Summary
多细胞系统的组织复杂性混淆了细胞外线索与单个细胞行为之间的因果关系的识别。在这里，我们提出了一种方法，研究接触依赖线索和分裂轴之间的直接联系使用C.elegans胚胎胚芽和粘合聚苯乙烯珠子。
Abstract
在多细胞系统中，单个细胞被来自邻近细胞和环境的各种物理和化学线索所包围。这种组织的复杂性混淆了外在线索和细胞动力学之间的因果关系的识别。合成重组的多细胞系统克服了这个问题，使研究人员能够测试特定的线索，同时消除其他线索。在这里，我们提出了一种方法，以重组细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans爆炸和粘胶聚苯乙烯珠。这些程序包括蛋壳去除、通过破坏细胞粘附性进行胚分裂、制备粘胶聚苯乙烯珠子以及重组细胞-细胞或细胞珠接触。最后，本文介绍了该方法在胚胎发育中研究细胞分裂轴的定位，有助于调节发育胚胎中的空间细胞模式和细胞命运规范。这种健壮、可重复和多功能的体外方法有助于研究空间细胞接触模式与细胞反应之间的直接关系。
Introduction
在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如，分轴）由各种化学和物理线索指定。理解单个细胞如何解释这些信息，以及它们如何将多细胞组装作为一个紧急属性进行调节，是形态发生研究的最终目标之一。模型有机体C.elegans对细胞级形态形成调节的理解有显著贡献，如细胞极性1、细胞分裂模式1、细胞命运决定2、组织尺度调节，如神经元接线3和器官发生4、5。虽然有各种各样的遗传工具可用，组织工程方法是有限的。
在C.elegans研究中最成功的组织工程方法是经典的胚乳分离6;由于C.elegans胚胎被蛋壳和渗透屏障7包围，其去除是这种方法的主要程序之一。虽然这种爆破器隔离方法能够以简化的方式重组细胞-细胞接触，但它不允许消除不需要的线索;细胞接触仍然构成机械（例如，附着力）和化学线索，从而限制了我们完全分析线索和细胞行为之间的因果关系的能力。
本文介绍的方法使用Carboxylate改性聚苯乙烯珠子，该珠子可以共价地与包括蛋白质在内的任何胺反应分子结合为配体。特别是，我们使用一种抗胺反应形式的罗达明红-X作为配体，使珠子既可目视跟踪，又粘附在细胞上。配体分子的珠表面和原胺组的甲苯基组由水溶性甲酰胺1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）卡博迪米（EDAC）8、9结合。获得粘合珠子允许机械提示对细胞动力学10的影响。我们已经使用这种技术来识别细胞分裂方向10所需的机械线索。
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Protocol
1. 胶粘剂聚苯乙烯珠子的制备
注：此协议不需要无菌技术。
- 在1.5 mL微离心管中称量10mg的Carboxylate改性聚苯乙烯珠子。
- 要清洗珠子，在管中加入1 mL的2-（N-变形）甲酸（MES）缓冲液。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐，可降低卡博迪米德的活性，适合用于蛋白质耦合反应。涡旋管混合珠子。
- 通过台式离心机在 2，000 x g下旋转管子 60 s。
- 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
- 按照步骤 1.2-1.4 再次用 1 mL 的 MES 缓冲液清洗珠子。
- 将含有10毫克EDAC的MES缓冲液加入管中，以激活表面的Carboxyl基组。涡旋管混合珠子。
- 在室温下旋转和孵育管15分钟。
- 在 2，000 x g下旋转珠子 60 s。
- 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
- 要清洗珠子，在管中加入1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。涡旋管混合珠子。
- 在 2，000 x g下旋转管 60 s。
- 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
- 按照步骤 1.10-1.12 再次用 1 mL 的 PBS 清洗珠子。
- 使用的罗达明的最终浓度将取决于被成像的菌株。从 0.65 mM 罗达明红X-X库存溶液中制备 1 mL 的 1、10、100 和 1000 倍稀释系列罗达明红-X。
- 将20μL的珠子移入每个连续稀释管中。
- 在室温下旋转和孵育管5分钟。
- 通过重复步骤 1.10-1.12，用 1 mL 的 PBS 清洗珠子两次。
- 将 1 mL 的 PBS 添加到管中，并将其储存在 4°C 下长达 6 周。在用于实时成像的显微镜下检查珠子的荧光强度。罗达明红-X琥珀基酯的适当浓度取决于成像条件（图1）。
注：没有罗达明红X治疗的珠子不粘附在细胞上。罗丹胺红-X用作荧光标记和粘合剂分子。带正电荷的罗达明红-X和带负电荷的等离子膜之间的静电相互作用是粘附的一个假定原因。
2. 口腔移液器的组装
- 切割宽（6.35毫米内径）和窄（3.175毫米内径）泰贡管，分别约25厘米和40厘米长（图2）。
- 用聚四氟乙烯 （PTFE） 过滤器（0.2 μm 孔径）连接 Tygon 管（图 2）。
- 拆解市售的吸气管，并将其毛细管支架和喉舌分别连接到窄管和宽的Tygon管的末端（图2）。
注：PTFE过滤器用于防止通过口腔移液器吸入次氯酸盐溶液的烟雾。
3. 胚胎胚芽的分离
注意：戴上手套和实验室外套，避免切割和接触漂白溶液。
- 用右手和左手握住微毛细管的每一端（容量;10 μL）。
- 将微毛细管拉向两端以施加张力，并将毛细管的中心位于燃烧器上，使两个手拉毛细血管（图3A）。
- 在解剖显微镜下用钳子修剪手拉毛细血管的尖端，并将拉毛细管连接到口腔移液装置中（图2）。准备两种类型的移液器。移液器的尖端开口尺寸应约为胚胎移植和蛋壳切除的C.elegans胚胎（30μm）的短轴长度的2倍和1倍，分别图3B-D。
- 将蛋盐溶液45μL移液到多井滑井上（图4A;底部）。
- 将5-10只成年C.elegans放入含有蛋盐溶液的井中。
- 为了获得早期的C.elegans胚胎，通过将两根针插在C.elegans身体的左右，并相互滑动针头，将成人切成碎片（图4A;上部示意图）。
- 将45μL的次氯酸盐溶液移液到含有蛋盐溶液的井旁的井上（图4B）。
- 雪尔顿生长介质的移液器45 μL，在含有次氯酸盐溶液的井旁的随后三口井上（图4B）。
- 将1细胞阶段和早期2细胞阶段胚胎通过口移移进入次氯酸盐溶液中，用手绘毛细管进行胚胎移植（图4B）。
- 等待 40-55 s。
- 通过将次氯酸盐溶液中的胚胎从次氯酸盐溶液移植到谢尔顿的生长培养基，用手绘毛细管移液进行胚胎移植，洗净胚胎（图4B）。
- 再次清洗胚胎，通过将胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用手绘毛细管移液进行胚胎移植（图4B）。
- 通过用手绘毛细管进行口移，将洗涤的胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用于胚胎移植。使用手绘毛细管去除蛋壳，仔细重复移液（图4C;中间示意图）。如果成功取出蛋壳，胚胎细胞将变得更球形（图4C;右图）。
- 通过用手绘毛细管轻轻连续移液分离2细胞阶段胚胎胚泡（图4D）。
4. 用爆波米尔和珠子重新构成接触模式
注：在成像显微镜下工作，以避免细胞与珠子分离，并便于及时采集图像。
- 要使用倒置显微镜进行观察，请准备如图5所示的成像室。
- 将盖玻片放在盖玻座上 （图 5A）。
- 用胶带盖住盖玻片的边缘以稳定它。带胶带的一侧是"背面"（图5A，B）。
- 将盖玻片支架翻转到"正面"侧，用疏水笔在盖玻上画一个圆圈（图5C）。
注：任何玻璃底盘也有效，前提是胚胎可由口腔移液器操作。
- 在疏水标记绘制的圆内添加谢尔顿的生长介质（图5D）。
- 将隔离的爆破仪转移到成像室。
- 使用手绘毛细管分配少量化学功能化珠子进行胚胎移植。
- 通过吹入手绘毛细管来控制聚苯乙烯珠子的位置，直到珠子附着在隔离的胚泡上。
- 安装盖玻片以避免介质蒸发 （图 5E）。执行实时成像。
5. 制备重要试剂
- 蛋盐溶液（10 mL）：将235 μL的5M纳C和240 μL的2M KCl与9525 μL的dH2O结合。
- 次氯酸盐溶液（10 mL）：将7.5 mL Clorox（含约7.5%次氯酸钠）与2.5 mL的10 N NaOH（次氯酸钠的最终浓度约为5.625%）结合。
注：虽然许多已发表的方法都使用齐齐酸酶来消化蛋壳，但我们采用了一种使用次氯酸盐溶液11的方法。通过避免成批变化的齐平酶活动，我们相信这种方法是更具可重复性和成本效益的方法。 - 0.81 mM Inulin 溶液 （40 mL）
- 将 0.2 克硫林添加到 40 mL 的 dH2O。
- 高压灭菌溶解。
注：在4°C下保持1个月。
- 0.5 M MES 缓冲器 （500 mL）
- 将 48.81 克 MES 溶解在 400 mL 蒸馏水中（dH2O）。
- 将 pH 调整到 6.0。
- 使用 dH2O，使总体积达到 500 mL。
- PBS 解决方案 （1 L）
- 要制造 10 倍 PBS 溶液，将 1 包 PBS 预混合粉末溶解在 1 L 的 dH2O 中。
- 将 100 mL 的 10 倍 PBS 解决方案与 900 mL 的 dH2O 相结合。
- 5% 聚苯丙酮 （PVP） 溶液 （4 mL）
- 在无菌条件下，在4 mL的果蝇施耐德介质中溶解0.2克PVP。
注：始终打开施耐德在组织培养 （TC） 罩中的中等库存。在4°C下保持1个月。
- 在无菌条件下，在4 mL的果蝇施耐德介质中溶解0.2克PVP。
- 0.65 mM 罗达明红X库存溶液 （2 mL）
- 重量 1 毫克罗达明红-X。
- 加入2 mL二甲基亚硫酸盐（DMSO）溶解。
- 在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 谢尔顿的生长介质 （SGM） （10.25 mL）
- 在无菌条件下，将8 mL的果蝇施耐德中度、1 mL的PVP溶液、1mL的Inul溶液、1mL的巴司中鹰（BME）维生素、50μL的青霉素-链霉素和100μL的脂蛋白浓缩物混合在一起。
- SGM 的等分 325 μL 放入 1.5 mL 微管中。
注：在4°C下保持约1个月。 - 在胚膜分离当天，向SGM中加入175 μL的胎儿牛血清（FBS）（总体积为500μL）。
注：将 FBS 储存在 -20°C，并在使用前解冻。FBS 不需要被热杀死。
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Representative Results
对于珠子制备，我们确定了表达GFP-肌苷II和mCherry-组蛋白的转基因菌株的红-X琥珀酯的最佳量（图1A-D）。我们使用 mCherry 标记组蛋白作为细胞周期进展的标记。由于罗达明红X-X和mCherry将由561nm激光照明，因此罗达明红X-X信号的最佳强度与组蛋白相当，可以同时成像细胞和珠子。例如，使用 0.005 μg/mL Rhodamine 红-X 琥珀酯处理的珠子的荧光信号太弱，无法可视化珠（图 1A）。另一方面，用5μg/mL罗达明红-X琥珀酯处理的珠子发出的荧光信号太强，无法成像mCherry-组蛋白（图1D）。我们确定0.5 μg/mL罗达明红-X琥珀基酯是这种特殊转基因菌株的最佳选择（图1C）。
布拉斯托米尔隔离是按照图4所示的过程进行的。对于成功的实验，应解决以下几点。1） 井中的介质随着时间的推移蒸发并变得粘稠;这导致胚胎粘在玻璃毛细管和其他胚胎，所以需要使用新的孔与新的介质。2） 在次氯酸盐溶液中，胚胎浮到表面。因此，降低显微镜的放大倍率，并聚焦于水滴表面，以简化胚胎的转移。3） 次氯酸盐溶液的有效性可能有所不同。因此，应针对每批新批次氯酸盐溶液测试胚胎在次氯酸盐溶液中的持续时间。4） 将口腔移液器尽可能靠近胚胎，以尽量减少吹入移液器所用的强度，但也不会太近，以便胚胎也被吸起（连接珠子时也是如此）。5） 卵壳切除后，胚胎变得非常脆弱。因此，施加在口腔移液器上的力需要稍微降低，以防止胚胎破裂。6） 长时间使用口腔移液器可能会抑制PTFE过滤器，7）2细胞阶段胚胎只有在细胞核已清晰形成时才能分离（图4C，左原理图）。与完整胚胎中的细胞（图4A;右）相比，没有蛋壳的胚胎中的细胞看起来更圆（图4C;右图）。此外，在爆炸粒隔离后，爆粒的形状变成球形（图4D;右图）。
为了测试物理接触相关提示对细胞分裂方向的影响，我们将罗达明红X涂层珠子附在从2细胞阶段分离的AB胚膜上，并进行实时成像（图6，图7）。没有罗丹胺红X处理的珠子没有粘附在胚泡上，这表明罗丹胺红X作为荧光标记和粘合剂分子。在分析细胞分割方向时，利用ImageJ12的"3D项目"功能（图6A;围绕Y轴倾斜）对延时图像进行了3D重构。为了确定包含线轴（主轴平面）的平面，我们首先确定了两个中心体垂直对齐的平面（图 6B;110°）：此平面的 ±90° 角的平面为主轴平面（图 6B;-20°）。接下来，我们测量了细胞因子化后与细胞珠接触界面（接触方向）相对的主轴（主轴方向）的角度（图6C）。当两个子单元都连接到珠子时，一条经过两个接触点的线被用作接触方向。
在以前的研究中，我们已经确定了在珠诱导AB细胞分裂方向10期间各向异性细胞表面肌苷流动。然而，当细胞在定向分裂期间移动时，很难测量细胞内肌苷流。为此，我们首先选择了主轴与成像平面（xy 平面）对齐的样本（图 7）。其次，使用最大投影方法（图7）投影Z堆栈。第三，使用子像素配准算法Stack reg插件13的 ImageJ 和刚体选项（图 7B） 纠正了细胞运动。通过图像的配准，细胞的位置是稳定的（图7B）。最后，通过使用ImageJ的手动跟踪插件，跟踪肌苷病（图7C）。根据坐标信息，在细胞因子发生后50秒内计算了沿分割轴和垂直于它的轴的肌苷的速度。
图1：确定红-X浓度。（A-D）表达GFP-肌苷（绿色）和mCherry-组蛋白（品红色）的胚胎被放置在与不同浓度的罗丹红X-X（洋红色）结合的珠子附近。mCherry 和 Rhodamine Red-X 的信号强度沿白色虚线（下图）绘制。使用 0.5 μg/mL 罗达明红-X治疗的珠子和组蛋白信号被清楚地检测到。比例尺显示10μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：口腔移液器的组装。嘴移液器通过连接窄 （1） 和宽 （2） Tygon 管与 PTFE 过滤器 （3） 进行组装。在窄宽的Tygon管的末端，分别连接毛细管支架（4）和嘴片（5）。手绘玻璃毛细管 （6） 可插入毛细管支架中。刻度条是50毫米。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图3：布拉斯托米尔隔离。（A） 手拉玻璃毛细管.（B） 用于胚胎移植的手绘玻璃毛细管。（C） 用于去除蛋壳的手工绘制的玻璃毛细管。（D） 显示适当尺寸的毛细管开口的示意图，用于去除蛋壳。箭头表示胚胎。比例尺显示100μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：布拉斯托米尔隔离工作流。（A） 在蛋盐缓冲液中解剖成年的C. elegan获得胚胎。照片显示2细胞和4细胞阶段胚胎在卵壳切除之前。（B） 次氯酸盐治疗和洗涤。（C） 架构描绘了切蛋壳去除的适当时机.照片显示蛋壳切除后有一个4细胞阶段胚胎。（D） 布拉斯托米尔分离.照片显示一个分离的2细胞阶段胚胎。C 和 D 中箭头的大小表示移液过程中所需的相对力。比例尺显示50μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：成像室的装配。（A） 将盖玻片连接到盖玻座。（B） 盖玻片支架的图像。装配前后的盖玻座分别指示在左侧和右侧。（C） 用疏水笔绘制的圆圈.（D） 在圈内添加谢尔顿的生长介质和样本。（E） 安装盖玻片以避免蒸发。比例尺显示50毫米。请点击这里查看此图的较大版本。
图6：细胞分割方向分析。（A） 细胞分裂方向分析图.（B） 主轴平面的确定。左侧图像显示示例示例。3D 重建的 4D 影片围绕 Y 轴旋转，以确定两个中心体垂直对齐的平面（右图;右上图图）。在此示例中，主轴平面为 110° 的 ± 90°（中间图像;右下原理图）。（C） 相对于细胞珠接触的主轴方向的测量。使用主轴平面的图像，根据连接两个中心体（右侧原理图中的橙色虚线）和细胞接触（蓝色虚线）的线之间的角度确定细胞因子后的主轴方向。当两个子细胞都连接到珠子时，细胞珠接触方向是穿过两个接触点的线。绿色是肌苷和中心体，品红色是组蛋白和珠子。刻度条为 10 μm，时间是分钟和秒。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：肌苷流分析。（A） 肌苷流分析图.（B） 单元格分裂方向的校正。为了量化细胞内肌苷流动动力学，使用ImageJ插件堆栈reg（刚体选项）修正了分细胞的旋转。上部和底部图像是堆栈 reg 处理前后的。右侧大多数图像显示时间序列的时间颜色代码。（C） 肌苷病灶的跟踪.使用 Stack reg 处理的图像，ImageJ手动跟踪插件跟踪了单个肌苷活动。分割轴和垂直于它的轴分别定义为 x 和 y（右原理图）。根据坐标信息测量了x轴和y轴（Vx和Vy）中的肌苷流速。刻度条为 10 μm，时间是分钟和秒。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
重建简化的细胞接触模式将使研究人员测试特定细胞接触模式在形态形成不同方面的作用。我们用这种技术来表明细胞分裂轴是由粘接珠体接触控制的。由于分轴规范对多细胞发育至关重要，有助于形成形态生成14、干细胞分裂15、16和组织平衡15、16，这种方法应该能够阐明动物组织形成的新机制。
除了细胞分裂方向外，这种方法还有可能成为测试机械线索和细胞命运之间关系的平台。以前的研究报告说，机械提示控制细胞命运规范。人类等位干细胞分化成神经元、脂肪细胞、骨骼肌细胞和骨细胞，在基质中培养时具有不同刚度17。为了应对基质刚度，转录调节器是相关蛋白（YAP）和TAZ（转录共激活剂与PDZ结合图案）将转移到细胞核，以调节细胞命运规范18。本文介绍的方法，通过培养细胞长期接触粘接珠子，对机械提示在细胞命运规范中的作用也有所帮助。
这种方法在重述在体内观察到的某些机械线索时有局限性。在C.elegans中，蛋壳和渗透性屏障是一种物理约束。虽然去除蛋壳不影响正常发育，但去除蛋壳和渗透性障碍会导致异常的形态形成19。在没有蛋壳和渗透性屏障的情况下，细胞形状变得更球形，表明细胞和细胞蛋壳之间的压力在细胞变形和图案化中起着至关重要的作用。事实上，细胞挤压力已被提出来调节细胞分裂方向20。在组织之间没有物理约束和假定压力，我们期望这种方法也不能在体内细胞接触区重述。由于细胞接触区域已知会影响Notch信号21，当某些机械或化学提示不工作使用这种体外方法时，需要进一步考虑这一限制。
到目前为止，我们已经测试了分离AB、P1、EMS、P2、ABa、ABp细胞（细胞多达6个细胞级）的细胞分裂方向10，但只要可以分离单个细胞，该方法就可以应用于以后的发展。最近的单细胞测序研究已经利用蠕虫体内的丙酶消化分离幼虫细胞22。因此，有可能使用丙酮酶治疗来分离晚期胚胎细胞和幼虫细胞。
在这项研究中，我们展示了机械提示和细胞分裂方向之间的相互作用的例子，但细胞-细胞通信也由化学线索（如Wnt23、Notch24、附着力耦合受体25等）进行介导。重要的是，这里介绍的珠子制备方法可以将珠子与任何蛋白质耦合，从而允许重组化学线索。先前的研究也使用Sepharose珠26和蛋白质-A磁珠27涂有Wnt蛋白来证明与Wnt相关的发育过程。然而，与Carboxylate改性聚苯乙烯珠相比，这些珠子在商业上没有各种尺寸可供选择。因此，未来的研究可以使用所呈现的方法作为一个平台，以更可调的方式测试化学和物理线索的作用。综合起来，这种方法适合研究人员，他们正在研究空间细胞接触模式产生的细胞行为和反应，并希望消除其他细胞线索。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢詹姆斯·普里斯和布鲁斯·鲍曼的建议，并提供C.elegans菌株，唐·莫曼，小田美祖本，和生命科学研究所成像核心设施，用于共享设备和试剂，奥伊·希罗亚苏，丽莎·费尔南多，明吉金维护C.elegans和批判性阅读我们的手稿。我们的工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）（RGPIN-2019-04442）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M.
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J.
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K.
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C.
- Poulson, N. D., Lechler, T.
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al.
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
