Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

Zusammenfassung

Hier stellen wir einen Workflow für die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR Heterodimeren in Hefe vor.

Zusammenfassung

SNX-BAR-Proteine sind eine evolutionär konservierte Klasse von Membran-Remodeling-Proteinen, die eine Schlüsselrolle bei der Sortierung und dem Handel mit Proteinen und Lipiden während der Endozytose, der Sortierung innerhalb des endosomalen Systems und der Autophagie spielen. Zentral für die SNX-BAR-Proteinfunktion ist die Fähigkeit, Homodimere oder Heterodimere zu bilden, die Membranen mit hochkonservierten Phox-Homologie-Domänen (PX) und BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) binden. Darüber hinaus kann die Oligomerisierung von SNX-BAR-Dimern auf Membranen die Bildung von Membrantubuli und Vesikeln auslösen, und diese Aktivität wird angenommen, dass sie ihre Funktionen als Mantelproteine für Endosomen-abgeleitete Transportträger widerspiegelt. Forscher haben lange In-vitro-Bindungsstudien mit rekombinanten SNX-BAR-Proteinen an synthetischen Liposomen oder riesigen Unilamellar-Vesikeln (GUVs) verwendet, um die genaue Zusammensetzung von Lipiden zu enthüllen, die für die Remodellierung der Membran erforderlich sind, und so ihren Wirkmechanismus zu offenbaren. Aufgrund technischer Herausforderungen mit dualen Expressionssystemen, der Toxizität der SNX-BAR-Proteinexpression in Bakterien und der schlechten Löslichkeit einzelner SNX-BAR-Proteine haben die meisten Bisherigen Studien SNX-BAR-Homodimere untersucht, einschließlich nicht-physiologischer Dicher, die sich während der Expression in Bakterien bilden. Kürzlich haben wir ein Protokoll optimiert, um die großen Mängel eines typischen bakteriellen Expressionssystems zu überwinden. Anhand dieses Workflows zeigen wir, wie man große Mengen von SNX-BAR Heterodimeren erfolgreich ausdrückt und reinigt und wie man sie auf synthetischen Liposomen für Bindungs- und Tubulationstests rekonstituiert.

Einleitung

Membrangebundene Organellen wie die Plasmamembran, das endoplasmatische Retikulum, das Golgi-Gerät, Dassosom (Hefe-Vakuole) und endosom bilden das Endomembransystem der eukaryotischen Zelle. Die meisten Organellen haben die Fähigkeit, Material mit anderen Organellen durch Vesikeltransportträger zu kommunizieren und auszutauschen. Wie die Zelle die Verpackung und Bildung von Vesikeltransportträgern innerhalb des Endomembransystems koordiniert, ist nicht genau bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass die Proteine und Lipide, die einen Großteil des Endomembransystems ausmachen, aus der Internalisierung endozytärer Vesikel aus der Plasmamembran (PM) stammen. Das Endosom ist d....

Protokoll

1. Hefe-Stamm-Konstruktion

1. Beginnen Sie mit TVY614 (pep4x::LEU2 prb1'::hisG prc1'::HIS3)¹¹ als übergeordnete Raufe. Dieser Stamm ist mangelhaft für vakuolare Proteasen, die zum Großteil des Proteinabbaus nach der Zelllyse beitragen, und ermöglicht somit eine sauberere und effizientere Reinigung.
2. Designprimer¹² und integrieren Tandem Affinitätsreinigung (TAP) Tag am C-Terminus von Atg20 (SNX-BAR ORF 1) mit homologe Rekombination. Verwenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um Integrationen zu bestätigen (Abbildung 2).
3. Führen Sie ....

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur reproduzierbaren und robusten Herstellung von endogenen Hefe-SNX-BAR-Komplexen, die für nachgeschaltete Membran-Remodellierungstests verwendet werden können (Abbildung 1). Die Konstruktion des Hefestamms, der zur Reinigung verwendet wird, nutzt die Effizienz der homologen Rekombination in angehender Hefe und ermöglicht Modifikationen an der genomischen Loci der gezielten SNX-BARs (Abbildung 2<.......

Diskussion

Hier zeigen wir einen optimierten Workflow zur Reinigung von SNX-BAR-Dimeren in Hefe und zwei Assays zur Bewertung ihrer biophysikalischen Eigenschaften auf synthetischen Liposomen. Der Hauptvorteil gegenüber der typischen rekombinanten Proteinexpression in Escherichia coli oder anderen Systemen ist die Fähigkeit, SNX-BAR-Proteine in einem nativen Wirt gleichmäßig auszudrücken und so die Toxizitäts- und Unlöslichkeitsprobleme zu vermeiden, die bei der Reinigung von SNX-BARs in anderen Systemen auftreten. Bemerke.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 μ m PC-Membranen	Avanti	610006
10 mL Poly-Prep Chromatographiesäule (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
27 G Nadel	BD Biosciences	301629
Amicon Ultra Zentrifugalfilter mit 10K Cutoff	Amicon	UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenisator	Avestin	EF-C3
BCA Assay	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP Ultrazentrifuge	Beckman Schar	393315
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterol (Sigma)	Sigma	47130-U
Extruder Set mit Block 0.2 μ L/1 mL	Avanti	610000
FEI Tecnai F20 Transmissionselektronenmikroskop (200 kV)
Glaskulturröhrchen	VWR	47729-570
IgG-Sepharosekügelchen (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Mikrolter-Glasspritzen	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	oder gleichwertig Schütteln 30 & Grad; C
Ni-NTA Magnetische Agarose-Perlen	Pierce	78605
Optima XE-90 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Parafilm M	VWR	52858-076
PI3P	Echelon	P-3016	oder gleichwertige Echelon-Flaschenbaugruppe
Polycarbonat	Beckman Coulter	355622
TLA-100 mit festem Winkel Rotor	Beckman Schar	343840
Typ 45 Ti Rotor	Beckman Schar
Vakuumexsikkator, Boden und Deckel mit Steckdosenventil	VWR	75871-436
Vakuumpumpe Alcatel (Pascal 2005 C1)	A& J Vacuum	PN07050
Vortex mit Schaumstoffhalter	VWR	10153-838
VWR KIT MICROTUBE	VWR	12620-880

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