno líquido hasta la congelación completa. Realizar criocciones de esferoides hepáticos de aproximadamente 10-12 m de espesor, utilizando un criostato.
    3. Monte las secciones de los tejidos en el medio de montaje con DAPI. Examínelos mediante microscopía de fluorescencia confocal.
    4. Congelar los organoides después de la fijación para realizar la tinción de hematoxilina y eosina de acuerdo con los protocolos establecidos. Monte las diapositivas con un medio de montaje después de cortar el tejido como se describió anteriormente y tome imágenes histológicas utilizando un microscopio óptico.
  3. Análisis de alto contenido
    1. Tinción mitocondrial y nuclear de las células
      1. Reconstituir el polvo liofilizado en DMSO para crear una solución de material de tinción mitocondrial de 1 mM (p. ej., MitoTracker Deep Red FM). Conservar la solución alícuota de stock a -20 oC protegida de la luz. Diluir la solución de la solución de tinción mitocondrial de 1 mM a la concentración final (200 nM) en un medio de cultivo de tejido precalentado (37 oC) sin suero.
      2. Quite el medio de cultivo celular. Añadir la solución de tinción mitocondrial para cubrir completamente la muestra e incubar las células durante 15-45 min a 37oC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
      3. Retire cuidadosamente la solución de trabajo de tinción mitocondrial y reemplácela con un fijador de paraformaldehído al 2-4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
      4. Enjuague suavemente las células fijas con PBS durante 5 minutos. Repita el proceso de lavado dos veces.
      5. Preparar una solución de material de tinción de ácido nucleico de 10 mg/ml (16,23 M) disolviendo 100 mg de tinte Hoechst 33342 en 10 ml de agua ultrapura.
        NOTA: La solución en stock debe ser alícuota y almacenada protegida de la luz a -20 oC.
      6. Preparar una solución de trabajo de tinción de ácido nucleico de 0,2-2,0 g/ml en PBS e incubar las células fijadas con solución de trabajo de tinción de ácido nucleico durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      7. Retire la solución de trabajo de tinción de ácido nucleico y enjuague las células suavemente con PBS durante 5 minutos tres veces. Las células deben mantenerse en PBS a 4 oC, protegidas de la luz.
    2. Análisis de tinción mitocondrial y nuclear
      1. Analizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia con conjuntos de filtros apropiados para la mancha de ácido nucleico (Ex/ -Em: 361/497 nm) y la mancha mitocondrial (Ex/ -Em: 644/665 nm). Encontrar células por manchado positivo de ácido nucleico y cuantificar el número celular. Cuantificar la intensidad de la fluorescencia de la mancha mitocondrial en las mitocondrias.
  4. Mediciones morfométricas (cálculos de esferoides) en ImageJ
    1. Exporte imágenes de análisis de alto contenido (HCA) como archivos *.flex desde el software Columbus. Importe archivos .flex como escala de grises en ImageJ utilizando el plugin Bio-Formats32: Archivo > Importar > Bio-Formatos.
    2. En la ventana Opciones de importación, seleccione Visualización de Hyperstack y habilite Dividir canales en Dividir en ventanas independientes. Esta opción permitirá el acceso de todos los archivos de un canal determinado (por ejemplo, DAPI, mitotracker, etc.). No seleccione Usar pila virtual en Administración de memoria.
      NOTA: Es preferible utilizar el canal DAPI como "polvo" en las imágenes, ya que el medio de cultivo se reduce en la longitud de onda UV (por ejemplo, 405 nm).
    3. Ajuste el tamaño de píxel (Analizar > Establecer escala) si no se cargó según los valores incrustados en el archivo .flex. Aplique un filtro Desenfoque gaussiano para eliminar el exceso de ruido y evitar irregularidades en el contorno de la forma. Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano. Un alto valor de Sigma (radio) entre 2.0 y 3.0 es ideal para la mayoría de los casos. Si la pila tiene varias imágenes, aplíquelas a todas ellas (seleccione Sí en la ventana Pila de procesos).
    4. Genere una imagen binaria para separar el fondo y los organoides (objetos) utilizando un umbral. Haga clic en Imagen > Ajustar > Umbral. Utilice la máscara roja para ajustar los valores de acuerdo con la intensidad de la imagen, para ajustarse a la forma organoide, manteniendo la morfología intacta. Deshabilite el fondo oscuro si la imagen tiene un fondo blanco. Haga clic en Aplicar.
    5. En la ventana Convertir pila en binario, elija el método Umbral. Por lo general, Default o Triangle se prefieren en este tipo de procesamiento de imágenes. Mantenga el fondo como oscuro. Seleccione Calcular umbral para cada imagen si hay varias imágenes en la pila.
    6. Seleccione Proceso > Binario > Rellenar agujeros. Opcionalmente, elimine los agujeros del fondo. En Proceso > Binario > Opcións, seleccione Fondo negro y vuelva a ejecutar Agujeros de relleno. Deshabilite la opción Fondo negro antes de continuar con el paso siguiente.
    7. Separar objetos. Para los organoides, el método de cuenca hidrográfica es una buena opción. Haga clic en Procesar > Binario > Cuenca hidrográfica. Ejecute el análisis de formas.
      1. Seleccione Analizar > Definir medidas. Hay varias opciones disponibles (detalles en https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Para organoides, seleccione Area, Valor gris medio, Valor gris mínimo y máximo y Descriptores de forma. Si lo desea, seleccione Mostrar etiqueta para identificar objetos en la imagen y Notación científica. Haga clic en Aceptar.
      2. Seleccione Análisis > Analizar partículas. Elija los límites Tamaño y Circularidad. Mantenga 0-infinity y 0.00-1.00, respectivamente, para medir todos los objetos de la imagen. En Mostrar, elija Esquemas para que se identifiquen los objetos. Habilite Mostrar resultados para generar resultados; Excluir en aristas para excluir objetos que toquen bordes; Incluya agujeros para que los agujeros interiores eventuales en los objetos se consideren como parte de la forma principal.
    8. Repita Análisis de formas para cada pila de imágenes y los resultados se anexarán en una sola tabla. Exporte la tabla de resultados en Archivo > Guardar como... como archivo de valores separados por comas (.csv).
  5. PCR en tiempo real
    1. Extraer ARN de equivalentes tisulares utilizando una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar la síntesis de ADNc mediante transcripción inversa de 1 – 2 g de ARN total.
    3. Amplifique todos los objetivos utilizando imprimaciones específicas genéticamente (Tabla 5) para realizar PCR cuantitativo en tiempo real. Cada qRT-PCR contiene 30 ng de ARN transcrito atrás y 100 nM de cada imprimación.
    4. Siga las condiciones de la PCR: 50 oC durante 3 minutos (1 ciclo); 95 oC durante 5 minutos (1 ciclo); 95 oC durante 30 segundos, 59 oC durante 45 segundos y 72 oC durante 45 segundos (35 - 40 ciclos).
  6. Ensayo CYP
    1. Siga la sección 2.2 para el montaje del hígado 2-OC. Los grupos experimentales son el control sin células, los tratamientos APAP de 2 m para 12 h, 24 h y el control del vehículo. Siga las secciones 3.3 y 4.2 para la preparación y el tratamiento de APAP 2 m.
      NOTA: Para asegurarse de que todas las muestras estarán listas al mismo tiempo para el ensayo DEL CYP, inicie el tratamiento de 12 h 12 horas después de iniciar el tratamiento de 24 h. Tratar el control sin células de la actividad cyp con una solución de etanol al 0,5%, así como el control del vehículo.
    2. Descongelar la solución de material de sustrato luminogénico de 3 mM a temperatura ambiente y hacer una dilución de 1:1000 en E S. Protect de William de la luz.
    3. Recoger esferoides y transferir cada grupo experimental a un pozo de una placa de 96 pozos. Retirar el medio, lavar dos veces con 100 l de 1x DPBS y añadir 80 l de solución de sustrato de 3 m por pozo. Mantenga el control sin celda en el medio E S de William. Ahorre un pozo sin esferoides ni solución de sustrato para un control de fondo. Incubar durante 30-60 min a 37oC con 5% de CO2,protegido de la luz.
    4. Reactivo de detección de Luciferina liofilizada (LDR) equilibrado utilizando el búfer de reconstitución con esterasa. Mezclar arremolinando o invirtiendo. Guarde el volumen apropiado a temperatura ambiente hasta el siguiente paso.
      NOTA: El LDR reconstituido se puede almacenar a temperatura ambiente durante 24 horas o a 4 oC durante 1 semana sin pérdida de actividad. Para almacenamiento a largo plazo, almacene a –20 oC.
    5. Transfiera 25 l de sobrenadante de esferoides intactos en tres pozos diferentes de una microplaca blanca opaca de 96 pomos, después de la incubación. Añadir 25 l de LDR por pocóyo y homogeneizar.
    6. Incubar la placa blanca a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lea la luminiscencia en un luminómetro. No utilice un fluorómetro.
    7. Calcule las señales netas restando los valores de luminiscencia de fondo (control sin celda) de los valores de prueba tratados y no tratados (control del vehículo). Calcule el cambio porcentual de la actividad del CYP3A4 dividiendo los valores netos tratados por los valores netos no tratados y multiplicándose por 100.
  7. Hinchazón occidental
    1. Transfiera los esferoides hepáticos a un microtubo identificado de 1,5 ml. Retire el medio y lávelo dos veces con 100 l de 1x DPBS.
    2. Lysate los esferoides hepáticos en 100 sl de la lelisis celular tampón RIPA a 4 oC durante 20 min. Centrífuga durante 15 min, 4oC y 11000 rpm. Transfiera el sobrenadante a otro microtubo identificado de 1,5 ml.
    3. Cuantificar la cantidad de proteína obtenida a través del método Bradford. Cargue entre 10 y 50 g de proteína del lesato celular cuantificado por pozo de un gel de poliacrilamida gradiente 3-15% y realice una SDS-PAGE.
    4. Transfiera la proteína cargada del gel a una membrana PVDF de 0,22 m a través del equipo del sistema semisequedo. Utilizar una solución de transferencia de 50 mM Tris-HCl y 192 mM de glicina. Ajuste los parámetros del equipo según el número de geles a transferir (1 a 2 a la vez).
    5. Bloquear interacciones inespecíficas en la membrana PVDF con una solución de leche desnatada del 3-5% en tampón TBS-T: Salina tamponada tris (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM de cloruro de sodio) complementada con 0,1% de Tween 20. Mantenga la membrana bajo agitación suavemente constante durante 1 hora a temperatura ambiente.
    6. Lavar con TBS-T bajo agitación suavemente constante durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado dos veces.
    7. Diluir los anticuerpos primarios de albúmina y vinculina a 1:1000 y 1:2000 respectivamente en TBS-T. Incubar la membrana con anticuerpos primarios durante la noche a 4oC, bajo agitación suavemente constante.
      NOTA: Siga siempre las instrucciones del fabricante para diluir los anticuerpos.
    8. Retire el anticuerpo primario y la membrana lave 3 veces (paso 6.7.6). Diluir el anticuerpo secundario IgG antiratón ECL a 1:5000 en TBS-T. Incubar la membrana con un anticuerpo secundario bajo agitación suavemente constante durante 2 horas a temperatura ambiente.
    9. Retire el anticuerpo secundario y lave la membrana (paso 6.7.6). Realice la detección de proteínas con ECL Western Blotting Substrate. Exponer las películas autoradiográficas durante 30 s a 30 min. Realizar la detección de inmunoblotting en triplicado.

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Representative Results

Para realizar las pruebas PK APAP en el MPS 2-OC, el primer paso es fabricar el intestino humano y equivalentes hepáticos (organoides). Se integran en el dispositivo microfluídico 2-OC (Figura 1A) 24 h antes de iniciar el ensayo PK APAP. Al día siguiente, el medio se cambia, y el modelo se expone a APAP. La Figura 1 ilustra los equivalentes del intestino y del hígado colocados dentro del dispositivo 2-OC (Figura 1B) y el curso de tiempo de experimento APAP PK (Figura 1C). Realizamos un ensayo de MTT, mediciones TEER, HCA, PCR en tiempo real, hinchazón occidental, histología y microscopía de fluorescencia confocal en cultivo 2D y organoides 3D para comprobar la viabilidad del tejido y detectar posibles efectos tóxicos APAP. En las imágenes de microscopía de fluorescencia confocal, las muestras equivalentes intestinales teñidas con DAPI y Phalloidin (para núcleos y actina respectivamente) se presentaron como una barrera contigua para las muestras tratadas no tratadas (Figura 2A) y las 12 muestras tratadas APAP (Figura 2B). Como se ve en la Figura 2C, el ensayo MTT mostró niveles relativos de viabilidad celular superiores al 70%, lo que indica la ausencia de efectos citotóxicos relevantes en respuesta a la exposición APAP a una concentración de 12 oM33,34,35,36,37. El control positivo (100 mM) indujo muerte celular significativa (supervivencia por debajo del 5%). La viabilidad y la diferenciación adecuada del Caco-2/HT-29, así como la integridad de barrera equivalente al intestino, fueron verificadas por la evolución del TEER durante el período de diferenciación (Figura 2D). APAP no causó ninguna alteración en los valores TEER tal y como se muestra en del cuadro 2E. Se analizó la expresión de los transportadores activos de glucosa acoplados al sodio SLC5A1, el transportador de resistencia multifármaco MDR1 y el ATPase de sodio-potasio, para verificar el impacto del tratamiento APAP sobre la formación de barreras celulares y la funcionalidad basal. Como se muestra en la Figura 2F–H, los equivalentes intestinales no tratados y TRATADOs con APAP han mostrado una expresión similar de SLC5A1 y NaKATPase. La administración oral de 12 M APAP inducida marcó un aumento en los niveles de ARNm MDR1 en los equivalentes de intestinos después de 24 h(Figura 2H). También realizamos HCA de cambios fenotípicos de células mediante una mezcla de tinte de fluoróforo para núcleos y contenido de masa mitocondrial. Los controles positivos fueron APAP de 100 mM y 1% de NaOH.

Además, analizamos si 12 M APAP podría inducir la citotoxicidad al coculo 2D Caco-2/HT-29. Las imágenes de células intestinales adquiridas con microscopía de fluorescencia que se muestran en la Figura 2I corroboran los datos de MTT, que han demostrado que 12 M APAP no causaron citotoxicidad significativa en los equivalentes intestinales Caco-2/HT-29.

La evaluación de la viabilidad basal de los esferoides hepáticos y la citotoxicidad en respuesta a 2 M APAP se realizaron mediante ensayos de MTT y análisis morfológicos mediante microscopía de fluorescencia confocal, histología H&E y HCA. Como se muestra en la Figura 3A, el ensayo MTT no pudo identificar ninguna citotoxicidad relevante en respuesta al tratamiento de APA de 2 m en muestras tomadas del ensamblaje del hígado 2-OC en condiciones estáticas y dinámicas. La viabilidad celular disminuyó, pero se mantuvo por encima del 80% para los puntos de tiempo de 12 h y 24 h33,34,35,36,37. Los tratamientos de control positivo (100 mM APAP y 1% NaOH) indujeron daños tisulares significativos (viabilidad por debajo del 10%). Las imágenes confocales microscópicas indican la ausencia de un centro necrótico en los esferoides hepáticos en condiciones de tratamiento basal o APAP, y no hay evidencia de tasas de mortalidad significativas(Figura 3B-C). Sin embargo, cuando analizamos múltiples cambios fenotípicos celulares después de la administración del vehículo o apAP de 2 M en la cocultura 2D de HepaRG/HHSteC a través del ensayo HCA, utilizando 100 mM APAP (C+) como un control positivo, contradictoriamente con los resultados del ensayo MTT, las células hepáticas demostraron respuestas citotóxicas tempranas a 2m de tratamiento APAP(Figura 3D). Después de 24 h, hubo una disminución en el número de células, en la zona nuclear y un aumento en la masa mitocondrial. Además, se utilizó un cóctel de tinte de fluoróforo que contiene Hoechst 33342 y MitoTracker Deep Red para manchar los esferoides hepáticos 3D (Figura 3J). El software fiji se utilizó para evaluar la homogeneidad de la arquitectura esférica 3D entre varios esferoides (Figura 3E–I). El gráfico que se muestra en la Figura 3E muestra la similitud entre el área total de los esferoides hepáticos. La relación de aspecto (Figura 3F) alrededor de 1 significa una ausencia de sesgo durante el proceso de confitería de los esferoides. La evaluación también indicó que la mayoría de los esferoides eran más o menos redondeados(Figura 3G). La evaluación del perímetro morfológico y la distribución celular se realizó por circularidad(Figura 3I)y por cálculo de solidez (Figura 3H), respectivamente. Llegamos a la conclusión de que la metodología para confitear los esferoides hepáticos había generado organoides con un perímetro liso, compatible con el crecimiento esférico, sin sesgos o necrosis durante el proceso.

Como se muestra en la Figura 4A-B,los esferoides hepáticos mostraron un nivel basal relativo de albúmina y expresión de ARNm GST respectivamente, lo que indica una funcionalidad basal adecuada. Sin embargo, el tratamiento APAP de 2 M para 24 horas indujo una disminución en la albúmina y los niveles de expresión de ARNm GST, lo que sugiere deterioro de los esferoides hepáticos funcionalmente en el punto de tiempo de 24 horas del tratamiento con APAP.

La detección de los niveles de expresión de ARNm CYP3A4 y UGT1A1 demuestra la capacidad metabólica de los equivalentes hepáticos. El nivel basal de ARNm CYP3A4 (Figura 4C) fue coherente con los informes anteriores6. El tratamiento APAP indujo una tendencia a una disminución de la expresión de CYP3A4 mRNA y UGT1A1 en respuesta al tratamiento APAP (Figura 4C-D) que vuelve a corroborar la hipótesis de deterioro de los esferoides hepáticos funcionalmente en el punto de tiempo 24 h del tratamiento APAP.

Además, se realizaron experimentos de hinchazón occidental y actividad enzimática in vitro con el fin de analizar la expresión de la proteína de albúmina, así como la actividad del CYP 3A4 en equivalentes hepáticos en condiciones basales y en condiciones de tratamiento APAP. Encontramos que el tratamiento APAP de 2 m realizado en el Hígado 2-OC MPS, indujo una reducción en la expresión de albúmina total equivalente al hígado a 12 h y 24 h en condiciones estáticas(Figura 4E) y dinámicas (Figura 4F). Por otro lado, las muestras de equivalentes hepáticos de condiciones dinámicas demostraron una tendencia a presentar mayores niveles de expresión proteica de albúmina en comparación con las condiciones estáticas (Figura 4G). El ensayo in vitro del CYP 3A4 realizado en equivalentes hepáticos de Liver 2-OC MPS demostró que el tratamiento APAP de 2 m durante 12 h o 24 h era capaz de inducir un deterioro robusto y significativo de la actividad del CYP 3A4 tanto en condiciones estáticas como dinámicas(Figura 4H-I). Más interesante, la presencia de flujo de medios (dinámico) ha inducido una mejora significativa de los equivalentes hepáticos CYP 3A4 niveles de actividad en comparación con las condiciones en las que los equivalentes hepáticos se mantuvieron en ausencia de medio circulante (condiciones estáticas) (Figura 4J).

Para encontrar la condición analítica más sensible con respecto al análisis de HPLC, se investigaron varios parámetros, incluyendo la composición de la fase móvil, el tipo y la concentración de aditivos. Se encontró que el acetonitrilo dio una mejor resolución de cromatograma y tiempo de retención adecuado que el metanol. La separación rápida y reproducible de APAP se obtuvo utilizando una columna de fase inversa C18. El valor del tiempo de retención APAP (Rt) fue 9.27 ± 0.19 minutos. La selectividad para APAP se indica por la forma y la resolución simétrica del pico, así como por la falta de picos que interfieren en los medios de cultivo celular DMEM y Williams.

Las concentraciones estándar APAP en los medios de cultivo celular DMEM S y Williams E S diluidos con tampón de acetato de amonio (1:1, v/v) que oscilaban entre 0,25 y 100,00 oM se utilizaron para construir las curvas de calibración. La linealidad del método se determinó en nueve niveles de concentración. Los datos se muestran en el Cuadro 2 y el Cuadro 3. La relación entre la concentración de APAP y las áreas de pico fue descrita por las ecuaciones de regresión lineal: y - 16106 * x + 3579.8 (R2.1, en el medio DMEM) y y a 16397*x + 2475.1 (R2-1,en el medio Williams), en los que "x" es la concentración nominal APAP en M y "y" es el área de pico de cromatograma de APAP en la UA. En el límite superior de cuantificación (es decir, 100,00 oM), la desviación porcentual y los valores de variabilidad entre carreras fueron inferiores al 2,50%. La precisión y la precisión de nueve niveles de concentración, con exclusión de los 0,50 m (LLOQ), se encontraban dentro de un rango aceptable con valores DEV y C.V. inferiores al 7,00%(Tabla 2 y Tabla 3).

La precisión y precisión entre carreras y el método analítico, a cuatro concentraciones probadas, estaban dentro de los criterios generalmente aceptados para los ensayos bioanalíticos. La reproducibilidad del método se evaluó mediante el análisis de réplicas de muestras de control de calidad APAP de 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 y 90,00 oM. Los resultados medios entre carreras y carreras se notifican en el Cuadro 4. La precisión y la precisión del ensayo se demuestran mediante valores DEV ≤ 15,00% y por valores C.V. ≤ 7,00%, respectivamente.

El LOD se determinó como la muestra cuya relación señal-ruido (S/N) era sólo mayor que 3 y correspondía a un APAP de 0,25 m. Por otro lado, el LLOQ, estimado con muestras APAP de 0,50 m, muestra la relación S/N igual a 10. Además, encontramos valores de precisión (DEV%) en ≤ 19,00% de los valores nominales de concentración. Las variabilidades intra e intercogencia fueron demostradas por C.V. ≤ 18,77%, como se muestra en el Cuadro 2, cuadro 3 y cuadro 4)29,30.

Los análisis de APAP PK se realizaron en tres diferentes conjuntos MPS de 2 OC: 1) Intestina 2-OC, que contienen el equivalente del intestino solamente; 2) Hígado 2-OC, que contiene los esferoides hepáticos solamente y 3) Hígado/Hígado 2-OC con barrera intestinal y esferoides hepáticos.

Para los estudios de absorción, la vía oral fue imitada por la administración de 12 m APAP en el lado apical equivalente al intestino. Las concentraciones de APAP se midieron mediante HPLC/UV, en las muestras medianas, recogidas a partir de lados de equivalentes intestinales apicales y basolaterales, tanto en condiciones estáticas como dinámicas. La cinética APAP en el medio recogido de los lados apical y basolateral demostró que el modelo intestinal era capaz de absorber el APAP. Hubo una disminución progresiva de la concentración de APAP en el lado apical (Figura 5A) concomitantemente al aumento de la concentración de APAP en el lado basolateral intestinal (Figura 5B). Las concentraciones máximas (Cmax) en el medio fueron de alrededor de 2 M para condiciones estáticas y dinámicas, después de 12 h de la administración (Tmax).

Para los estudios del metabolismo, la administración intravenosa se com imitaba mediante la aplicación de 2 M APAP en el medio del compartimiento hepático. La cinética de concentración APAP en los medios en condiciones estáticas y dinámicas indicaba que sólo en las condiciones dinámicas se podían detectar las disminuciones en la concentración de APAP, alcanzando 0,87 m APAP 12 h después de la administración APAP de 2 M (T1/2 a 12 h). Los equivalentes hepáticos mostraron una eficiencia metabólica mínima en condiciones estáticas(Figura 5C). La concentración de APAP alcanzó 1,7 m 12 h después de la administración APAP. La evaluación integrada, sistémica como la absorción APAP y el metabolismo, se realizó en el modelo Intestina/Hígado 2-OC. El APAP se administró sobre el lado apical del equivalente del intestino, emulando la vía oral. Se recogieron muestras medianas de ambos lados intestinales y también del compartimento hepático. El cuadro 5D muestra el decaimiento progresivo de la concentración APAP en el lado apical en condiciones estáticas y dinámicas.

La Figura 5E muestra las fases distinguibles de absorción y metabolismo. El flujo también impactó en la absorción intestinal. La Cmax APAP en el medio cambió de 2 m en el conjunto "Intestine 2-OC" (Figura 5B) a 1,7 m para el dinámico "Intestine/Liver 2-OC"(Figura 5E). La Figura 5F muestra una comparación directa entre el perfil de concentración-tiempo de APAP en nuestro sistema microfisiológico dinámico "Intestine/Liver 2-OC" (curva roja y eje y) y un perfil representativo obtenido en humanos después de una sola dosis oral de 1000 mg (curva negra y eje y).

Figure 1
Figura 1: Compilación de pasos esquemáticos para estudios PK en el MPS de 2 OC. A) Dibujo esquemático del MPS 2-OC, mostrando los equivalentes de tejido humano intestinal y hepático en vista de abajo hacia arriba. B) Fotografía MPS de 2 OC con los equivalentes intestinales e hepáticos integrados en el dispositivo a la vista de abajo hacia arriba, con imágenes representativas de microscopía óptica. C) Cronología de la preparación de equivalentes de tejidos, tratamiento APAP, y fases de recolección de medios de cultivo para la fabricación de organoides, y evaluaciones farmacocinéticas y toxicológicas. Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Viabilidad y evaluación toxicológica de los equivalentes intestinales. A) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia confocal de células Caco-2/HT-29 no tratadas teñidas con núcleos celulares y filamentos de actina de colorante fluorescente (DAPI y Phalloidin respectivamente); Ampliación 63x, zoom 2.6. B) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia confocal de células Caco-2/HT-29 tratadas con 12 M APAP durante 24 h, teñidas con núcleos y filamentos de actina de colorante fluorescente (DAPI y Phalloidin respectivamente); Ampliación 63x, zoom 2.6. C) Evaluación de viabilidad de equivalentes incisos por MTT tanto en condiciones estáticas como dinámicas. Los valores representados por las barras en el gráfico se calculan porcentualmente en relación con el control del vehículo (punto de tiempo denominado como 0)*P<0.05 0 vs tratamiento. D) Evolución del TEER durante los 21 días de diferenciación. *P<0.05 día 1 vs otros días. E) Valores TEER después de la administración APAP en el inciso 2-OC MPS en condiciones dinámicas. Expresión génica en los intestinos equivalentes. El potencial de absorción de la barrera intestinal y los posibles efectos de 12 m APAP durante 24 h en condiciones dinámicas fueron verificados por la expresión SLC5A1 (F), Na-K-ATPase (G) y MDR1 (H). Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. El resultado se expresa como una relación con el servicio de limpieza GAPDH. *P<0.05 vehículo vs APAP. I) HCA basado en imágenes de Operetta realizado por el Columbus® 2.4.0. Software. Imágenes representativas del co-cultivo del intestino 2D en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento APAP de 12 M. Los controles negativos fueron medios (0 h) o vehículos (0,5% etanol). Los controles positivos mostrados aquí son los 100 mM APAP. Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidad y evaluación toxicológica de los equivalentes hepáticos. A) El hígado equivale a la evaluación de la viabilidad por ensayo MTT tanto en condiciones estáticas como dinámicas. Los valores representados por las barras en el gráfico se calculan porcentualmente en relación con el control del vehículo (punto de tiempo denominado como 0) *P<0.05 0 vs tratamiento. B) Imágenes confocales representativas capturadas del vehículo y esferoides hepáticos tratados con 2 M APAP 24 h de una sección interna. C) Representativas H&E (tinción de hematoxilina y eosina) capturadas del vehículo y 2 M APAP 24 h trataron los esferoides hepáticos de una sección interna. Barra de escala a 50 m. D) Imágenes representativas del co-cultivo hepático 2D en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento APAP de 2 M. En estos análisis se consideraron muestras tratadas con vehículo y con APAP de 2 M. La mezcla de tinte de fluoróforo incluye Hoechst para la tinción nuclear y Mitotracker Deep Red para la tinción masiva de mitocondrias. Los controles negativos fueron medios (0 h) o vehículos (0,5% etanol). Los controles positivos fueron APAP de 100 mM. Las mediciones de imágenes enteras de esferoides capturadas se realizaron utilizando el software Fiji. E) Distribucións de frecuencia de la relación de aspecto del área F), G) redondez, H) solidez, I) circularidad. N.o 85. *p < 0,05. J) Imágenes representativas de esferoides hepáticos 3D adquiridos por la Operetta utilizando el objetivo LWD 10x. Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La viabilidad/funcionalidad hepática y los posibles efectos de 2 M APAP en condiciones estáticas y dinámicas sobre el que se verificaron mediante la expresión génica y proteica y por la actividad enzimática. A) expresión génica de albúmina. B) Expresión génica GSTA2. La capacidad hepática para realizar el metabolismo de fase I y fase II y los posibles efectos de 2 m APAP durante 24 h en condiciones dinámicas sobre él fueron verificados por expresión génica de CYP3A4 (C) y por UGT1A1 (D) respectivamente. E) Expresión total de proteína de albúmina en condición estática. F) Expresión total de proteína de albúmina en condiciones dinámicas. Condición. G) Gráfico comparativo que ilustra la diferencia en la expresión total de albúmina en equivalentes hepáticos cultivados y tratados en condiciones estáticas o dinámicas. H) Actividad enzimática in vitro del CYP 3A4 en condiciones estáticas. I) Actividad enzimática in vitro cyp 3A4 en condiciones dinámicas. J) Gráfico comparativo que ilustra la diferencia en la actividad del CYP 3A4 en equivalentes hepáticos cultivados y tratados en condiciones estáticas o dinámicas. Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los datos de la expresión génica se expresan como una relación con el servicio de limpieza GAPDH. Los datos de la expresión proteica se expresan como una proporción a la proteína vinculina. *P<0.05 vehículo vs tratamiento APAP. Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de la farmacocinética APAP en MPS 2-OC. Perfil de absorción APAP después de la administración APAP de 12 m en el lado apical de la preparación del MD de 2 OC del intestino. La barrera intestinal se hizo de una cocultura de líneas celulares Caco-2/HT-29 (A) Concentraciones APAP estáticas y dinámicas en el medio desde el lado apical (que representa el lado del lumen intestinal humano). (B) Concentraciones APAP estáticas y dinámicas en el medio desde el lado basolateral (que representa el lado del torrente sanguíneo intestinal humano). *P<0.05 condiciones estáticas vs dinámicas. C) Perfil del metabolismo APAP en el hígado 2-OC MPS por hepaRG/HHSTeC esferoides hepáticos. Comparación de condiciones estáticas y dinámicas después de una administración APAP de 2 m en el medio. *P<0.05 0h vs 6 h, 12 h, y 24 h tratamiento APAP. Absorción APAP y perfil del metabolismo después de la administración de 12 m en el lado apical de barrera intestinal de la preparación del MD de 2-OC del hígado/inglés. Esto emula la vía oral. La barrera intestinal estaba hecha de líneas celulares Caco-2/HT-29 y el equivalente hepático hecho de esferoides de líneas celulares HepaRG/HHSTeC. (D) Concentraciones de APAP intestinal/hígado 2-OC en el lado apical de la barrera intestinal en condiciones estáticas y dinámicas. (E) Concentraciones de APAP intestinal/hígado 2-OC en el medio en condiciones estáticas y dinámicas. *P<0.05 condiciones estáticas vs dinámicas. (F) Comparación entre el perfil de concentración-tiempo de APAP en nuestro sistema microfisiológico (curva roja e eje y) y un perfil representativo obtenido en humanos después de una sola dosis oral de 1000 mg (curva negra e eje y). Los datos se extrajeron de las gráficas mediante WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sistema HPLC Waters Alliance 2695 (Milford, MA, EE. UU.), equipado con bomba cuaternaria, gestor de muestras y degasser
Detector Aguas 2996 Uv-Vis en un rango de 210-400 nm
Control del sistema, adquisición de datos y procesamiento Software de cromatografía Waters Empower 2002
Columna Luna C18 en fase invertida
(150 x 4,6 mm I.D.; tamaño de partícula de 5 mm)
Phenomenex
Columna de guardia Luna C18 en fase invertida (4 x 3 mm)
Phenomenex
Fase móvil Solvente A- Acetonitrilo
Disolvente B- 0,10 M acetato de amonio, pH 6,8
Condiciones isocráticas Hora A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Flujo 1,0 ml/min
Volumen de inyección 25 l
Temperatura 25 oC
Detección APAP UV 243 y 254 nm
Tiempo de ejecución 15 minutos

Tabla 1: Condiciones y parámetros que se utilizarán para los análisis HPLC-UV de APAP en matrices de medios de cultivo.

Concentración nominal Concentración de APAP calculada (M) Promedio (M) S.D.b C.v. Dev
(M) (Triplicado de cada concentración) (M) (%)c (%)d
Número de ensayo 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46.05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0.03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabla 2: Variación entre carreras: precisión, precisión y linealidad de muestras de curva estándar preparadas en una mezcla de medio DMEM con tampón de acetato de amonio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensayos separados. a
a Se ha ajustado una curva lineal a los datos de una respuesta(APAP)frente a la concentración teórica, tal como se describe en Experimental. La concentración calculada se derivó de la lectura de la respuesta para cada muestra estándar en la curva de calibración. Cada entrada (ensayo 1-6) corresponde al valor medio del análisis triplicado.
b Desviación estándar SD.
c C.V. (coeficiente de variación. precisión).
d Precisión (DEV %) - la desviación de la concentración calculada con respecto al valor nominal.
Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Concentración nominal Concentración de APAP calculada (M) Promedio S.D.b C.v. Dev
(M) (Triplicado de cada concentración) (M) (M) (%)c (%)d
Número de ensayo 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14.97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6.85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0.05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabla 3: Variación entre carreras: precisión, precisión y linealidad de muestras de curva estándar preparadas en una mezcla de medio Williams con tampón de acetato de amonio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensayos separados. a
a Se ha ajustado una curva lineal a los datos de una respuesta(APAP)frente a la concentración teórica, tal como se describe en Experimental. La concentración calculada se derivó de la lectura de la respuesta para cada muestra estándar en una curva de calibración. Cada entrada (ensayo 1-5) corresponde al valor medio del análisis triplicado.
b Desviación estándar SD.
c C.V. (coeficiente de variación. precisión).
d Precisión (DEV %) - la desviación de la concentración calculada con respecto al valor nominal.
Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Medio Williams Concentración nominal Concentración medida S.d. C.v. Dev
(M) (M) (M) (%) (%)
Intra-run (n-3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1.77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8.57
Inter-ejecución (n-15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14.97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2.99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5.88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
Medio DMEM Concentración nominal Concentración medida S.d. C.v. Dev
(M) (M) (M) (%) (%)
Intra-run (n-3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
Inter-ejecución (n-12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7.75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabla 4: Precisión y precisión intra- e entre carreras para APAP en muestras de control de calidad. a
a Los datos se muestran como promedios. SD (desviación estándar). C.V. (coeficiente de variación. precisión) y precisión (desviación porcentual. DEV%).
Esta figura ha sido modificada de Marin et al. Absorción y metabolismo del paracetamol en un sistema microfisiológico del intestino/hígado. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
Tejido Gene Adelante Marcha atrás
Intestino SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgacggt
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgTgATATTTTgg
Hígado Albúmina TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTtTggCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgc AgCAgAgggAAggCTggAAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tabla 5: Imprimaciones qPCR en tiempo real para evaluar la transcripción genética a nivel de ARNm en los cultivos 2-OC para los tejidos intestinales y hepáticos

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Discussion

La evaluación precisa y fiable de las propiedades farmacológicas de los nuevos fármacos de investigación es fundamental para reducir el riesgo en los siguientes pasos de desarrollo. El MPS es una tecnología relativamente nueva, que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Nuestro grupo está avanzando en la evaluación de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas que se necesitan principalmente para la optimización del plomo. Trabajamos con el dispositivo microfluídico 2-OC, que tiene dos cámaras, permitiendo la integración de dos organoides. APAP fue elegido porque tiene un montón de datos humanos de alta calidad, es en su mayoría metabolizado por el hígado, y también muestra propiedades hepatotóxicas. El protocolo de estudio tenía como objetivo emular algunos pasos del ensayo clínico de fase I humana, donde un medicamento se administra por vía oral a voluntarios, y se extraen muestras periódicas de sangre para evaluar la concentración de los fármacos para conocer las propiedades farmacocinéticas y se recogen parámetros bioquímicos y clínicos para evaluar la seguridad y tolerabilidad. Por lo tanto, cuando el MPS evoluciona lo suficiente para proporcionar predicciones confiables, reducirá significativamente el riesgo de falla en el ensayo de fase I. Al añadir los modelos de la enfermedad en el futuro, la misma suposición posiblemente se aplicará a los ensayos clínicos de fases II y III.

Todos los estudios se realizaron en tres modelos: Intestina 2-OC (administración oral APAP), Hígado 2-OC (Administración intravenosa), e Intestina/Hígado 2-OC (administración oral). El primer modelo aisló la absorción, el segundo el metabolismo, y el tercero integrado ambos. Primero producimos los organoides e incorporamos en el dispositivo microfluídico, primero administramos el APAP y recogimos las muestras de medios, y realizamos por última vez un conjunto de pruebas para evaluar la viabilidad y funcionalidad celular y el impacto toxicológico de la exposición APAP. Para los estudios farmacocinéticos, desarrollamos y validamos un método cromatográfico para la cuantificación APAP en el medio. La validación cumplió con la Orientación sobre validación de métodos bioanalíticos en cuanto a especificidad, linealidad, límite de cuantificación (LOQ), el límite de detección (LOD), efecto de matriz, precisión y precisión, como se describe en FDA29,30. La especificidad se estableció con muestras biológicas en blanco, agrupadas e individuales de dos fuentes diferentes. El método se realizó de forma aceptable durante el análisis, y los datos confirmaron la capacidad de una fase móvil isocrática simple para separar y cuantificar APAP.

La viabilidad/funcionalidad de los organoides del intestino y del hígado fue evaluada por diferentes técnicas. Para el equivalente del intestino, la microscopía de fluorescencia confocal (Figura 2A-B), el ensayo MTT (Figura 2C), la evaluación de la expresión génica ( Figura2D-F) o el experimento HCA, no detectó toxicidad 24 h después de la exposición APAP. Del mismo modo, el ensayo MTT no detectó insultos tóxicos inducidos por APAP en equivalentes hepáticos (Figura 3A). Sin embargo, la técnica HCA añadió la posibilidad de detección de eventos tóxicos muy tempranos (24 h después de la exposición APAP) para las células hepáticas, mediante la observación de cambios fenotípicos celulares, con algunas pistas mecanicistas (Figura 3D). Por otro lado, se demostró que la microscopía de fluorescencia confocal (Figura 3B) y la histología (Figura 3C) eran una herramienta complementaria útil en la investigación del estado de viabilidad de los equivalentes del tejido humano. Para las células hepáticas, el uso simultáneo de diferentes técnicas fue muy ventajoso. El ensayo MTT, como se mencionó anteriormente, no pudo detectar la citotoxicidad APAP detectada por el HCA 24 h después de la exposición APAP. Los análisis de expresión génica evaluaron la funcionalidad del intestino(Figura 2D-F)y de los organoides hepáticos (Figura 4A-D) tanto en basal como 24 h después del tratamiento con APAP. En condiciones basales, había niveles normales de marcadores intestinales y específicos del hígado, lo que sugiere una funcionalidad adecuada. Después de 24 horas de exposición a APAP, hubo una regulación descendente de los niveles de albúmina, ARNm GST y una tendencia a reducir la expresión del gen CYP3A4 en tejidos equivalentes hepáticos, lo que indica citotoxicidad temprana APAP. Corroborando estos hallazgos, los experimentos de hinchazón occidental mostraron que la reducción de la expresión génica también fue acompañada por una reducción robusta de la expresión total de la proteína de albúmina total hepática en respuesta al tratamiento APAP (Figura 4E-F), confirmando los insultos tóxicos impuestos al tejido hepático por la exposición a APAP. En consecuencia, los experimentos de actividad enzimática in vitro mostraron una reducción robusta y progresiva de los niveles de actividad del CYP 3A4 inducidos por el tratamiento APAP, en equivalentes hepáticos (Figura 4H-I).

Se realizaron estadísticas morfométricas de organoides en la imagen J (Figura 3E-I). El área revela lo cerca que está el tamaño 2D de todos los organoides analizados, que podrían utilizarse como estandarización en este protocolo para que se pueda producir un resultado imparcial. Los 'descriptores de forma' revelan estadísticas correspondientes precisamente a la morfología de la forma. La relación de aspecto es un índice que utiliza el eje mayor y menor, por lo que los resultados alrededor de 1 no indican ningún sesgo (es decir, crecimiento preferencial) durante la formación de organoides. Los valores de la redondez (4 ×[área]/ (π × [eje principal]2)) son muy sensibles a un crecimiento preferencial, que se revelaría como un eje principal. La solidez ([área]/ ([área convexa])) es esencial para mostrar la morfología bruta, ya que no se ve afectada por irregularidades en los bordes, ya que utiliza el área convexa (-sobre). Las distribuciones centradas alrededor de 1.0 indican crecimiento esférico putativo. Por el contrario, la circularidad (4× π [área]/[perímetro]2) es muy sensible a un perímetro complejo, por lo que las "cavidades" o "bolsillos" afectarían a este índice. Por lo tanto, la circularidad alrededor de 1 también corrobora el crecimiento esférico putative, compatible con la funcionalidad organoide adecuada.

Los resultados analíticos mostraron que el MPS podía emular las propiedades de absorción y metabolismo APAP, tanto aisladas como integradas en una curva comparable a la producida in vivo (Figura 5F) sin la fase de excreción. La absorción APAP fue similar después de la administración oral a los modelos MPS incisos o MPS de hígado/ inglés, tanto en condiciones estáticas como dinámicas(Figura 5A-B, Figura 5D-E). En ambos, hubo una disminución de la concentración APAP en el lado apical de forma concomitante a su aumento en el lado basolateral, sin diferencia significativa para las condiciones estáticas y dinámicas. Por el contrario, el metabolismo hepático APAP difería en estas condiciones. Los medios circulantes en MPS parecían mejorar la capacidad metabólica organoide(Figura 5C y Figura 5E). Hubo un subdesbordamiento significativo APAP no visto sin flujo. Curiosamente, invitro, los experimentos de actividad CYP3A4 corroboran la hipótesis de que la presencia de flujo en el sistema aumenta la funcionalidad de los equivalentes hepáticos humanos. Como se muestra en el gráfico de la Figura 4J,la actividad del CYP 3A4 fue significativamente mayor en equivalentes hepáticos mantenidos bajo flujo tanto en condiciones basales como en tratamiento APAP. Del mismo modo, los equivalentes hepáticos mantenidos bajo flujo (dinámico) mostraron una tendencia a aumentar la expresión proteica de la albúmina en comparación con los mantenidos sin flujo (estático) tanto en condiciones de inicio de línea de fondo como en condiciones tratadas con APAP (Figura 4G).

En comparación con el perfil de tiempo de concentración después de la administración oral de APAP a los seres humanos, nuestro sistema microfisiológico muestra mucho más grande t1/2 (tiempo de vida media) (Figura 5F). Esto sucede, como se mencionó anteriormente, porque mientras que tenemos un sistema de dos órganos con equivalentes de intestino e hígado que pueden absorber y metabolizar el fármaco, no hay equivalente renal para excretar APAP y sus metabolitos del compartimento plasmático38. Además de eso, el sistema microfisiológico muestra Cmax más pequeño (concentración plasmática máxima) y tmax más grande (tiempo para alcanzar la Cmax) que lo que se observa normalmente para los seres humanos (Figura 5F). Esto es una consecuencia de las diferencias en la escala de los experimentos in vitro e in vivo. En general, hay tres diferencias principales entre el perfil de concentración-tiempo obtenido utilizando el sistema microfisiológico y los perfiles obtenidos después de la administración oral de APAP a los seres humanos: mayor t1/2, menor Cmáximo y más grande tmax (Figura 5F). Mientras que el t más grande1/2 se debe a la ausencia de un equivalente renal para excretar APAP y sus metabolitos del equivalente plasmático, Cmáximo más pequeño y tmáximo más grande son consecuencias de la pequeña escala del experimento en comparación con el cuerpo humano. Las mejores estrategias de escalado para la construcción y operación de sistemas microfisiológicos siguen siendo un área activa de investigación y es poco probable que un enfoque único sea óptimo para todos los sistemas39. Además, el modelado matemático o el aprendizaje automático se pueden utilizar para aplicar correcciones o aprender el mapeo de la microescala a escala completa con el fin de extrapolar los datos in vitro obtenidos con los sistemas microfisiológicos al comportamiento in vivo observado en humanos40.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Christie Guguen-Guillouzo, al Dr. Philippe Gripon en la Unidad 522 INSERM y al Dr. Christian Trepo en la Unidad 271 INSERM por el uso del Material Biológico (células Hepa RG) y por ponernos a nuestra disposición con el fin de realizar la investigación académica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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Química Número 166 Sistema Microfisiológico Paracetamol ADMETox Organoides
Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos
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