Summary
인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.
Abstract
성인 줄기 세포 연구에 있는 어드밴스에도 불구하고, 조직 견본에서 줄기 세포의 확인 그리고 격리는 중요한 도전남아 있습니다. 상주 줄기 세포는 성인 조직에 틈새 구속으로 상대적으로 정지하는 동안, 그들은 앵커없는 3 차원 (3D) 배양에서 세포 주기를 입력하고 대칭 및 비대칭 세포 분열을 모두 겪으며 줄기와 전구 모두를 초래합니다. 셀. 후자는 급속하게 증식하고 이질적인 스페로이드를 형성하는 계보 헌신의 각종 단계에서 중요한 세포 인구입니다. 일차 정상 인간 전립선 상피 세포(HPrEC)를 사용하여, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석법으로 단일 세포 분해능에서 스페로이드 를 발동하는 줄기 세포의 식별 및 기능적 분리를 허용하는 것으로 개발되었다.
HPrEC 또는 세포주들은 2차원(2D) BrdU와 함께 10일 동안 배양되어 자가 갱신 줄기 세포를 포함한 모든 분할 세포의 DNA에 혼입하는 것을 허용한다. 5 일 동안 3D 배양으로 옮겨지면 씻어 내고, 그 동안 줄기 세포는 비대칭 분열을 통해 스스로 갱신하고 스페로이드 형성을 시작합니다. 상대적으로 정지딸 줄기세포가 BrdU 표지된 부모 DNA를 유지하는 동안, 딸 선조는 BrdU 라벨을 잃고 급속하게 증식합니다. BrdU는 FACS에 의한 살아있는 줄기 세포 격리를 허용하는 CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 대체될 수 있습니다. 줄기 세포 특성은 생체 외 스페로이드 형성, 생체 내 조직 재생 분석 및 대칭 / 비대칭 세포 분열을 문서화하여 확인됩니다. 단리된 라벨-유지 줄기 세포는 RNA-seq, ChIP-seq, 단세포 포획, 대사 활성, 프로테오메 프로파일링, 면역 세포 화학, 오르가노이드 형성 및 생체 내 조직 재생을 포함한 다운스트림 분자 및 생물학적 연구에 의해 엄격하게 심문될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 마커 자유로운 기능적인 줄기 세포 격리 접근은 다중 기관에서 신선한 암 견본 및 암 세포줄에서 줄기 같이 세포를, 넓은 적용성을 건의합니다. 암 줄기 와 같은 세포 바이오마커를 식별하고, 암 줄기와 같은 세포를 표적으로 하는 의약품을 선별하고, 암에서 새로운 치료 표적을 발견하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간 전립선은 분비 기능과 특이한 신경 내분비 세포 성분과 함께 기본 기저 세포를 가진 발광 상피를 포함합니다. 상피 세포는, 이 경우에, 생체 내에서 상대적으로 정지하고 일생 내내 선 항상성을 유지하기 위하여 복구 시스템으로 작용하는 전립선 줄기 세포의 희소한 인구에서 생성됩니다1. 많은 발전에도 불구하고, 전립선 줄기 세포의 식별 및 기능적 격리는 분야에서 중요한 과제로 남아 있습니다. 세포 표면 마커 기반 방법론을 포함하는 줄기 세포 바이오마커는 유세포 분석과 결합되어 줄기세포 연구2,3,4에일반적으로 사용된다. 그러나, 농축 및 격리에 대한 결과는 마커 조합 및 항체 특이성의 함수로서 광범위하게변화하며,6,단리된 세포의 정체성에 대한 의문을 제기한다. 줄기형 세포 농축을 위한 또 다른 널리 사용되는 접근법은 3차원(3D) 스페로이드배양2,3,4이다. 상주 줄기세포는 틈새 구속을 가진 생체 내에서 상대적으로 정지되어 있는 반면, 이들은 3D 매트릭스 배양(대칭 및 비대칭 둘 다)에서 세포 분열을 겪고, 줄기 세포와 전구 세포를 모두 생성하여 계보약정7,8을향해 빠르게 재생한다. 형성된 스페로이드는 초기 및 후기 전구 세포를 포함하여 계보 헌신의 각종 단계에서 줄기 세포 및 전구 세포를 모두 포함하는 이기종 혼합물입니다. 따라서, 전체 스페로이드를 이용한 세포는 줄기 세포 배타적이지 않으며, 독특한 줄기 세포 특성의 식별이 결정적이지 않다. 따라서, 그들의 딸 전구에서 전립선 줄기 세포를 확인하고 분리하기 위하여 분석사를 만드는 것이 중요합니다. 이를 위해, 현재 프로토콜의 목표는 인간 전립선 조직으로부터 줄기 세포를 효율적으로 식별하고 분리할 수 있는 분석 시스템을 수립하고 생물학적 기능에 대한 강력한 하류 분석을 하는 것입니다.
장기 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 라벨-보유는 그들의 장기간 두 배의 시간9,10에기초하여 줄기 세포의 생체 내 및 시험관 내 계보 추적에 널리 사용된다. 본원에 기재된 전립선 줄기 세포 식별 및 격리에 대한 현재의 접근법은 혼합 상피 집단 내에서 그들의 상대적 정지 특성 및 라벨 보유 특성에 기초한다. 더욱이, 불멸의 가닥 DNA 가설에 기초하여, 오직 줄기 세포만이 비대칭 세포 분열을 겪을 수 있다. 줄기 세포는 더 오래된 부모 DNA를 포함하는 딸 세포를 나타내고, 전구 세포는, 투입된 딸 세포인, 새로 합성된 DNA를 수신합니다. 위에서 설명한 독특한 줄기 세포 특성은 1 차 적인 배양에서 부모 줄기 세포에서 BrdU 라벨을 수행하고 3D 앵커가없는 스페로이드 배양으로 옮길 때 BrdU 세척 다음 라벨을 추적하기 위해 악용됩니다. 1차 전립선 상피 세포의 대다수가 2D 배양에서 기저 및 이동 증폭 표현형을 유지하는 반면, 3D시스템으로전달시 해당 배양 배지를 가진 구형 또는 완전히 분화된 오르가노이드의 형성에 의해 입증된 바와 같이 상피 항상성을 보충하고 유지하는 다능성 줄기 세포의 드문 집단이 있다3,12. 현재 프로토콜에서, HPrEC 전립선 스페로이드 또는 프로스타스피어 계 BrdU, CFSE, 또는 원적 보유 분석법에 이어 형광 활성 세포 선별(FACS)을 사용하여, 단일 세포 수준13에서스페로이드에서 라벨 유지 줄기 세포를 식별합니다.
중요한 것은, 우리는 계보 투입을 가진 전구 세포에 비교된 초기 단계 스페로이드 내의 표지 보유 세포의 줄기 세포 특성을 추가로 확인했습니다. 이들은 줄기 세포 비대칭 분열, 시험관 내 스페로이드 형성 능력 및 생체 외 조직 재생 능력, 높은 autophagy 활동, 증강 리보솜 생물 발생 및 감소된 신진 대사 활동을 포함합니다. 이어서, RNAseq 분석을 수행하였습니다. 표지 유지 스페로이드 세포에서 분과적으로 발현된 유전자는 인간 전립선 줄기 세포에 대한 신규한 바이오마커로서 작용할 수 있음을 관찰하였다. 이러한 스페로이드 계 라벨-고정 접근법은 암 표본에 적용하여 소수의 암 줄기 유사 세포를 유사하게 식별할 수 있으며, 따라서 치료 내성집단(13)을관리할 수 있는 번역 기회를 제공한다. 아래에 제시된 것은 인간 1차 전립선 상피 세포(HPrEC)를 예로 사용하는 전립선계 라벨 보유 분석이다.
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Protocol
모든 세포 처리 및 매질 제제는 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 무균 기술로 수행되어야한다.
1. 2D에서 HPrEC 세포의 배양 및 유지 보수
- 2.5 μg/cm2 fibronectin 용액2 mL로 100mm 배양 접시를 실온 (RT)에서 밤새 코팅하십시오. 용액을 흡인하고 배양접시를 BSC에서 45분 동안 건조시키게 하였다.
- 전립선 상피 세포 성장 배지(예를 들어, PrEGM)의 9 mL를 섬유넥틴 코팅 된 100mm 배양 접시에 넣고 37 °C에서CO2 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게 유지하십시오.
- 37°C 수조에서 냉동 HPrEC 세포(2 x 10 5/mL)의 한 바이알을 해동하고 따뜻한 배지의 10 mL에서 세포를 다시 중단시냅니다.
- RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상급을 폐기하십시오.
- 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포를 철저히 재중단시다. 종자 세포는 프리웜 배지의 9 mL을 함유하는 섬유넥틴 코팅 100 mm 배양 접시에 직접 세포 현탁액의 1 mL을 파이펫팅하여 (배지 및 세포의 총 부피는 10 mL이다). 배양 접시를 37°C에서CO2 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 2일마다 배지를 보충하십시오. 이렇게하려면 모든 미디어를 조심스럽게 흡인하고 신선한 따뜻한 매체 10mL를 추가하십시오.
- 약 5 일 동안, 배양액이 ~ 70-80 % 동급있는지 확인하십시오. 3mL의 0.05% 트립신/EDTA로 세포를 배양하여 효소 소화를 5분 동안 37°C에서 수행한다.
- 10% FBS를 함유한 따뜻한 PBS 3 mL을 추가하여 소화를 중단하십시오.
- RT. 흡인에서 5분 동안 500 x g에서 50 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기에 세포를 모으고 상급체를 폐기한다.
- 따뜻한 배지의 30 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 다음 통로를 위해 3 개의 새로운 fibronectin 코팅 100mm 배양 접시에 동등하게 분배하십시오.
참고: 1 차적인 HPrEC 세포는 그들의 기저 상피 세포 특성을 바꾸지 않고 ~ 3-5x 를 통과할 수 있습니다. 상피 표현형은 면역 세포 화학 /면역 형광 (ICC / IF) 분석과 기저 상피 세포 마커 시토 케라틴 5 및 p63의 발현에 의해 테스트됩니다.
2. BrdU, CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 HPrEC 라벨링
참고: 세포는 단계 3.1에 기재된 바와 같이 2.1 단계 또는 2.2 단계로 진행한 다음 3D 프로스타스컬 배양으로 이송할 수 있다.
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BrdU를 가진 세포의 단 하나 레이블
- 배양 2 x 105 HPrEC 세포를 fibronectin 코팅 된 100 mm 배양 접시와 함께 10 mL의 따뜻한 배지를 1 μM을 함유하는 BrdU. 전립선 줄기 및 전구 세포를 포함한 모든 세포의 라벨링을 보장하기 위해 10 일 동안 세포를 배양하십시오 (2 대이상).
- 10일 후, BrdU를 함유하는 PrEGM 배지를 조심스럽게 흡인하고 5 mL의 따뜻한 PBS로 세포를 세척한다. 1x를 반복합니다.
- 단계 1.7-1.8에 설명된 대로 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 효소 소화를 수행합니다. RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g의 세포를 원심 분리하고 상급을 버립니다.
- BrdU 표지된 펠릿 세포(5 x 104)를500 μL의 얼음 냉장(1:1) 지하 막 매트릭스/배지로 재중단하고 3D 전체 배양물(단계 3.1에 기재)으로 5일 동안 스페로이드 형성(~6세포 주기) 동안 BrdU 세척을 허용합니다.
-
BrdU 및 CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 세포의 이중 라벨링
- 살아있는 세포에 대한 공동 라벨링이 바람직한 경우, 2.1단계에서 10일 동안 BrdU로 배양된 미리 표지된 세포를 취하고 5 μM CFSE 또는 파레드 라이브 세포 형광 프로 염료를 30분 동안 공동 라벨링합니다.
- BrdU 및 CFSE 또는 파 레드 프로 염료를 포함하는 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 따뜻한 PBS 5 mL로 세포를 씻으하십시오. 세탁을 1x 반복합니다.
- 단계 1.7-1.8에 설명 된 대로 0.05% 트립신/EDTA를 사용 하 여 효소 소화를 수행 합니다. RT에서 5 분 동안 500 x g의 세포를 원심 분리합니다.
- 500 μL의 얼음-차가운(1:1) 지하 막 매트릭스/배지에서 공동 표지된 세포(5 x 104)를다시 중단하고 3D prostasphere 배양(섹션 3.1에 기재)으로 5일 동안 BrdU 및 CFSE 또는 파 레드 워시아웃을 스페로이드 형성(~6 세포 주기)동안 허용합니다.
- 단계 4.1, 4.2, 4.3 또는 5에 설명된 대로 구체(5일째)에서 라벨 유지 셀의 검출을 수행합니다.
참고: 카르복시플루아세진 디아세테이트 는 수니미딜 에스테르(CFSE)와 파 레드(Far Red)는 오래 지속되는 형광 프로 염료이며 표지된 세포 내에 잘 유지됩니다. 살아있는 세포에 있는 세포내 에스테아제는 지금 막 impermeant인 녹색 또는 적색 형광 분자를 활성화하는 아세테이트 단을 파쇄합니다.
3. 3D 지하 막 배양 시스템의 프로스타스피어 형성
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3D 지하 멤브레인 매트릭스 시스템의 프로스타스피어 배양
- 지하 멤브레인 매트릭스를 밤새 4°C에서 해동하고 사용하기 전에 얼음을 유지합니다.
- 1 mL의 얼음 차가운 지하 멤브레인 매트릭스를 얼음 차가운 배양 배지와 동일한 부피에 부드럽게 추가합니다. 거품을 피하면서 위아래로 파이펫팅하여 천천히 섞습니다.
참고 : 이 용액의 100 μL로 12 웰 배양 플레이트 웰의 바닥을 미리 코팅하십시오. 이렇게 하면 행렬을 통과하여 단층으로 성장하는 셀 수가 최소화됩니다. - 5 x 104 HPrEC 세포를 얼음 -cold (1:1) 지하 막 매트릭스 / 배양 배지 혼합물에서 총 부피 500 μL로 다시 중단하십시오.
- 각 웰의 하단 테두리 주위에이 셀 용액의 피펫 500 μL.
- 플레이트를 소용돌이로 하여 혼합물을 우물 테두리 주위에 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C에서 37°C에 놓고 30분 동안 매트릭스가 굳어지도록 합니다.
- 매트릭스가 굳어지면 웰당 1 mL의 따뜻한 배양 배지로 덮습니다. 지하 멤브레인 매트릭스 링을 방해하지 마십시오. 조심스럽게 파이펫 팁을 조준하고 우물의 중앙에 배양 매체를 분배.
참고: 배양 배지는 고화지하 막 매트릭스에 첨가할 때 37°C로 예열되어야 한다. 지하 멤브레인 매트릭스는 무결성을 잃고 냉/서늘한 매체에 노출되면 용해됩니다. - 2일마다 배지를 보충하십시오. 조심스럽게 흡인 ~ 500 μL의 소비 매체와 신선한 따뜻한 배양 매체의 500 μL을 추가합니다.
- 반전된 현미경을 사용하여 5-7일 동안 장구 형성 및 성장을 모니터링합니다.
-
프로스타스피어의 통과
- 가능한 한 많은 매체를 조심스럽게 흡입하여 매트릭스에서 prostaspheres를 수확하십시오. 응고 된 매트릭스의 부동 조각을 방해하거나 집어 들지 마십시오.
- 디스파스 용액 1 mL을 추가합니다 (지하 멤브레인 매트릭스 : 1 : 2 비율로 디스파스). 위아래로 여러 번 파이펫팅하여 철저히 섞으세요.
- 37°C에서CO2 인큐베이터에서 배양판을 30분 동안 배양한다.
- 구 수 계수 및 크기 측정을 위해 배양 접시의 맨 아래에 있는 prostaspheres의 이미지를 가져가십시오.
- 구체 혼합물을 15 mL 튜브로 수집합니다. RT에서 5분 동안 500 x g의 서스펜션을 원심분리하여 구체를 펠렛합니다. 상급자 인해 및 폐기.
- 500 μL의 따뜻한 0.05% 트립신/EDTA로 소화하고 현탁액을 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 이송하여 구체를 단일 세포로 분산시.
- 37°C에서CO2 인큐베이터에서 미세원심지 튜브를 5분 동안 배양한다.
- 10% FBS를 함유한 따뜻한 PBS 500 μL로 트립신 작용을 중단하십시오. 26 G 바늘 5x로 1 mL 주사기를 통해 소화 된 구체 현탁액을 통과하여 구체를 단일 세포로 해리합니다.
- 500 x g에서 5 분 동안 현탁액을 RT에서 세포를 펠렛하여 상수부흡입및 폐기한다.
- 40 μm 크기의 나일론 세포 스트레이너를 통해 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재중단하고 여과한다.
- 500 x g에서 세포 현탁액을 5 분 동안 원심 분리하여 RT. Aspirate에서 세포를 펠렛하고 상급자를 폐기합니다.
- 세포 펠릿을 1 mL의 얼음-차가운(1:1) 지하 막 매트릭스/배양 배지 및 3D 지하 막 매트릭스에서 서브배양하여 세포체의 두 번째 통로를 재중단시켰다.
4. 면역형광 염색에 의한 BrdU 보유 전립선 줄기 세포 의 식별
- 전립선 줄기 세포 2D 화상 진찰을 위한 면역형광 (IF) 염색에 선행된 부착된 전립선을 능가합니다.
- 단계 3.2.1-3.2.3에 기재된 바와 같이 소화를 분리하여 피스타스피어를 수확한다. 500 x g에서 5.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에서 구체를 5 분 동안 폐기하십시오.
- 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 구를 다시 일시 중단합니다.
- 배양 ~50 prostaspheres 잘 8 웰 챔버 슬라이드에서 200 °C 배양 배지에서 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 구체의 부착 및 성장을 허용.
- 2일째에는 배양배지를 흡인하고 폐기한다. 200 μL의 PBS로 자란 구체를 5 분 동안 씻습니다.
- -20°C에서 200 μL/웰의 얼음-차가운 메탄올을 20분 동안 고정합니다.
- 200 μL/well 의 PBS로 구를 5분 동안 세척합니다.
- RT에서 30 분 동안 2N HCl의 200 μL / well을 가진 산 성 세척 구체.
- 200 μL/well 의 PBS로 구를 5분 동안 세척합니다.
- PBST(0.25% 트리톤 X-100의 PBS)에 5% 정상 염소 혈청을 함유한 차단 용액 100 μL을 넣고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 차단 용액을 흡인하고 2% 정상 염소 혈청 및 1차 마우스 항인간 BrdU 항체(1:200)를 함유하는 PBST의 100 μL을 각각웰에 넣고 밤새 4°C에서 가습상자에 인큐베이션한다.
참고: 마우스 IgG 항체는 음성 대조군으로 사용된다. - 1차 항체 용액을 흡인하고 제거한다. 200 μL의 PBS로 구를 5 분 동안 씻습니다.
- 2% 정상 염소 혈청 및 이차 염소 항-알렉사 플루어 488 항체(1: 500)를 함유하는 PBST의 100 μL을 각각 웰에 넣고 2시간 동안 RT에서 배양한다.
- 이차 항체 용액을 흡인하고 제거한다. 200 μL의 PBS로 구를 5 분 동안 씻습니다.
- DAPI를 포함하는 수성 마운팅 매체의 ~ 25-40 μL로 슬라이드를 장착합니다.
- 형광 현미경과 컬러 디지털 카메라로 스테인드 구 / 세포의 이미지를 가져옵니다.
- 전립선 줄기 세포 3D 이미징을 위한 전립선의 전체 마운트 IF 염색
참고: 전체 마운트 IF 염색의 경우, 프로스타스피어는 1.5mL 미세원원지 튜브를 사용하여 처리됩니다.- 단계 3.2.1-3.2.3에 설명된 대로 소화를 분리하여 프로스타스피어를 수확합니다. 500 x g에서 500 x g의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에서 구체를 원심분리하여 5분 동안 흡인하고 폐기한다.
- RT에서 4% 파라포름알데히드의 1mL로 구를 20분 동안 재중단하고 고정합니다.
- PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 구를 세척합니다. 5분 동안 500 x g의 구체를 원심분리합니다. 1x를 반복합니다.
- 산은 펠릿을 30분 동안 2N HCl의 1 mL로 재혼하여 구체를 세척한다.
- PBS 1mL로 구를 5분 동안, 원심분리기를 500 x g에서 5분 동안 세척합니다. 3회 반복합니다.
- PBST에서 5% 정상 염소 혈청을 함유하는 차단 용액의 100 μL에서 ~15-30 구체를 다시 중단하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 차단 용액을 제거하려면 500 x g의 구체를 5 분 동안 원심 분리하고 상한을 폐기하십시오.
- 2% 정상 염소 혈청 및 1차 마우스 항-인간 BrdU 항체(1:200)를 함유하는 PBST의 100 μL에서 구체를 재중단하고 밤새 4°C에서 배양한다.
- PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 구를 세척합니다. 5분 동안 500 x g의 구체를 원심분리합니다. 1x를 반복합니다.
- 2% 정상 염소 혈청 및 이차 염소 항-알렉사 플루어 488 항체(1:1,000)를 함유하는 PBST의 100 μL에서 구체를 재중단하고 2시간 동안 RT에서 배양한다.
- PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 구를 세척합니다. 5분 동안 500 x g의 구체를 원심분리합니다. 1x를 반복합니다.
- DAPI를 포함하는 수성 마운팅 매체의 30-50 μL에서 구를 다시 일시 중단합니다. 구가 평평해지는 것을 방지하려면 커버 유리 바닥이있는 35mm 코팅되지 않은 배양 접시에서 만든 우물로 분배하십시오. 그런 다음 배양 접시에 커버 슬립을 추가하여 우물을 덮습니다.
- 투과된 광역 형광 공초점 현미경을 사용하여 전체 구형 Z-스택 이미지를 수집합니다. 자유형 그리기 기능을 갖춘 이미징 소프트웨어를 사용하여 이러한 Z 스택 이미지를 3D 이미지로 변환합니다.
참고: 마우스 IgG 항체는 음성 대조군으로 사용된다.
- 쌍세포 분석(4일 프로토콜)
- BrdU 레이블이 붙은 구를 5일째까지 배양합니다.
- 일 1: 디스파스 소화의 1 mL와 지하 막 매트릭스에서 구를 수확. 단계 3.2.1-3.2.11에 기재된 바와 같이 1.5 mL 미세원심지 튜브에서 500 μL의 따뜻한 0.05% 트립신/EDTA에 의해 단일 세포내로 분산시켰다.
- 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다.
- 분산된 단일 세포(웰당 ~300-500)를 8개의 웰 챔버 슬라이드및 배양액에서 200 μL/웰 배양 배지에서 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 플레이트한다.
- 2일차: 배양 배지에서 2μM 의 2 μL의 시토샬라신 D로 배양 배지를 변경하고 37°C에서 밤새 배양하여 후기 메타페이즈에서 정지하는 하나의 세포 분열을 anaphase로 허용한다.
- 3-4일: 배지를 흡인하고 폐기하십시오. 200 μL/얼음-차가운 메탄올의 우물에서 20 분 동안 - 20 분 동안. 단계 4.1.5-4.1.14에 설명 된 대로 BrdU에 대한 면역 염색 프로토콜을 따르십시오.
- 형광 현미경으로 쌍을 이룬 세포의 이미지를 가져 가라. 두 핵 사이의 거리가 30 μm 미만인지 확인합니다. BrdU 보유에 기초하여, 쌍이 짝을 이루는 줄기 세포를 대칭 또는 비대칭 세포 분열을 겪고 있는 것으로 식별한다.
참고 : BrdU 라벨 유지 전립선 줄기 세포는 BrdU의 동등한 양을 유지하는 두 딸 줄기 세포를 초래하기 위해 대칭 분할을 겪는 반면, 비대칭 분열을 겪고있는 줄기 세포는 모든 BrdU및 및 BrdU 라벨을 잃은 다른 딸 선조 세포.
5. FACS 선별에 의한 CFSE 라벨 유지 전립선 줄기 세포의 분리
- 일 5: CFSE 표지 된 날 5 prostaspheres 는 디스파제의 2 mL로 매체를 대체하여 3D 배양에서 6 웰 배양 판에서 성장 (지하 막 매트릭스 : 1 :2 비율로 디스파스). 파이펫을 위아래로 여러 번 철저히 혼합합니다.
- 37°C에서CO2 인큐베이터에서 30분 동안 플레이트를 배양하여 매트릭스를 소화합니다.
- 구체 혼합물을 15 mL 원심분리기 튜브로 수집합니다. RT에서 5 분 동안 500 x g의 구체를 원심 분리하여 상수부를 흡인하고 폐기하십시오.
- 구체 펠릿을 따뜻한 0.05% 트립신/EDTA 의 500 μL로 재중단하고 1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮니다.
- 37°C에서CO2 인큐베이터에서 5분 동안 구체를 배양합니다. 10% FBS를 함유하는 따뜻한 PBS 500 μL을 추가합니다.
- 26G 바늘 5x로 1 mL 주사기를 통해 구를 통과하여 구를 단일 세포로 완전히 해리시면 됩니다.
- RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g의 세포를 원심 분리하고 상급을 버립니다.
- 죽은 세포를 염색하기 위해 1 μg/mL 프로피듐 요오드화물 (PI)을 포함하는 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다. RT에서 1 분 동안 배양하십시오.
- RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g의 세포를 원심 분리하고 상급을 버립니다.
- 따뜻한 배양 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단시다. RT. 흡인에서 5 분 동안 500 x g의 세포를 원심 분리하고 상급을 버립니다.
- 500 μL의 따뜻한 배양 배지에서 세포를 재중단하고 35 μm 크기의 세포 스트레이너 스냅 캡을 통해 여과하여 5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에서 세포를 수집합니다.
- 단일 채널 FACS 분석기를 통해 트립신 분산 CFSE 표지 된 프로스타스피어 세포의 분석을 수행합니다.
- 분별된 CFSEHi,CFSEMed및 CFSELo 셀의 하위 모집단을 게이트합니다. 게이팅에 음수 및 양성 컨트롤을 사용합니다.
참고: FACS 분류된 CFSE 라벨-유지 전립선 줄기 세포의 존재는 녹색 형광 현미경 검사법 및 비유지 세포에 비해 더 큰 세포 크기로 확인할 수 있다. 이러한 더 큰 세포 크기는 전구 세포 집단에 비해 전립선 줄기 세포의 성질이다. 이것은 그밖 조직 모형과 다를 수 있습니다.
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Representative Results
일차 정상 인간 전립선 상피 세포는 섬유넥틴 코팅 배양 접시에 배치되고 세포 성장은 2D 배양물에서 유지된다(도1a). 지하 막 매트릭스를 가진 3D 문화로 옮겨질 때, 분화한 상피 세포는 천천히 죽습니다. 전립선 줄기 세포만이 5일 이내에 앵커 프리 배양 및 포름 스페로이드에서 생존할 수있다(도 1b).
2D 배양에서 전립선 상피 세포의 이중 표지는 3D 배양에서 구형 형성에 이어 동일한 라벨 유지 세포에서 BrdU, CFSE 및 파 레드의 공동 국소화를나타낸다(도 2a-i).
라벨 유지 세포는 5일째 스페로이드에서 줄기 세포 특성을 보여줍니다. 이중 면역 염색은 라벨 유지 세포가 낮은 수준의 사이토케라틴 단백질 KRT14를 나타낸다는 것을 보여줍니다; 감소 세포 접합 단백질 E-카데린14; 증가된 줄기세포 조기 마커 단백질 Wnt10B13,15,16 및 ALDH1A1; 증가 된 자가 포식 단백질 LC3, 자가 포식 플럭스 활동의 지표17; 및 증가 된 myosin IIB(그림 3a-f).
스페로이드 계 라벨 보유 분석또한 전립선암 표본에서 암 줄기 유사 세포를 성공적으로 검출합니다(그림4). 이것은 암 줄기 같이 세포를 위한 진정한 biomarkers의 발견을 가능하게 하고 전립선암을 위한 새로운 치료 표적을 확인하는 잠재력을 가지고 있습니다.
그림 1: 2D 배양에서의 HPrEC 의 유지 보수 및 3D 배양에서의 스페로이드 형성. (a)HPrEC의 2D 1차 배양액은 BrdU-표지되고 5일째(b)에프로스타스피어 형성과 함께 3D 문화로 옮겨졌다. 배율 막대 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 1차 프로스타스피어에서 장기 라벨 유지 세포의 식별. BrdU (빨간색) 및 CFSE (녹색)의 이중 라벨링; CFSE(녹색) 및 파 레드(빨강); BrdU (녹색) 및 파 레드 (적색) 부모의 DNA의 보존과 동일한 줄기 같은 세포를 확인. 급속하게 분할된 전구 세포(DAPI, blue)에서 임의의 BrdU, CFSE, 또는 파레드 라벨을 희석하고손실하였다(a-i). 대표적인 이미지는 BrdU/CFSE(상부 패널), CFSE/파 레드(d-f) (중간 패널), BrdU/FarRed(g-i)(하부 패널) 단일 프로스타스피어(PS) 셀에 공동 라벨링된 것을 보여줍니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 줄기 세포 특성을 나타내는 라벨-유지 PS 세포. 비라벨-보유 전구 세포에 비해, BrdU 또는 CFSE 라벨-유지 줄기 세포는(a)낮은 수준의 사이토케라틴(KRT 14),(b)E-카데린의 감소 수준,(c)Wnt10B의 상승 수준,(d)ALDH1A1의 높은 수준,(e)증가된 LC3 및(단백질)증가. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 구형 라벨-포직 분석구를 사용하여 암 줄기 유사 세포의 식별을 위해. CFSE 라벨-포직암 줄기-유사 세포는 비표지된 전구 세포에 비해 감소된 E-카데린 단백질을 나타내고 인간 전립선암 시편으로부터 유래된 스페로이드에서. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다중 줄기세포 표면 마커를 이용한 유세포측정법은 특이성과 선택성 모두 결여에도 불구하고 줄기세포 연구를 위해 일반적으로 사용되는접근법1,5,6. 3D 배양 시스템에서 스페로이드 형성은 HPrEC를 포함하는 1 차 상피 세포로부터 희귀 줄기 세포 집단을 풍부하게 하는 또 다른 유용한 방법이지만, 생성된 스페로이드는 여전히 줄기 세포와 전구 세포의 이질적인혼합물인 2,3,4이다. prostaspheres에서, 급속하게 증식하는 전구 세포에 비해, 줄기 세포의 상대적으로 정지문자는 그(것)들을 장기 적인 레이블 보유 분석결과로 확인될 수 있게 합니다.
이 백서에 요약된 방법은 BrdU, CFSE 및/또는 파 레드 프로 염료13을사용하여 HPrEC의 라벨링을 설명합니다. BrdU, CFSE, 및/또는 빠르게 증식하는 세포에서의 파 레드 프로 염료는 모두 각 세포 분열에 의해 빠르게 희석되는 반면, 불멸의 가닥 DNA분리(11)로알려진 BrdU의 손실을 차지하는 추가적인 메커니즘이 있다. 이것은 줄기 세포가 비대칭 분할을 겪는 때, 1개의 딸 줄기 세포 및 전구 세포를 초래합니다. 딸 줄기 세포는 BrdU 레이블을 가진 모든 오래된 부모 DNA를, 딸 선조 세포는 BrdU 레이블 없이 새로 합성된 DNA를 수신하는 동안 유지합니다. 따라서 BrdU를 사용하는 라벨 보존 분석법은 면역 형광 염색에 의해 라벨 유지 줄기 세포를 보다 명확하고 쉽게 식별할 수 있습니다. 이는 두 개의 상이한 항체를 사용하여 IF 이중 염색에 의해 줄기 세포 바이오마커를 확인하는 데 특히 유용하다. BrdU 라벨링의 한 가지 주요 제한사항은 IF 염색을 위해 세포를 고정해야 하므로 BrdU 라벨링 및 세포 고정 에 따른 추가 기능적 연구를 방지해야 한다는 것입니다.
이 문제를 해결하기 위해, 살아있는 HPrEC 라벨링을 위한 2개의 형광 프로 염료는 라벨 고정 검소 에서 시험되었습니다. 결과는 BrdU, CFSE 및 원거리 표지된 구체 세포의 완전한 중첩이 있었다는 것을 나타냈다. BrdU 라벨은 구형 라벨 유지 검사에서 CFSE 또는 Far Red로 대체될 수 있어 FACS에 의한 이미징 및 분리를 위한 살아있는 세포의 시각화를 허용하고, 생체외 세포 배양 및 생체 내 이종이식 검사지 둘 다를 사용하여 단리된 살아있는 줄기 세포의 기능적 특성화를 촉진한다13. CFSE 또는 Far Red 라벨 기반 FACS 정렬 라이브 줄기 및 전구 세포는 또한 새로운 줄기 세포 유전자 마커 및 신호 경로뿐만 아니라 상피 세포 계층 계층 구조를 식별하는 데 매우 강력한 단일 세포 RNA-seq를 포함하는 RNA-seq를 위해 사용될 수 있었습니다.
여기에 제시된 스페로이드 계 라벨 보유 분석법에 의한 줄기세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 프리 방법은 1차 환자 표본 및 암 세포주로부터 암 줄기 유사 세포를 식별할 수 있다. 따라서, 암 줄기유사 세포의 새로운 바이오마커를 발견하고암(13)을표적으로 하는 효과적인 치료제를 개발하기 위한 길을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 재정적 인 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 암 연구소 R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 시카고 일리노이 대학의 유동 세포 측정 코어에 세포 선별에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
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