Summary
Мы описываем метод in vivo для исследования функциональной потери конкретного гена в спутниковых клетках с помощью комбинации кардиотоксина опосредованной травмы скелетной мышцы и инъекции самостоятельной доставки siRNA.
Abstract
Скелетная мышца обладает огромной способностью к регенерации после травмы. Этот процесс в основном обусловлен мышечных стволовых клеток, также называют спутниковых клеток. Спутниковые клетки характеризуются выражением транскрипционного фактора Pax7 и их расположением под базальной ламиной в покоя скелетной мышце. После травмы, спутниковые клетки активируются, проходят самообновление или дифференциацию либо сформировать новые миофибы или слиться с поврежденными. Функциональность спутниковых клеток in vivo может быть исследована с помощью модели травмы скелетной мышцы на основе кардиотоксина. Для изучения функции одного гена во время регенерации скелетной мышцы в основном используются трансгенные модели мыши. Здесь мы представляем альтернативный метод трансгенных мышей, чтобы исследовать функцию гена в клетках спутника во время регенерации, например, в тех случаях, когда трансгенных мышей нет. Мы сочетаем кардиотоксин опосредоченные травмы конкретной скелетной мышцы с инъекцией самостоятельной доставки siRNA в регенерирующую мышцу, которая затем берется спутниковых клеток среди других клеток. Таким образом, мы предоставляем метод анализа функции генов в клетках спутника во время регенерации в физиологических условиях без необходимости трансгенных мышей.
Introduction
Скелетная мышца является крупнейшей тканью организма, представляющей примерно 40% от общей массы тела, что позволяет добровольно еле-движение. Архитектура тканей скелетной мышцы в основном состоит из постмитотических, неизлечимо дифференцированных, многоядерных миофибы, а также различных других клеток периферической нервной системы, сосудистой системы и интерстициальных клеток1. Важно отметить, что скелетные мышцы обладает огромной способностью к регенерации и восстановлению функции при травме или повреждении2. Этот процесс зависит от ткани резидентов стволовых клеток мышц также называемый спутниковых клеток3,4. Спутниковые клетки расположены между миофибра и базальной ламиной и характеризуются выражением транскрипционного фактора Pax75,6,7. В гомеостатических условиях, спутниковые клетки тихие, но активироватьизируются из-за травматической травмы, например, через эксцентричные упражнения или экспериментально через инъекцию змеиного ядакардиотоксина 6,8. После активации, Pax7 положительные спутниковые клетки совместно выразить MyoD и Myf5, который совершает стволовые клетки к миогенной дифференциации. Спутниковые клетки, которые противостоят upregulation факторов приверженности сохранит свой потенциал ствола и вернуться к quiescence пополнить пул стволовых клеток для будущих потребностей. После расширения пула миогенных прародителей транскрипционные сети активируются такими факторами дифференциации, как Миогенин, чтобы инициировать выход клеточного цикла и терминальную дифференциацию. Эти миопрогенитора затем предохранитель друг к другу или существующих миофиферов способствует myonuclei для поддержания размера мионъюклея. Myofibers выразить терминальной дифференциации мышц генов, как Myosin Heavy Chain. Наконец, вновь образованные миофибы растут и созревают, чтобы построить функциональные единицы скелетной мышцы9,10.
Регенерация скелетных мышц может быть затронута различными заболеваниями, включая мышечные заболевания или старение11,12, начиная от легких нарушений для угрожающих жизни условий, например, в мышечной дистрофии Дюшенна13 , 14. Таким образом, регенеративная медицина направлена на восстановление поврежденных или неисправных скелетных мышечной ткани, используя присущие ей регенеративной энергии, ориентируясь на функцию спутниковых клеток15,16. Для полного использования полного потенциала требуется всестороннее понимание спутниковых клеток в их эндогенной нише при регенерации скелетной мышцы. Хотя существуют экспериментальные подходы к изоляции спутниковых ячеек, прилегающих к их миофиберам17,полная сложность клеточных и системных взаимодействий спутниковых клеток с их окружающей средой может быть повторена только в vivo. В этой связи, большие знания о регенерации скелетных мышц была приобретена с помощью мыши травмы модели2,18.
Здесь мы представляем специальную экспериментальную модель травмы мыши для изучения стволовых клеток опосредованной регенерации кардиотоксина индуцированного повреждения передней мышцы tibialis in vivo. Кардиотоксин, змея, производная цитолитический токсин, который вызывает деполяризацию миофрина и некроз, вводится в переднюю мышцу tibialis, что, в свою очередь, вызовет дегенерацию тканей с последующим регенерацией. Для анализа функции генов во время острой регенерации, самостоятельной доставки siRNAs вводят на 3-й день после травмы, на пике расширения спутниковых клеток. Экспериментальные животные приносятся в жертву в различные временные точки и tibialis передние мышцы собираются. Расчлененные мышцы замораживаются и обрабатываются для дальнейшего крио-секционирования. Иммунофлуоресцентная микроскопия затем используется для анализа маркеров регенерации. Этот метод позволяет исследует функцию одного гена во время спутниковой клеточной регенерации скелетных мышц с использованием мышей дикого типа.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Департаментом защиты животных Тёринджер ландесамт Фюр Лебенсмиттельсихерхейт унд Вербаухершуц (03-048/16; TLV; Бад Лангенсалза, Германия).
1. Кардиотоксин индуцированной мышечной травмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все эксперименты с участием живых мышей в соответствии с национальным Законом о защите животных и при соответствующих асептических условиях. Кроме того, жертвоприношения животных должны осуществляться в соответствии с национальным Законом о защите животных.
- Дезинфицировать ингаляционную коробку, используемую для ингаляционной анестезии и область операции с 70% этанола. Поместите стерильную хирургическую ткань на грелку, где будет проходить операция.
- Включите грелку при 37 градусах Цельсия.
- Администрирование анальгетиков (например, 1 мг/кг тела массы мелоксикама subcutaneously) 15 мин до начала операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для типичного эксперимента, используйте мышей, которые по крайней мере 6 недель, секс-соответствует и в хорошем общем физическом состоянии. - Приготовьте раствор кардиотоксина (20 мкм в 0,9% NaCl), храните раствор при -20 градусов по Цельсию.
- Разрешить раствор кардиотоксина для достижения комнатной температуры (RT).
- Перенесите мышь в ингаляционную коробку и вывешйте анестезию с изофлюраном (инициация 3,5 - 5% в чистом кислороде). Проверьте глубину анестезии с отсутствием реакции на щепотку ног.
- Поместите мышь на чистое бумажное полотенце и поддерживать анестезию с маской носа (1,5 - 3% изофруран в чистом кислороде). Бритье области инъекций черепа нижней ноги (от колена до лапы, Рисунок 1A). Удалите все чрезмерные свободные волосы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Физически разделение бритья и инъекций области в комнате обеспечит более стерильные условия для инъекций. - Поместите мышь в боковое лежачее положение на грелку, покрытую стерильной хирургической тканью, и поддерживайте анестезию с носовой маской (1,5 - 3% изофруран в чистом кислороде).
- Дезинфицировать область инъекций нижней ноги черепа (от колена до лапы) с 70% этанола.
- Выполните щепотку ног перед началом внутримышечной инъекции, чтобы обеспечить адекватную глубину анестезии.
- Введите 50 кардиотоксинов (20 мкм в 0,9% NaCl) в переднюю мышцу tibialis с помощью инсулинового шприца с иглой 29-го калибра. Во-первых, проколоть кожу просто дисталь колена.
- Вставьте иглу полностью в мышцу (в ориентации миоволокна / параллельно кости голени) и вводить кардиотоксин медленно (10-20 с) по всей длине мышцы при перемещении иглы вперед и назад, чтобы позволить равномерное распределение кардиотоксина тем самым травмируя всю переднюю мышцу tibialis(рисунок 1B, C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раните переднюю мышцу tibialis только от одной ноги, контралатеральные tibialis передней мышцы могут служить в качестве внутреннего контроля, чтобы определить, что скелетные мышцы не были патологически пострадавших до травмы кардиотоксина. - Перенесите мышь обратно в клетку, помещенную на грелку, и следите за процессом восстановления до тех пор, пока животное не станет в сознании и не станет амбулаторно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей будет только показать небольшое хромать. Если мыши сильно хромают и вообще не прививают вес на ногу, жертвуйте мышью. - Администрирование анальгетиков в течение следующих 2 дней (например, 1 мг/кг тела млок/кг мелоксикама, каждые 24 ч) и контролировать их на еженедельной основе.
2. Инъекция самостоятельной доставки siRNA в регенерирующих Tibialis передней мышцы (на 3 день после травмы кардиотоксина)
- Подготовьте раствор siRNA, приостановив сиРНК (например, смарт-бассейн siRNA) в 0,9% NaCl (окончательная концентрация 2 мкг/Л) в соответствии с инструкцией производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: SiRNA химически модифицируется для облегчения пассивного поглощения клетками и защиты его от деградации нуклеаза. Никакие трансфекционные реагенты не нужны, тем самым уменьшая токсичность. Использование интеллектуального пула из четырех независимых последовательностей siRNA, нацеленных на один и тот же ген, повышает эффективность нокдауна. - Храните siRNA при -20 градусов и перенесите его на лед в операционную.
- Дезинфицировать ингаляционную коробку, используемую для ингаляционной анестезии и область операции с 70% этанола. Поместите стерильную хирургическую ткань на грелку, где будет проходить операция.
- Включите грелку при 37 градусах Цельсия.
- Перенесите мышь в ингаляционную коробку и вывешйте анестезию с изофлюраном (инициация 3,5 - 5% в чистом кислороде). Проверьте глубину анестезии с отсутствием реакции на щепотку ног.
- Поместите мышь в боковое лежачее положение на грелку, покрытую стерильной хирургической тканью, и поддерживайте анестезию с носовой маской (1,5 - 3% изофруран в чистом кислороде).
- Дезинфицировать область инъекций нижней ноги черепа (от колена до лапы).
- Выполните щепотку ног перед началом внутримышечной инъекции, чтобы обеспечить адекватную глубину анестезии.
- Введите до 50 зЛ siRNA раствор (до 100 мкг всего в 0,9% NaCl; направленных против гена цели; использовать скремблированный siRNA в качестве контроля) в поврежденных tibialis передней мышцы с использованием инсулина шприц с 29 G иглы. Во-первых, проколоть кожу просто дисталь колена, а затем вставить иглу в tibialis передней мышцы.
- Вставьте иглу полностью в мышцу (в ориентации миофибра / параллельно с кости голени) и вводить раствор siRNA медленно (10 - 20 с) по всей длине мышцы при перемещении иглы вперед и назад, чтобы позволить равномерное распределение siRNA вдоль целые tibialis передней мышцы.
- Перенесите мышь обратно в клетку, помещенную на грелку, и следите за процессом восстановления до тех пор, пока животное не станет в сознании и не станет амбулаторно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгезия не обязательно после инъекции siRNA.
3. Рассечение передней мышцы Тибиалиса
- Подготовка замораживания раствора (2 части СОЕДИНЕНИЯ OCT и 1 часть 30% сахарозы в деионизированной воде) по крайней мере 12 ч до использования, чтобы избежать пузырьков воздуха.
- Подготовка замораживания формы, обернув алюминиевую фольгу вокруг карандаша и запечатать его с лентой. Важно, чтобы нижняя часть формы обеспечивает ровную, закрытую поверхность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие замораживания формы позволяют быстрее замораживания мышц избежать замораживания артефактов. - Пожертвуйте мышью, например, ингаляцией CO2, в соответствующую точку времени регенерации и распылите всю мышь и инструменты вскрытия с 70% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вывих шейки матки может быть применен, в дополнение, чтобы избежать чрезмерного кровотечения на ноге при изоляции передней мышцы tibialis. - Удалите мех и кожу из поврежденной задней конечности, разрезая кожу на лодыжке с дополнительными тонкими острыми ножницами (режущий край: 13 мм) и потянув вверх кожу к колену с помощью щипков.
- Чтобы разоблачить tibialis передней сухожилия на лодыжке, потяните оставшуюся кожу к ноге или вырезать острыми ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь может быть прикреплена к доске поддержки, чтобы лучше фиксация. - Перед уборкой tibialis передней мышцы, удалить фасции с помощью тонких щипц (Dumont 5 или 7, прямой или изогнутой). Pinch закрытые щипцы через фасцию рядом с кости голени на лодыжке поврежденной ноги(рисунок 2A). Перемещение щипчи к колену тем самым разрывая фасции и подвергая tibialis передней мышцы(рисунок 2B).
- Чтобы изолировать переднюю мышцу tibialis, разоблачить дистального сухожилия и захватить его с тонкой щипц (Dumont 7, изогнутые). Вырежьте сухожилие с помощью пружинных ножниц (режущий край: 5 мм, диаметр наконечника: 0,35 мм) и потяните мышцу (держа ее на сухожилии) к колену.
- Чтобы собрать tibialis передней мышцы, сократить его как можно ближе к колену, как это возможно с помощью острых ножниц.
- Перед замораживанием, вырезать tibialis передней мышцы в середине области живота мышцы с прямыми ножницами на две половинки одинакового размера, чтобы анализ среднего региона живота (Рисунок 2C,D).
- Заполните замораживание формы на полпути с замораживания раствора.
- Вставьте две половинки передней мышцы tibialis в замораживание формы с середины области живота перед нижней части формы(рисунок 2E). Убедитесь, что tibialis передней половинки вставляются в вертикальном положении прислонившись к стене замораживания формы, чтобы избежать опрокидывания мышцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше замораживания решение в плесени, тем дольше замораживание займет, тем самым увеличивая риск крио-артефактов. - Держите замораживание формы с помощью щипки и передать его на полпути в жидкий азот(рисунок 2F). Убедитесь, что ни один жидкий азот не входит в замораживание формы во время процесса замораживания.
- Наблюдайте за процессом замораживания, замораживающая среда меняет цвет с прозрачного на белый и становится твердой. Погружайте замораживание плесени в жидком азоте в течение нескольких секунд и перенесите замораживающую форму в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию или в сухой лед для дальнейшей обработки.
- Храните замороженные мышцы в замораживании формы на -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание формы хорошо подходят в 24-ну хорошо пластин или 1,5 мл реакционных труб, позволяющих маркировки и организованного хранения. - Обработка мышц в замораживании формы для дальнейшего использования всегда на сухом льду.
4. Криосекция регенерирующей передней мышцы Тибиалиса
- Перед началом секции установите температуру камеры криостата до -21 градуса по Цельсию, температуру объекта - до -20 градусов по Цельсию, а толщину резки - до 10, 12 или 14 мкм (в зависимости от будущих применений) (Рисунок 3А).
- Перенесите образец мышцы в форму замораживания в криостат и дайте ему приспособиться к температуре в течение нескольких минут. В течение этого времени, этикетка микроскоп слайды.
- Удалите фольгу вокруг встроенной мышцы с помощью предварительно охлажденных щипц внутри криостата. Избегайте прикосновения образца, как криоминал начинает оттаивать легко.
- Установите образец с серединой области живота передней мышцы tibialis направлены вверх на металлический образец держателя криостата с помощью криоммедиума. Это гарантирует, что место резки мышц (внизу формы) сталкивается с экспериментатором.
- Вставьте держатель образца с установленным образцом в механизм секционирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения правильного раздела образца используйте новое лезвие перед запуском. - Во-первых, обрезать образец блока (30 мкм), чтобы получить ровную плоскость секции и достичь соответствующей области мышцы(рисунок 3B).
- После обрезки вырежьте последовательные участки соответствующей толщины (например, 14 мкм).
- Соберите разделы на слайдах микроскопа стекла, удерживая слайд лицом вниз над секцией. Раздел прикрепляется к слайду(рисунок 3C).
- Храните секции при -80 градусах по Цельсию или -20 градусов до дальнейшего использования или непосредственного использования для иммунофлюоресценции или иммуногистохимии.
5. Иммуностогирование для маркеров регенерации
- Выполните все дальнейшие шаги в увлажненной камере.
- Кратко уравновесите секции при комнатной температуре.
- Исправьте разделы с 1 мл 2% PFA (в PBS, рН 7,4) за слайд в течение 5 минут на RT.
- Удалите 2% PFA раствор, залив его в соответствующий контейнер отходов.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS (pH 7.4) в течение 5 мин на RT.
- Удалите PBS, залив его в контейнер для отходов.
- На слайд добавьте 1 мл раствора пермяки (0,1% Triton X-100, 0,1 м глицин в PBS pH 7.4) в течение 10 мин.
- Удалите раствор пермяки, залив его в контейнер для отходов.
- Добавьте 150 qL блокирующего раствора (M.O.M. 1:40 в PBS pH 7.4) за слайд и накройте крышкой. Инкубировать 1 ч на RT.
- Удалите coverslip и блокирующий раствор, нанесите 100 л первичного раствора антитела «PAX7, DSHB, мышь IgG1, неразбавленный или devMHC, DSHB, неразбавленный, мышь IgG1and laminin (кролик, 1:1,000)» на слайд. Обложка с крышкой. Инкубировать O/N (ночь) при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните контрольостого окрашивания, опустив первичные антитела, инкубировать раздел с блокирующим раствором вместо. - Вымойте 3 раза с 1 мл PBS (pH 7.4) в течение 5 мин на RT.
- Удалите PBS, залив его в контейнер для отходов.
- Добавьте 100 qL вторичного раствора антитела (Alexa Fluor 546 коза анти-мышь IgG1 и Alexa Fluor 488 осла анти-кролик igG в блокирующем растворе, 1: 1000) на слайд и крышку крышкой. Инкубировать 1 ч на RT.
- Инкубируйте горки в темноте, например, используйте алюминиевую фольгу для покрытия или использования черной увлажненной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне все шаги должны выполняться в условиях пониженного освещения, так как некоторые вторичные антитела светочувствительны. - Удалите coverslip и вторичный раствор антитела.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS (pH 7.4) в течение 5 мин на RT.
- Удалите PBS, залив его в контейнер для отходов.
- Выполните DAPI окрашивания, добавив 1 мл раствора на слайд ес до конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 5 минут на RT.
- Удалите раствор окрашивания DAPI, залив его в контейнер для отходов.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS (pH 7.4) в течение 5 мин на RT.
- Полностью удалить PBS используется для стирки.
- Нанесите 2 - 3 капли водной среды крепления и непосредственно покройте слайд новым покрытием.
- Пусть слайды высохнут в течение 1 ч на RT в темноте.
- Храните окрашенные секции при 4 градусах По ит в темноте до дальнейшего анализа с помощью флуоресцентного микроскопа.
6. Гематоксилин и Эозин окрашивания
- Выполните все дальнейшие шаги в увлажненной камере.
- Исправьте разделы с 1 мл 2% PFA (в PBS, рН 7,4) за слайд в течение 5 минут на RT.
- Удалите 2% PFA раствор, залив его в соответствующий контейнер отходов.
- Перенесите слайды в банку Коплина.
- Аккуратно промыть горки водопроводной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте кран слишком высоко, так как это может повредить разделы. - Перенесите слайды в увлажненную камеру. Удалите жидкость.
- Нанесите 1 мл раствора для окрашивания гематоксилина (Gill No 3) на 2 мин.
- Перенесите слайды в банку Коплина.
- Аккуратно промыть горки водопроводной водой до тех пор, пока ядра не посинели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте кран слишком высоко, так как это может повредить ваши разделы. - Перенесите слайды в увлажненную камеру. Удалите жидкость.
- Нанесите 1 мл раствора Eosin Y и инкубировать в течение 2 мин.
- Перенесите слайды в банку Коплина.
- Аккуратно промыть горки с водопроводной водой, пока водопроводная вода сходит слайды ясно.
- Удалите всю жидкость и дайте слайдам высохнуть в течение 2 мин.
- Гора в монтажной среде подходит для иммуногистохимии.
Representative Results
Типичный результат гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание передней мышцы tibialis до и после кардиотоксина опосредованной травмы представлена в Рисунок 4A,B. В мышцах управления, архитектура мышцы нетронутыми, как видно по локализации ядер на периферии миофидеров и отсутствие накопления мононуклеажных клеток в интерстициальном пространстве (Рисунок 4A). Через 7 дней после сердечно-токсина опосредованных травм ы новые миофибы образуются отмечены централизованно расположенных ядер(рисунок 4B). Кроме того, можно наблюдать накопление мононуклиновых клеток, состоящих в основном из спутниковых клеток, а также немиогенных клеток, таких как иммунные клетки. Вся мышца должна быть повреждена, характеризующейся центральным расположением всех мионуклеев и накоплением мононуклиированных клеток по всей мышечной секции.
Для характеристики прогрессии и успеха процесса регенерации, несколько иммунофлуоресцентных окрашивания с использованием маркеров регенерации могут быть выполнены. Количество спутниковых ячеек можно оценить путем окрашивания для Pax7, канонического маркера для спутниковых клеток(Рисунок 4C,D). Через три дня после травмы количество спутниковых ячеек увеличивается(рисунок 4D), спутниковые клетки больше не находятся под базальной ламиной. Для дальнейшего анализа процесса регенерации, вновь образованные миофиберы могут быть окрашены антителами, направленными на развитие миозина(рисунок 4E). Недавно сформированные миофибы отображают расположенные в центре ядра и сильное выражение развития миозина. По мере созревания миофиферов уменьшается выражение развития миозина, диаметр миофибра увеличивается, в то время как ядра мигрируют на периферию миофидеров.
Влияние одного гена на процесс регенерации можно исследовать с помощью трансгенных мышей или, как показано здесь путем инъекции самодоставки siRNA. Флуоресцентно помечены самостоятельной доставки скремал управления siRNA был введен в регенерирующих tibialis передней мышцы на 3 день после травмы, то чная точка, когда распространение спутниковых клеток пиков. Через два дня после инъекции siRNA спутниковые клетки были проанализированы на наличие флуоресцентно помечены siRNA(Рисунок 4F). Мы проанализировали, сколько спутниковых клеток занялфлоуоресцентно помечены siRNA через два дня после инъекции в регенерирующую мышцу (Рисунок 5). Около 75% всех спутниковых клеток в регенерирующей мышце были положительными для флуоресцентно помечены siRNA. Кроме того, мы определили, что около 74% всех регенерирующих миофиберов были положительными для флуоресцентно помеченных siRNA предполагая, что либо 74% регенерирующих миофиберов занялs siRNA или что siRNA-положительные спутниковые клетки либо слились с друг друга, чтобы сформировать новые myofibers или что слияние с уже существующими регенерирующих миофибы произошло(Рисунок 5). Это говорит о том, что спутниковые клетки занимают самодоставку siRNA и что siRNA сохраняется в спутниковых клетках, по крайней мере два дня.
Рисунок 1: Инъекция кардиотоксина в переднюю мышцу тибиалиса. (A) Мыши обезболиваются при вдыхании изофлюран и нижняя конечность бритая. (B) Игла 29 G вводится в переднюю мышцу tibialis (C) и перемещается вдоль кости голени во время инъекции раствора кардиотоксина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Шаги, участвующие в вскрытии и замораживании травмированных передней мышцы tibialis. (A) Мышцы задних конечностей подвергаются (B) и фасции окружающих tibialis передней мышцы разорвал подвергать мышцы. (C) После удаления мышцы, она разрезается в середине области живота на две половинки аналогичного размера с помощью острых прямых ножниц (D). (E) Половинки расчлененной мышцы встроены в форму алюминиевой фольги, наполненную раствором замораживания и замороженные в жидком азоте(F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Оборудование и шаги, участвующие в криоотделении ими передних мышц. (A) Температура камеры криостата установлена до -21 градуса по Цельсию. (B) Передняя мышца tibialis в замораживании раствор асссус на держатель образца. (C) Разделы толщиной 14 мкм прикрепляются к слайдам стеклянного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения регенерирующих мышц мибиолов. H и E окрашивание передних мышц tibialis до (A) и 7 дней после травмы кардиотоксина (B). (C) В невредимой мышце Pax7 положительные (красным цветом) спутниковые клетки расположены под базальной ламиной, отмеченной ламинином (зеленым цветом). Ядра противозапятнаны DAPI (синим цветом). Положительные клетки Pax7 отмечены стрелой. (D) После 10 дней регенерации, myofibers характеризуются централизованно расположенных ядер (синим), Pax7 отображается красным, ламинин в зеленом цвете. Положительные клетки Pax7 отмечены стрелой. (E) Недавно сформированные миофибы выражают развития миозина (красным), ламинин в зеленом цвете, ядра противопоставить DAPI (синим цветом). (F) Флуоресцентно помечены самодоставки siRNA (siRED, изображенный красным цветом) по-прежнему находится в спутниковых клетках (Pax7 положительный, в зеленом, отмеченный стрелой в вставке) 2 дня после инъекции самостоятельной доставки siRNA в регенерации tibialis передней мышцы (инъекция на 3-й день после сердечно-токсинной опосредоднейной травмы). Ламинин показан белым цветом, ядра противопоказаны DAPI (синим цветом). Шкала бар 100 мкм (A и B), 50 мкм (C-E), 25 мкм (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Количественная оценка поглощения флуоресцентно помеченных siRNA. (A) Количественная оценка поглощения siRNA спутниковыми клетками (клетки Pax7) и регенерация миофибир через 2 дня после инъекции в регенерирующую скелетную мышцу. Инъекция была проведена на 3-й день после сердечно-токсинной опосредоднейной травмы. n No 3, бары ошибок показывают SEM. (B) Количественная оценка, лежащая в основе графика, изображенного в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Здесь мы представляем метод исследования функции конкретного гена во время регенерации скелетной мышцы без необходимости трансгенных животных. Это достигается путем сочетания кардиотоксининдуальной мышечной травмы с инъекцией самостоятельной доставки siRNA в регенерирующую скелетную мышцу на 3 день после травмы. Мы подробно описали процедуры мышечной травмы кардиотоксином, инъекцию самодоставки siRNA и обработку собранных мышц для анализа хода регенерации. Мы демонстрируем, что инъекция кардиотоксина змеиного яда в скелетную мышцу эффективно ранит всю мышцу и что самодоставка siRNAs находятся примерно в 75% всех спутниковых клеток среди других типов клеток через два дня после их инъекции в регенерации скелетной мышцы(рисунок 4, Рисунок 5).
Особое внимание следует уделить однородной травме передней мышцы tibialis, поскольку различные степени повреждения влияют на результат регенерации и тем самым также может быть затронуто воздействие siRNA. Кроме того, крайне важно, чтобы вся область регенерации была введена с самодоставкой siRNA. Для анализа процесса регенерации рекомендуется всегда сравнивать аналогичные области регенерирующей скелетной мышцы, поэтому передняя мышца tibialis должна быть разрезана пополам, чтобы всегда сравнивать область среднего живота мышцы. При анализе мышц, весь криосекция должна быть проанализирована, поскольку состав миофипла отличается в передней мышце tibialis и, следовательно, может регенерировать по-разному.
Функция спутниковых клеток может быть исследована с помощью различных экспериментальных процедур, включая их культуру на прилегающих изолированных одиночных миофиберах17, путем трансплантации и путем анализа регенерации скелетной мышцы после индуцированной травмы 18,19. Исследование функции спутниковых клеток с помощью модели индуцированной травмы in vivo, например, инъекции кардиотоксина, обеспечивает возможность анализа функции спутниковых клеток также с точки зрения их взаимодействия с другими типами клеток, такими как макрофаги и исследование влияния системных факторов2. Травма скелетной мышцы может быть достигнуто различными средствами, например, эксцентричные упражнения, замораживание травмы, инъекции BaCl2 или инъекции змеиных ядов, таких как кардиотоксин или notexin18. Хотя эксцентричный упражнения, вероятно, наиболее физиологических метод травмы, травмы одной конкретной мышцы только ограничено20. Замораживание травмы могут быть применены, когда миграция спутниковых клеток к месту травмы является целью исследования или только определенная часть мышцы должны быть повреждены. Экспериментально недостатком замораживания травм является открытая операция, которая должна быть выполнена для нанесения предварительно охлажденных металлических зондов. Инъекция BaCl2 или змеиные яды является наиболее драматическим методом травмы, тем самым бросая вызов функции спутниковых клеток больше всего. Кроме того, инъекция является минимально инвазивной, время операции, в целом, составляет менее пяти минут и не предполагает зашивания и т.д., тем самым минимизируя риск инфекций.
Мышечная травма в основном используется для исследования функциональных последствий потери генных функций, например, потери Pax77,21. Особенно, если пожилые мыши находятся в центре научного вопроса, генерации или использования трансгенных мышей часто не представляется возможным. Инъекция самодоставки siRNAs ориентации конкретного гена является жизнеспособной альтернативой в тех случаях, и был успешно использован22. Короче говоря, tibialis передней мышцы мышей был ранен путем инъекции кардиотоксина и самостоятельной доставки siRNAs, направленных против фибронектина (FN) были введены в день 3 после травмы. Мышцы были проанализированы через 10 дней после травмы и значительное снижение числа спутниковых клеток наблюдалось в siFN по сравнению с скремблированными условиями управления siRNA. Эффективность нокдауна была определена в целом мышцы lysates количественных реального времени ПЦР 2 дней после инъекции siRNA, снижение уровня экспрессии 58% было достигнуто, предполагая, что доставка и нокдаун эффективность достаточна для функциональных анализы22. Альтернативой для тестирования нокдаун эффективности являются либо иммуноблот или иммунофлуоресценции анализы с антителами, направленными против целевого гена. Эффективность и специфичность siRNA, используемой для инъекций in vivo, должна быть определена перед инъекцией на мышах, например, путем тестирования эффективности изолированных спутниковых клеток или первичных миобластов. Использование смарт-бассейна, состоящего из 4 различных siRNA по сравнению с одной siRNA увеличивает эффективность нокдауна, но и увеличивает риск неспецифического таргетинга. Специфика всех последовательностей siRNA, используемых должны быть проверены в культуре клеток, чтобы избежать вне цели эффектов. В качестве контроля следует использовать нецелевую скремнду, так как инъекция siRNA как таковой может повлиять на процесс регенерации из-за инъекции и, таким образом, дополнительное повреждение мышцы. Время введения siRNA зависит от научного вопроса и от экспрессии профиля гена-мишени. Как правило, инъекция самостоятельной доставки siRNA на 3 день после травмы кардиотоксина цели большинства генов, важных для пролиферации спутниковых клеток, так как спутниковая пролиферация клеток пики вокруг дня 3 после травмы. Время первой инъекции siRNA не должно быть меньше 48 ч после травмы кардиотоксина, так как объем инъекций кардиотоксина довольно высок и реабсорбции жидкости должны были иметь место до введения дополнительных растворов в мышцу. В целом, несколько инъекций siRNAs или сочетание различных siRNAs возможно, хотя следует учитывать, что каждая инъекция в регенерирующую мышцу вызывает дополнительный ущерб.
Одним из ограничений описанного метода является тот факт, что наблюдаемый эффект не обязательно зависит только от нокдауна гена-мишени в спутниковых клетках, но может быть отнесен к другим типам клеток, таким как иммунные клетки или фибро-адипогенные клетки-прародители. Поэтому необходимо совместить эти эксперименты с экспериментами, исследующими чистую популяцию спутниковых клеток. Можно либо выполнить эксперименты с использованием плавающих культур миофибра, где спутниковые клетки культивируются на прилегающих миофиперов или выполнять эксперименты трансплантации с использованием изолированных спутниковых клеток17.
Альтернативой инъекции самодоставки siRNAs является инъекция малых ингибиторов молекулы или рекомбинантных белков, которые могут быть выполнены, в зависимости от научного вопроса. Например, инъекция внеклеточного матричного белка фибронектин или малых молекулингингингизаторов jak/STAT сигнализации была успешно выполнена у пожилых мышей15,16. Анализ конкретной генной функции в одном конкретном типе клеток во время регенерации скелетных мышц, например, в спутниковых клетках, возможен только с помощью индуцируемой модели генетической мыши. Инъекции самодоставки siRNAs, рекомбинантных белков или малых ингибиторы молекулы могут повлиять на несколько типов клеток в регенерации скелетных мышц.
Disclosures
Мы хотели бы поблагодарить Кристину Пикер и Кристин Позер за отличную техническую помощь и Саскию Штайнер за помощь в определении эффективности трансфекции siRNA. Мы благодарим гистологию основной службы за большую техническую поддержку, особенно Сабина Ландманн и Линда Ротенбургер. Мы также благодарим мышь животного объекта в FLI за отличную поддержку. Эта работа была поддержана грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) и Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) до J.v.M.
Acknowledgments
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
