الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

Adam  H. Barczewski; Michael  J. Ragusa; Dale  F. Mierke; Maria Pellegrini

doi:10.3791/60339

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60339

⸱

ديسمبر 28, 2019

Adam H. Barczewski¹ , Michael J. Ragusa¹ , Dale F. Mierke¹ , Maria Pellegrini¹

¹Department of Chemistry, Dartmouth College

في هذه المقالة

ملخص

ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.

الملخص

نيمو هو بروتين السقالات الذي يلعب دورا أساسيا في المسار NF-κB عن طريق تجميع IKK-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. عند التنشيط ، فان مجمع IKK فوسفولات الجزيئات IκB مما يؤدي إلى النقل النووي NF-κB وتفعيل الجينات المستهدفة. تثبيط التفاعل نيمو/IKK هو نموذج علاجي جذاب لتشكيل النشاط المسار NF-κB ، مما يجعل نيمو هدفا لتصميم مثبطات واكتشاف. لتسهيل عمليه الاكتشاف والاستفادة المثلي من مثبطات نيمو ، قمنا بهندسة بناء محسن للمجال الملزم IKK من نيمو الذي من شانه ان يسمح لتحديد هيكل البروتين في شكل apo وبينما يرتبط بمثبطات الوزن الجزيئي الصغيرة. هنا ، نقدم الاستراتيجية المستخدمة للتصميم والتعبير والتوصيف الهيكلي للمجال الملزم IKK من نيمو. يتم التعبير عن البروتين في الخلايا القولونية ، solubilized تحت ظروف الدفن وتنقيتها من خلال ثلاث خطوات الكروماتوغرافي. نناقش البروتوكولات الخاصة بالحصول علي بلورات لتحديد الهيكل ووصف استراتيجيات الحصول علي البيانات وتحليلها. وسوف تجد البروتوكولات تطبيق واسعه لهيكل تحديد المجمعات من نيمو ومثبطات جزيء صغير.

المقدمة

يتم تنشيط مسار NF-κB استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات ، بما في ذلك السايتوكينات والمنتجات الميكروبية والإجهاد ، لتنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة المسؤولة عن الاستجابة التهابيه والمناعية ، وموت الخلايا أو البقاء علي قيد الحياة والانتشار¹. الامراض بما في ذلك التهابات والمناعة الذاتية والسرطان²^,³^,⁴^,⁵ وقد ارتبطت إلى فرط تنشيط المسار, الذي جعل التحوير NF-κb النشاط هدفا رئيسيا لتطوير العلاجات الجديدة⁶^,⁷.

ويتميز المسار NF-κB الكنسي عل....