Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודל מסרטן העור המושרה כימי באמצעות דימתילבנץ [a] פחם ו-12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (DMBA-הסברתי)

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60445
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,2, 1
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

שני השלבים העור קרצינונוספגנזה נגרמת על ידי שני כימיקלים למריחה על הגוף. מוטגן 7, 12-diמתילבנץ [א] פחם) גורם מוטציות בתאים עוריות ויישום מתמשך של מקשה צמיחה כללית 12-O-טטרדקליאיל פורובול-13-אצטט מאיץ הפפילומה העור היווצרות.

Abstract

סרטן היא אחת ממחלות האדם ההרסניות ביותר. מודלים של סרטן ניסיוני חשוב לקבל תובנה לתוך הגומלין המורכבים של סוגי תאים שונים וגנים בקידום התקדמות הגידול כדי לספק פלטפורמה לבדיקת יעילות של גישות טיפוליות שונות. אחד הדגמים הנפוצים ביותר בשימוש בסרטן דלקתיות הניסויים הוא DMBA-הסברתי שני בשלב העור קרצינופוגנזה מודל. היווצרות הגידול הוא המושרה במודל זה על ידי יישום מקומי של שני כימיקלים שונים, 7, 12-diמתילבנץ [a] פחם (DMBA) ו 12-O-טטרדאנואיל פורובול-13-אצטט (הסברתי), כי ביחד לגרום היווצרות הפפילומה בעור. כמו התוצאה העיקרית היא היווצרות הפפילומה בעור, המודל הוא אידיאלי, אמין, הדרך הניתן ליישום לטפל בשני הגידול (הישרדות ללא הגידול) ואת התקדמות הגידול (מספר וגודל של גידולים גלויים). ההשפעות של הטיפול DMBA-הסברתי מועברים באמצעות מנגנון דלקתי, מה שהופך את המודל הזה מתאים במיוחד ללמוד את התפקיד של מערכת החיסון במערך הגידול. עם זאת, מודל זה מוגבל לעור ומשטחים אחרים שבהם ניתן להחיל את הכימיקלים. פרוטוקול מפורט מסופק במאמר זה כדי להשתמש במודל בהצלחה.

Introduction

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. לכן, יש דרישה לפתח מודלים אמין של מחלות נסיוניות כדי להשיג הבנה טובה יותר של המחלה, כמו גם לחקור גישות טיפוליות פוטנציאליות. אחד הניסויים הנפוצים ביותר ב vivo מודלים לחקר התפתחות סרטן העור הוא המושרה כימית שני בשלב העור קרצינובגנזה דגם1,2. המודל מספק כלי לחקר ייזום הגידול, קידום, והתקדמות בנוסף אירועים ספציפיים כגון הסתננות התא החיסונית אנגיוגנזה.

כדי להשתמש במודל העור של שני השלבים, העור האחורי של עכברים מטופל עם שני כימיקלים שונים, כי ביחד לגרום להיווצרות הגידול. המודל הוא יזם עם מינון נמוך של המוטגן, DMBA, ואחריו חשיפה ממושכת למקדם הגידול, הסברתי3 (איור 1). Dmba מוטציה דנ א באופן אקראי על ידי יצירת הפונקציות הקווננטי עם ה-dna של תאים עוריות ותאי גזע העיקרי keratinocyte4,5,6,7. כמה מוטציות אקראיות אלה להתרחש במקום הפרוטו-אונאוגן, כגון Hras1 (מוטציות ב קראס ו Nras מזוהים גם) ואת ההמרה של פרוטו-אונגנים כדי אונגנים כוננים את היווצרות הגידול תחת גירויים נכונה. הסברתי, בתורו, הוא הגידול הנפוץ ביותר בשימוש בצמיחה-הסוכן לקדם. המטרה המולקולרית שלה היא קינאז חלבון (PKC)8. הסברתי גם מפעיל Wnt/β-catenin איתות כי הוא חיוני להיווצרות הגידול במודל9. חשיפה חוזרת וממושכת אל הסוכן לקדם מוביל איתות התא משופר, הגדלת הייצור של גורמי גדילה, תגובה דלקתית מקומית, אשר ברור בשל סינתזה מוגברת DNA וחדירת תאים דלקתיים בעור המטופל.

מתווכים דלקתיים מפתח במודל DMBA-הסברתי זוהו10. Interleukin-17a (IL-17a) ידוע להיות טווריגניים במיוחד במודל dmba-הסברתי11,12. היא פועלת בסינרגיה עם אינטרלוקין 6 (IL-6) ומשתתפת ב-מקרופאג ובגיוס נויטרופילים13,14. בנוסף, CD4+ T תאים נויטרופילים הוכחו להיות tuמוריגניים במודל dmba-הסברתי. לבסוף, מקרופאגים יכולים גם לקדם tuמוריגנזה במודל15,16,17.

במהלך שלב הקידום, התפשטות התא של התאים מוטציה הוא משופר והיפרפלזיה מתמשכת של האפידרמיס נשמר1. זה מוביל התפתחות הפפילומה בעור בתוך 10 – 20 שבועות, אחרי אשר הפפילומה להתחיל להמיר גידולים ממאירים, קרצינומה של תאים קשקשיים (SCCs)2. עם זאת, פחות מ 10% של התקדמות הפפילומה כדי ממאירות, למרות אחוז זה גם תלוי ברקע גנטי של עכברים2,18. במשך עשורים זה לא היה ידוע איזה סוג של תאים היו בתחילה מוטציה בגידולים המובילים ממאירות, אף על פי מחקרים מסוימים דיווחו בבירור תכונות נפרדות של גידולים ממאירים בהשוואה שפיר הפפילומה19,20. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הגדילו מאוד את ההבנה שלנו על מקור המשובטים של היווצרות הגידול ב-DMBA-הסברתי מודל21. . בסדר, 22 23. זה הוכח כי הן מח עצם נגזר האפיתל תאים ותאי גזע שיער זקיק לתרום את היווצרות הגידול22. מחקרים ספציפיים השושלת שושלת היוחסין חשפה כי הפפילומה השיפיר הם של מקור חד שבטיים, אבל הם לגייס אוכלוסיות חדשות אפיתל החדש21,23. עם זאת, רק אחד של שיבוטים תא מתפקד כמנהל התקן עבור קרצינופוגנזה; הוא מכיל מוטציה של Hras23. ההתקדמות ליצירת קרצינומה קשורה. לסריקת שבטיים23

DMBA מסרטן יוזם היווצרות הפפילומה ו הסברתי מקדמת צמיחת הגידול. מכאן, את החניכה הגידול ניתן ללמוד בנפרד מן הקידום על ידי הפרעה בניסוי לפני תקופת הטיפול הסברתי. כמו התקדמות הגידול הוא למד שבועי הוא מציע הזדמנות גדולה לניתוח מפורט הגידול בגידולים במהלך המחקר. בגלל הגידולים מופקים על ידי כימיקלים חיצוניים, מוטציה אונגניים ב germline היא מיותרת. כך, לימוד ההשפעות של רקע גנטי (למשל, הסתרה/העברה לעומת סוג פראי) על tuמוריגנזה הוא פשוט2. בסכום, DMBA/הסברתי מודל סרטן העור היא גישה שימושי במיוחד עבור לימוד התפקיד של מערכת החיסון בהתקדמות הגידול, כמו גם להערכת ייזום הגידול וקידום צעדים עצמאית או באופן בלתי תלוי.

Figure 1
איור 1: DMBA-הסברתי-המושרה העור קרצינואוגנזה מודל המתאר. DMBA מסרטן הוא למריחה על הראש כדי לגרום למוטציות DNA בשלב החניכה של המודל. הצמיחה-קידום הסוכן הסברתי מנוהל 2x בשבוע כדי לשפר את התפשטות התא במהלך שלב הקידום, המוביל להתפתחות של הפפילומה בעור. בעלי חיים הם הקריבו לאחר תגובת הפפילומה מגיע לרמה, בדרך כלל בתוך שבועות 15 – 20, בהתאם לרקע הגנטי של העכברים. חלק קטן של הפפילומה יכול עוד להתפתח SCCs בתוך 20 – 50 שבועות. כדי ללמוד אירועים מוקדמים בטקס החניכה ובשלב הקידום המוקדם, ניתן לאסוף דגימות (למשל, זמן קצר לאחר הסברתי השני). צילום מייצג והמטאוקסילין וחתך אאוזין ויטראז ' של הפפילומה על העור C57BL/6 לאחר 19 שבועות של טיפול מוצגים. סרגל קנה מידה = 0.1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים הלאומית של פינלנד (פרוטוקול מספר Eסאווי/23659/2018).

1. ניסויים בבעלי חיים, ריאגנטים וציוד

  1. להשתמש בגיל ועכברים מתאימים למין. התחל את המחקר בגיל 7 עד 9 שבועות, כי העור ברוב העכברים הוא בתוך הזמן (שלב המנוחה) סביב גיל2.
  2. שימו לב להתנהגות של בעלי החיים במהלך הלימודים ואם הם נלחמים, אשר לעיתים קרובות מתרחשים אצל זכרים, הבית אותם בנפרד. קרבות עלולים לגרום חתכים בעור, אשר לקדם את היווצרות הגידול. עכברים נשיים העדיפו בשל ההתנהגות פחות אגרסיבית שלהם. גודל קבוצה ניסיוני טיפוסי משתנה בין 8 – 20 בעלי חיים לכל קבוצה24,25,26,27.
    הערה: חישובי צריכת חשמל המבוססים על השונות הביולוגית הנראית במחקרים קודמים מסייעים בבחירת גודל קבוצה גדול מספיק. זנים המשמשים כדוגמאות במאמר זה כוללים Balb/c ו C57BL/6. עם זאת, רבים אחרים העכבר זנים כגון sencar ו-fvb כבר בשימוש עם dmba-הסברתי-model, כמו גם וכוכב ו ג ' ספראג-דאולי2,28,29. יש צורך ברישיון מהוועדה הלאומית או המקומית לעבודת בעלי חיים לפני החניכה של המחקר. בנוסף שיקולי רווחה כלליים, נקודות הקצה הספציפיות לדגם הן בדרך כלל קרצינומה של תאים קשקשיים (SCC) וזיהום של העור. שריטות בעור בשל גירוד לאחר היישום של כימיקלים tumorigenic אצטון הוא אופייני, אבל אחרת בעלי החיים צריכים להראות שום סימנים של אי נוחות. שקילה קבועה (למשל, 2x בחודש) עוזר להעריך את רווחתם של בעלי החיים.
  3. השתמש DMBA ו הסברתי, שניהם מדולל אצטון. ריכוז העבודה של DMBA הוא 250 g/L. מנה עבור בעל חיים אחד הוא 50 μg של DMBA ב 200 μL של אצטון. ריכוז המניה של הסברתי הוא 125 g/L וריכוז הטיפול 25 g/L. מינון הסברתי עבור בעל חיים אחד הוא 5 μg ב 200 μL של אצטון.
    זהירות: dmba הוא מזיק אם בלע ועלול לגרום לסרטן. אצטון מתאדה במהירות. והוא דליק זה עלול לגרום לסחרחורת. ולהרגיז עיניים השתמש במסכת נשימה ו/או בעבודה מתחת לזרימת ואקום. שינוי כפפות לאחר טיפול בכל הכימיקלים האלה. כלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי מונעים את התפשטות הכימיקלים בזמן הדיור של העכברים. לאחר היישום, לאסוף את הטיפים הצינורות המשמשים לטיפול DMBA ולהיפטר בזבוז מסוכן.
    הערה: dmba חייב להיות מוגן מפני אור. הסברתי מדולל מאוחסן ב-20 ° c, רצוי מוגן מפני אור.
  4. להשיג את הציוד הבא: קנה מידה, מכונת גילוח רגילה עבור הפרווה, פיפטות וטיפים של גודל מתאים, סרגל רגיל, מצלמה דיגיטלית, פנקס או עט או מחשב עבור הקלטת הפפילומה, מערכת הרדמה שואף או הרחקה עכבר עם פתח בחלק האחורי, ומערכת הרדמה פחמן דו חמצני להקריב עכברים.

2. העור הפפילומה האינדוקציה וקידום

  1. תגלח את העור האחורי. ותשקול את החיה מאוחר יותר, לגלח את העור בכל פעם שצריך, אבל לא בזמן החשיפה הכימית.
    הערה: להיזהר בעת גילוח סביב הפפילומה ולהימנע מלעשות חתכים על העור. שוקלים כל חיה כל 2 שבועות כדי להבחין בכל הפסד פוטנציאלי במשקל.
  2. החל 50 μg של DMBA ב 200 μL של אצטון למריחה על האזור מגולח באמצעות פיפטה 48 h לאחר גילוח הפרווה. אם צריך, לרסן את החיה באמצעות הרדמה שאיפת אור או הרחקה עכבר.
  3. לאחר 7 ימים, לתת את המינון הראשון הסברתי. החל 5 μg של הסברתי ב 200 μL של אצטון למריחה על הראש עם פיפטה 2x בשבוע, עדיף בימים שני וחמישי או שלישי ושישי.
  4. לספור, להקליט, ולצלם. את הפפילומה כל שבוע מסה ממשית גדולה מ-1 מ"מ נחשבת לפפילומה אם הוא נשאר יותר משבוע אחד. סמנו כל הפפילומה האישי על המפה ולפרט את גודלה כל שבוע. לאחסן תצלומים דיגיטליים.

3. הקרבת בעלי חיים ואוסף דוגמאות

  1. המשך הטיפול עד תגובת הגידול מגיע לרמה. באופן כללי, נטל הפפילומה צפוי להגדיל 10 – 20 שבועות לאחר החניכה, בהתאם למתח העכבר המשמש. המישור צפוי בתוך 15 – 20 שבועות. חלק קטן של הפפילומה (תחת 3%) יכול להתפתח SCCs בתוך 20 – 50 שבועות2.
  2. להקריב את החיות 24 שעות אחרי היישום האחרון הסברתי. השימוש הרדמה פחמן דו חמצני עם פריקה צוואר הרחם או שיטה אחרת מתאים.
  3. בהתאם לשאלת המחקר, אסוף חומר מתאים לדוגמה מבעלי החיים30,31.
    1. לדוגמה, קחו דגימות דם לפני ההקרבה והפרידו את הפלזמה.
    2. גזור פיסות העור עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) כתמים (למשל, המטאוקסילין ואאוזין, תאים מתרבים או דלקתיים).
    3. השתמש באגרופים ביופסיה כדי לאסוף חתיכות עור עם רקמת הפפילומה או לא הפפילומה (מטופלים) העור עבור ביטוי גנים (g., qPCR) ו/או חלבונים (g., כתם מערבי או אליסה).
    4. לאסוף פיסת הטחול ואת בלוטות הלימפה ניקוז העור עבור הניתוח cy, הזרמת להזרים לזרום אם ניתוח מפורט יותר של אוכלוסיות תא החיסון רצוי. ניתן גם להפריד שכבות באפידרמיס והעורי לניתוח נוסף.

4. סטטיסטיקות

  1. לצייר עקומת קפלן-מאייר הישרדות של זמן הפפילומה החופשי ולהשתמש במבחן בדרגה של היומן-קוקס להישרדות. צייר עיקול ליניארי של מספר הפפילומה בשבוע. מכיוון שזהו נתוני ספירה, השתמש במודל רגרסיה לא לינארית. להתייעץ עם סטטיסטיקאי במידת הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאה העיקרית היא ההישרדות (כלומר, הפפילומה החופשי) הזמן בין קבוצות הטיפול או הגנוטיפ. התוצאה המשנית היא מספר הפפילומה בשבוע בכל קבוצה (איור 2). התוצאות הצפויות הן הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בזמן הפפילומה החופשי ובמספר הפפילומה בין קבוצות הניסוי (שתיים או יותר). מומלץ לספור את מספר הפפילומה ולצייר עיקול במהלך הקידום (הסברתי) השלב כדי לקבל מושג על ההבדלים בין הקבוצות בשלב זה. הפסקת הניסוי מוקדם מדי עלולה להסתיר הבדל משמעותי סטטיסטית.

Figure 2
איור 2: התוצאות העיקריות של דגם DMBA-הסברתי המושרה העור סרטן. תמונות מייצגות של הפפילומה על העור העכבר ואת שתי התוצאות העיקריות. הנתונים שולבו מארבעה ניסויים נפרדים. הערה: ניסויים עם Balb/C ו C57BL/6 עכברים נעשו בנפרד. (א) מזימה הישרדות של זמן חופשי הפפילומה. קו מקווקו = Balb/c וקו מלא = C57BL/6. (ב) המספר הממוצע של הפפילומה לכל עכבר. קו מקווקו = Balb/c וקו מלא = C57BL/6. קווי שגיאה = SEM. (ג) עכבר balb/C עם הפפילומה ב 11 שבועות לאחר טיפול dmba. (ד) C57BL/6 עכבר עם הפפילומה ב 11 שבועות לאחר טיפול dmba. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

היסטולוגיה, mRNA, ניתוח הסלולר והחלבונים ניתן לנהל כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס ההבדלים הנצפים. לדוגמה, ניתוחים היסטלוגיים מתאימים לחקר מבנה הפפילומה, מורפולוגיה של העור (עובי באפידרמיס ועורי), תהליכים ביולוגיים שונים (התפשטות, אפופטוזיס, אנגיוגנזה), או חדירה של תאים חיסוניים32 (איור 3). העור הוא אידיאלי עבור כימות אמין של פרמטרים מורפולוגיים ו ihc על ידי המדינה אמנות מערכות ניתוח התמונה30,31,32,33. ג'ין וביטויי חלבון מן (הפפילומה) דגימות העור ניתן ללמוד בקלות עם שיטות סטנדרטיות30. Cy, הזרמת שימושים היא כלי שימושי לניתוח של אוכלוסיות תאים החיסונית שונים של הטחול ואת בלוטות הלימפה ניקוז העור, כפי שתוארה בעבר30. בחירת השיטות האנליטיות תלויה בשאלת המחקר וצריכה להיחשב לפני התחלת הניסוי.

Figure 3
איור 3: ניתוח היסטולוגית של חדירת תאים דלקתיים במודל DMBA-הסברתי. הנציגה היסטולוגית מקטעים מתוך העור מוטבע על-ידי פרפין בדגם DMBA-הסברתי. מקטעי עור היו מוכתמים עם סמן מקרופאג F4/80 (חום). קנה מידה ברים = 200 μm. (א) רק כמה F4/80 מקרופאגים חיוביים שנראו בעור רגיל ולא מטופל. (ב) מקרופאג הסתננות ב דרמיס היה ברור בשלב מוקדם של קידום הסרטן, ב 2 שבועות 36 h לאחר מינהל הסברתי השני. כמו כן, היפרהפצה עוריות נראתה בשבועיים, כפי שמוצג על ידי העיבוי של האפידרמיס. (ג) עור לא הפפילומה ב 19 שבועות עדיין הראו חדירה יוצאת דופן של מקרופאגים. (ד) הצטברות חזקה של מקרופאגים נראו תחת הפפילומה ב דרמיס של dmba-הסברתי התייחסו בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DMBA-הסברתי-סרטן העור המושרה הוא אחד הדגמים הנפוצים ביותר של סרטן, כי הוא מאוד מאפשר ומספק מידע על התקדמות הגידול מפני חניכה ממאירות. מדידת תוצאת המפתח, היווצרות הפפילומה, היא בקלות ובאמינות כמותית. המודל מטפל הן בייזום הגידול (הישרדות ללא גידול) והתקדמות (מספרי גידול וגדלים) בו זמנית. המודל מתאים לחקר תרכובות שונות, כגון therapeutics פוטנציאליים, ואת ההשפעות של גנים בודדים על התקדמות הגידול בבעלי חיים מהונדסים גנטית. כאשר מיישמים את המודל עבור כל זן נתון, מומלץ ללמוד את הספרות הקיימת כדי להשיג מושג איך המתח מגיב במודל (למשל, כדי לגלות כמה מהר הפפילומה הראשון יופיע). כאשר משתמשים בעכברים מהונדסים גנטית, השימוש בסוג פראי התאומות מומלץ תמיד. השימוש בפקדים פוטנציאליים נוספים, כגון החלפת DMBA או הסברתי או שניהם על ידי אצטון, הוא במחלוקת מאוד, כי זה ידוע כי הסרת או DMBA או הסברתי או היפוך סדר הניהול שלהם מאוד סביר לגרום אינדוקציה של צמיחה הפפילומה34. כאשר חיוני ללמוד ייזום הגידול (כלומר, על ידי המינהל של DMBA בלבד), זה יכול להיות מושגת על ידי הקרבת בעלי החיים לאחר מינון DMBA. כאשר לומדים את ההשפעה של גן בודד בהגדרה הטרנסגניים או הסתרה, מומלץ לקחת דגימות מבעלי חיים לא מטופלות כדי לזהות הבדלים אפשריים שעשויים להתקיים לפני היווצרות הגידול בין מהונדסים גנטית זנים סוג פראי30,31.

למרות DMBA-הסברתי המודל הוא פשוט יחסית לניהול מבחינה טכנית, תזמון מדויק חיוני להצלחה. היישום של DMBA והיישום הרגיל של הסברתי הם קריטיים לפיתוח הגידול34. בדיקה שבועית זהירה של הפפילומה חיוני לאסוף את כל הנתונים. זה צריך להיות ציין כי טיפולים מסוימים או רקע גנטי עלול לגרום הפפילומה לצמוח ומאוחר להתכווץ או אפילו להיעלם30. לפעמים, נגעים אחרים שאינם סרטניים ו SCCs להתעורר. במקרה זה, בדיקה היסטולוגית של הנגע מומלץ. צעד קריטי נוסף הוא להבטיח כי הסברתי הוא מקדם הגידול היחיד. טראומה העור מעורר את הייצור של ציטוקינים שעשוייםלהשפיע על קידוםהגידול 2,34. לפיכך, הפציעתם האיגניים של העור במהלך הגילוח צריך להימנע, אגרסיבי, עכברים להילחם חייב להיות שוכנו בנפרד. בנוסף ללחימה, גם היבטים אחרים של רווחת בעלי חיים חשובים. ירידה במשקל, פרווה משעממת וסבוכה, התנהגות אדישות הם סימנים של אי נוחות. אי נוחות היא לא רק בעיה אתית, כי איזון אנרגיה שלילית מעכב את צמיחת הגידול34.

מודל DMBA-הסברתי מספק הזדמנות עבור שינויים רבים. מכיוון זנים מסוימים ידועים להיות רגישים יותר מאחרים, בחירה זהירה מאפשר תזמון הניסוי וכוונון הכמות והתדירות של הסברתי application18,35. המודל משמש בעיקר לפיתוח גידולים בעור, אבל היישום המקומי למערכת העיכול הוא אופציה36. בנוסף, גרסה שונה של המודל שימש לחקר התפתחות הגידול בקנה הנשימה37. בגלל התפתחות הגידול יכול להיות מוסדר עם dmba ויישומים הסברתי, המודל מאפשר ללמוד את התוצאות לאחר שינוי היבטים סביבתיים כגון דיאטה ו אחראי קצב38. על ידי הפרדת ייזום הגידול (DMBA) וקידום (הסברתי), המודל מאפשר ללמוד שני תהליכים באופן עצמאי. למשל, להקריב את העכברים לאחר טיפול dmba היתרי לימוד המנגנון של הטיפול או ההשפעה של גן של עניין בייזום הגידול2,34. כדי ללמוד את האירועים המוקדמים בייזום וקידום הגידול, בעלי חיים יכולים להיות מוקרבים בזמן מוקדם. לדוגמה, ניתן לאסוף דגימות זמן קצר לאחר המינהל השני הסברתי (לדוגמה 3 h, 12 h, 36 h, או 48 h לאחר)30,31. כדאי גם לציין כי DMBA קלאסי-הסברתי שני בשלב מודל קרצינופוגנזה ניתן לשנות באמצעות כימיקלים שונים או באמצעות הכימיקל "השלישי". אלה נבדקים על ידי אבל et al2.

מודל DMBA-הסברתי שימש במשך עשורים למטרות שונות34. זה כבר שימש ללמוד את ההשפעות של therapeutics שונים24,25,26 וגנים31,32,39,40 אבל גם ללמוד תזונה27, קצב אחראי38, ופיתוח של כלי אבחון41. כמו הטופס גידולים מן העור, המודל מספק הזדמנות ייחודית לאסוף דגימות רקמות הגידול בשלבים שונים של ההתקדמות21. כאשר מציגים סוכני כימונקיום חדשים או אימונומודולדוטורים, מומלץ לאסוף נתונים הראשון על איך להתאמץ הגיב במודל DMBA-הסברתי במחקרים קודמים. אם לא זמין, מחקר טרום ללא הסוכן הטיפולי הפוטנציאלי מומלץ לקבוע את העיתוי ואת מספר הפפילומה, כמו גם את השונות בפרמטרים אלה. נתונים קיימים ממחקרים שפורסמו עשויים גם לסייע לקבוע את המינון של המתחם נבדק24,27, אבל אם לא זמין, באמצעות דילול סדרתי של המתחם נבדק מאפשר להעריך את תגובת המינון של הסוכן למד25,26.

דלקת היא חיונית עבור tuמוריגנזה האדם, כפי שהוא מעורב בכל השלבים של התקדמות הגידול: את החניכה, את הקידום, ואת ההמרה ממאירות42,43. מודל סרטן העור המושרה כימית הוא מודל מונחה דלקת קרצינופוגנזה. תגובת ציטוקינים פרו-דלקתית וחדירה של תאים דלקתיים לעור המטופל כבר ניכרת בשלב המוקדם של המודל. התאים הראשונים החדירה הם נויטרופילים, ואחריו הצטברות של מקרופאגים, T תאים, וכו '30,31. תאים אלה ליצור מיקרוסביבה דלקתית בעור, ושיחה צולבת בין תאים דלקתיים ועוריות הוא יזם, המוביל לייצור של ציטוקינים, נוגדנים, ו פרוסטגלנדינים כי הכונן את ייזום הגידול וצמיחה באופן מקומי. כמו DMBA-הסברתי מודל הוא מודל מונחה דלקות, זה לא כולל כמה היבטים אחרים של סרטן קליני. למרות שידוע כי sccs בסופו של דבר עלול לגרום גרורות במודל dmba-הסברתי, רק חלק קטן של הפפילומה להתפתח sccs2,23. כתוצאה מכך, גרורות היא תכונה נדירה במודל DMBA-הסברתי, למרות כמה מניות מיושנות רגיש כגון CD-1 או SENCAR עשויים להיות סבירות מוגברת לפתח גרורות44. הופעתו של SCC נחשב לעתים קרובות בעיית רווחה בעלי חיים ולכן criterium נקודת קצה. לכן, למרות קיומה של גרורות במודל, כמה דגמים אחרים כגון השתלת או מודלים גנטית מהונדסים מתאימים יותר ללמוד גרורות45. מגבלה נוספת של המודל היא כי היא דורשת משטח ליישם את הכימיקלים. כך, לימוד התקדמות הסרטן באיבר פנימי מסוים הוא מחוץ לטווח של המודל.

עוד מודל משותף לסרטן העור הוא מודל קרינת UV46. המודל הוא דומה למודל DMBA-הסברתי כי אף אחד משני הדגמים האלה לא צריך השתלת תא או שינוי גנטי כדי לגרום לסרטן. ההבדל הבסיסי בין המודלים היא כי מודל קרינה UV גורם היווצרות אגרסיבי ה, בעוד תוצאת הגידול במודל DMBA-הסברתי הוא בדרך כלל הפפילומה שפיר. אם קרינת UV משולב עם יישום של קרצינוגנים כימיים או זנים העכבר עם רקע גנטי שעושה את המתח פגיע להתפתחות הסרטן, אפילו היווצרות מלנומה יכול להתרחש. המוטציות הנפוצות ביותר במודל קרינת UV להשבית את הגן p53, גן מדכא הגידול המכריע בבני אדם46, ואילו המוטציות הנפוצות ביותר במודל DMBA-הסברתי להפעיל את hras-גן23. קרינת UV גורם גם הדיכוי החיסוני46,47, אשר עשוי להיות גורם מייסד בעת לימוד ההיבטים של המערכת החיסונית. עם זאת, שני דגמים אלה פועלים גם בשילוב. קרינת UV יכול לשמש כסוכן קידום עם DMBA או כסוכן יוזם עם הסברתי46.

שאלה סבירה היא האם DMBA-הסברתי המודל מחקה סרטן האדם. חלק קטן של הפפילומה להתפתח SCCs. עם זאת, השלב הקדם-ממאיר של SCC האדם הוא הקררומטוזיס, והוא שונה מהיווצרות הפפילומה הנראה במודל. עדיין, היווצרות הפפילומה דומה המודל מזוהה אנשים בני אדם שטופלו מלנומה עם vemurafenib. זה מרמז כי התאים Hras מוטציה החיוניים עבור קרצינובגנזה במודל DMBA-הסברתי קיים גם על העור האנושי34. יתר על כן, הוא דיווח כי ספיגת של 2-deoxy 2-[18f]-fluoro-D-גלוקוז (18f-fdg) הפפילומה ו sccs מיקרופולשנית הוא גבוה יותר מאשר בעור המקיף אבל לא גבוה כמו sccs פולשני במלואו, המשקף את הדמיון של השלבים premalignant מאירים41. אם באמצעות מודל DMBA-הסברתי להערכת רעילות, צריך לזכור כי החזרה של חשיפה יש השפעה רבה על קידום הגידול34. לפחות חלק מהמנגנונים המולקולריים משותפים למודל ולעור האדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה הזאת ממומנת על ידי האקדמיה של פינלנד (מענקים 25013080481 ו 25013142041 (I.J.), 286377 ו 295814 (שוטרים), 287907 (טי ג'יי), פדאימיקי וקרן סקארי Sohlberg (שוטרים, טי-ג'יי), הקרן הרפואית הפינית (ט), מחקר המדינה התחרותית מימון של התחום אחריות מומחה של אוניברסיטת טמפרה החולים (הענקת 9V049 ו 9V049 (מוסמך), 9V049 ו 9V049 (טי ג'יי), מימון מחקר המדינה תחרותי של שטח אחריות מומחה של מעבדות Fimlab (גרנט X51409 (I.J.)), Tays הקרן לתמיכה (I.J., הבסיס, טי-ג'יי), קרן שחפת טמפרה (I.J., בסיס, טי-ג'יי), קרן התרבות הפינית (M.V.), קרן פאולו (ט), אגודת הסרטן של פינלנד (בסיס), וקרן אמיל אלטונין (ט).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill Starlab S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill Starlab S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Sigma D3254-100MG Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone Sigma 1000141011 Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g Piramal Critical Care Limited Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis Albert Kerlb GmbH GT421 For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter ZeoSys GmbH For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm Staples Business Advantage 60383 For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red VetTech Solutions Ltd AN045AR For sacrifice
Mekasoft Mekalasi 23008 Table cover
Mice (Balb/c JRj) Janvier labs Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj) Janvier labs Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera Panasonic
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Enzo BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G KERN & SOHN GmbH PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing VetTech Solutions Ltd AN044BX For sacrifice
RNAlater Qiagen 76104 For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul Sartorius LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul Sartorius LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Induction Box Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer Scintica instrumentation inc. For anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
  2. Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
  3. Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
  4. Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
  5. Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
  6. Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
  7. Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
  8. Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
  9. Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
  10. Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
  11. Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
  12. He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
  13. Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
  14. Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
  16. Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
  17. Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
  18. Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
  19. Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
  20. Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
  21. Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
  22. Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
  23. Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
  24. Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
  25. Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
  26. Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
  27. Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
  28. Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
  29. Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
  30. Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
  31. May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
  32. Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
  33. Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
  34. Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
  35. Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
  36. Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
  37. Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
  38. Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
  39. Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
  40. Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
  41. Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
  42. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
  43. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  44. Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
  45. Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  46. Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
  47. Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 154 סרטן העור כימית קרצינונוספגנזה מוטגן מקדם DMBA-הסברתי הפפילומה אנגיוגנזה דלקת גידול התפשטות
מודל מסרטן העור המושרה כימי באמצעות דימתילבנץ [a] פחם ו-12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (DMBA-הסברתי)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M., Pemmari, T., … More

Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. H. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter