Summary
제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.
Abstract
장 상피는 병원성 미생물및 독소와 같은 발광 체질이 신체의 나머지 부분으로 들어가는 것을 방지하는 장벽 역할을합니다. 상피 장벽 기능은 장 상피 세포의 무결성을 필요로한다. 상피 세포 증식 장벽을 형성 하는 세포의 지속적인 층을 유지 하는 동안, 상피 손상 장벽 기능 장애에 이르게. 그 결과, 발광 내용물제한없는 통로를 통해 장 장벽을 가로 질러 수 있습니다. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환과 같은 많은 장 질환과 관련이 있습니다. 고립 된 마우스 장 지하실배양 및 창 자-villus 같은 구조로 유지 될 수 있습니다., 장 오르가노이드 또는 "엔터 로이드"라고. 엔터로이드는 시험관 내에서 장 상피 세포의 증식 및 세포 사멸을 연구하는 데 이상적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 배양된 장체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화하는 간단한 방법을 기술한다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 및 프로피듐 요오드화물은 장신구의 증식 및 죽은 세포에 라벨을 붙이기 위해 사용되며, 증식 및 죽은 세포의 비율은 유세포측정에 의해 분석됩니다. 이것은 장 상피 세포 증식 및 세포 생존에 대한 약물 치료의 효과를 테스트하는 유용한 도구입니다.
Introduction
장 상피 세포의 기본 기능은 병원성 박테리아 및 독소와 같은 발광 내용물의 진입을 보호하는 것입니다1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해, 장줄기세포는 연속적으로 증식하고, 장세포 및 분비세포를 포함한 다양한 상피세포로 분화하며, 이는 단단한 연결을 형성하여 장벽을 형성한다3. 장 상피 세포의 급속한 갱신은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸의 엄격한조정을필요로4,5. 감소된 세포 증식 또는 과도한 세포 사멸은 상피 손상 및 손상된 장벽 기능1,6. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환7,8과관련이 있습니다.
장 내 지하실을 배양하는 방법이 이전에 개발되었습니다. 이 기술을 사용하여, 고립 된 마우스 토굴은 구조와 같은 토굴 - 융모를 가지고 모든 장 상피 세포 계보를 포함하는 장 오르가노이드 (enteroids)로 성장,10. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)은 세포 증식 중에 복제를 받고 있는 DNA에서 티민(T)을 대체할 수 있는 티미딘 유사체이다. 증식 세포는 EdU 염색에 의해 신속하고 정확하게 표지될 수 있다. 프로피듐 요오드화물 (PI)는 이중 가닥 DNA로 삽입시 붉은 형광을 방출하는 에티듐 브로마이드의 유사체입니다. PI는 손상된 세포막을 통해서만 통과하기 때문에 죽은 세포를 구체적으로 감지합니다.
이 프로토콜에서는 먼저 무린 소장으로부터 토굴을 분리한 다음 시험관내 엔터로이드로 배양하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 EdU 및 PI 통합 및 유세포 분석에 의한 장신구의 증식 및 죽은 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 수코 대학의 케임브리지 수다 게놈 자원 센터 (CAM-SU)의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 장 오르가노이드 분리 및 문화
- 장 지하실과 장 내 문화의 격리
- CO2 흡입으로 8주된 야생형 마우스를 안락사시. 티슈 집게와 미세 홍채 가위를 사용하여 약 8cm의 장틀을 해부하십시오.
- 약 40 mL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)와 함께 주입식 바늘을 사용하여 주사기를 사용하여 씻어 낸 다음 가위로 세로로 자르고 장틀을 엽니다.
- 작은 (0.5-1.0 cm) 조각으로 장수를 잘라. 멸균 된 얼음 차가운 DPBS 5 mL에 15 mL 원추형 튜브에 넣고 얼음에 5 분 동안 바위를 놓습니다.
- 파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 10mL의 콜드 버퍼 1(DPBS의 2mM EDTA)으로 교체합니다. 얼음에 30 분 동안 바위.
- 파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 1을 흡인하고 10 mL의 콜드 버퍼 2 (54.9 mM D-소르비톨, DPBS에서 43.4 mM 자당)로 교체하십시오. 손으로 2-3 분 동안 흔들어주세요 (~80 쉐이크 / 분).
- 흔들은 후 버퍼 2 내용물의 20 μL 방울을 가지고 현미경으로 검사하십시오.
- 70 μm 멸균 셀 스트레이너로 2개의 내용을 필터한 다음 50 mL 원엽 튜브로 여과된 버퍼를 수집합니다.
- 파이펫 20 μL의 여과액을 슬라이드 상에 토굴을 계산한다. 1.1.7 단계에서 충분한 양의 버퍼 2를 전송하여 ~ 500 개의 토굴 /well이 있는지 확인하십시오.
- 4 °C에서 10 분 동안 150 x g에서 아래로 돌입니다. 회전이 끝나면 상월체를 조심스럽게 흡인하십시오.
- 지하실 멤브레인 매트릭스(예: 500개 토굴당)의 50 μL(예: Matrigel)에서 토굴을 일시 중단하고, 파이펫을 위아래로(기포를 피하기 위해 조심하다) 한 웰 플레이트의 중앙에 50 μL 의 액적을 놓습니다. 지하 멤브레인 매트릭스를 중합하기 위해 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 중합 30 분 후, 조심스럽게 미니 구트 매체의 600 μL을 추가 (고급 덜베코의 수정 독수리 매체 [DMEM]/F12, 2 mM L-알라닌 - L-글루타민, 펜 / 스트렙 [100 단위 / mL], 10 mM 헤페, N2 보충 [1:100], B27 보충 [1:50] 표피 성장 인자 [EGF; 50 ng/mL], 노긴 [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], 및 Y27632 [10μM]) 각각의 잘, 다음 Cc에 반환. 매일 현미경으로 관찰하고 2-3 일마다 미디어를 변경하십시오.
- 엔터로이드 패시징
참고 : 긴 문화의 경우, 엔터로이드는 거의 매주 분할해야합니다.- 엔터로이드를 통과하려면 조직 배양판을 얼음 위에 놓습니다. 미디어를 흡인하고 각 우물에 1 mL의 차가운 DPBS를 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 위아래로 파이펫을 피펫으로 만드실 수 있습니다.
- 1 mL 인슐린 주사기 (27 G)를 통해 15 mL 원엽 튜브로 한 번 위아래로 전달하십시오. 4 °C에서 150 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하십시오.
- 파이펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다. 지하 멤브레인 매트릭스/웰의 50 μL에서 다시 일시 중단하십시오.
- 37°C 인큐베이터에 플레이트를 30분 동안 놓고 지하 막 매트릭스가 중합되도록 합니다. ENR 용지(미니구트 매, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin)로 각 웰을 오버레이한 다음 플레이트를 인큐베이터로 되감습니다.
2. 엔테로이드에서 EdU 양성 세포의 유동 세포 분석
참고: 그림 1은 엔터노이드에서 EdU 양성 세포의 유세포 분석 워크플로우를 보여줍니다.
- EdU를 가진 장체의 인큐베이션
- 5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.
- 대조군(치료되지 않은 엔터노이드) 및 실험군(5 ng/mL 인터류키친 22[IL-22])으로 처리된 엔터노이드)를 설정한다. 각 그룹에 대해 적어도 세 개의 복제를 준비합니다.
- ENR 배지에 EdU를 첨가하여 50 μM의 농도로 EdU 배지를 준비시다. 600 μL의 EdU 배지를 각 웰에 넣고 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 EdU 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.
- 지하 멤브레인 매트릭스에서 엔터로이드 수확
- 파이펫 컨트롤러를 사용하여 EdU 매체를 흡인하고 DPBS로 1x를 세척합니다. DPBS 1mL를 추가합니다.
- 단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 P1000 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하십시오. 15 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 아래로 돌립니다.
- 500 μL의 세포 해리 효소(재료 표)를넣고 37 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. P200 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하여 엔터노이드를 단일 셀로 분해합니다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 3mL를 추가하고 P1000 파이펫 팁으로 반복적으로 파이펫을 추가합니다.
- 300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한 매체를 흡인합니다. DPBS의 1 mL로 셀을 다시 일시 중단합니다.
- 세포의 고정 및 투과
- 셀 서스펜션을 1.5 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)의 1mL로 세포를 다시 일시 중단하고, 실온(RT)에서 15분 동안 고정하고, 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
- 0.5 % 요온 계면 활성제의 1 mL로 세포를 다시 일시 중단하십시오. RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한을 흡인합니다. DPBS로 1x를 씻고 스핀다운하여 상류를 제거합니다.
- EdU 검출
- 사전에 각 구성 요소에 대한 재고 솔루션을 준비 : 1) 알렉사 플루오 아지드의 작업 솔루션, 2) 1 x EdU 반응 버퍼의 작동 솔루션, 3) EdU 버퍼 첨가제의 10 배 재고 솔루션.
- 10x 용액을 탈이온수에서 1:10희석하여 1x EdU 완충첨가제를 준비한다. 이 솔루션을 신선하게 준비합니다.
- 표 1에따라 반응 칵테일을 준비한다.
참고: 표에 나열된 순서대로 재료를 추가합니다. 반작용 칵테일을 준비 후 15분 이내에 사용하십시오. - 각 1.5 mL 튜브에 반응 칵테일 100 μL을 추가합니다. 세포를 다시 일시 중단하고 빛으로부터 보호하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 파이펫 팁으로 반응 용액을 부드럽게 흡인합니다.
- 각 튜브에 0.5% 난오계면활성제 를 추가하여 RT. Centrifuge에서 1x를 5분 동안 300 x g로 세척하고, 피펫 팁으로 상월제를 부드럽게 흡인하고, DPBS 의 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 유세포분석에 의한 세포 분석
- 40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링 한 다음 15 mL 원엽 튜브로 필터링 된 세포를 수집합니다. 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다.
참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다. - 유세포 분석 분석을 위해 적절한 채널(EdU 키트의 Alexa Fluor azide 의 유형에 따라 여기, 빨간색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.
- 게이팅 전략
- FSC-A(x축) 대 SSC-A(y축) 의사 색 플롯을 그리고 전압을 조정하여 대부분의 셀을 도트 맵의 가시 범위에 분산합니다. 셀 모집단(R1)을 선택하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 셀 파편을 제외합니다.
- R1 셀 모집단에서 FSC-A(x축) 대를 설정합니다. FSC-H(y축) 의사색 플롯을 설정하고, 게이트를 설정하여 단일 셀(R2)을 선택하여 셀 덩어리를 배제한다.
- R2 세포 집단에서 형광 강도(x축) 대를 설정합니다. 셀 번호(y축) 플롯을 사용하고 음수 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정합니다. 형광 신호의 영역은 양성 세포 영역(R3)이다. 실험군과 대조군 사이의 EdU 양성 세포(R3)의 비율을 비교한다.
- 40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링 한 다음 15 mL 원엽 튜브로 필터링 된 세포를 수집합니다. 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다.
3. 엔테로이드의 PI 양성 세포의 유동 세포 분석
참고: 그림 2는 엔터노이드의 PI 양성 세포의 유세포분석 워크플로우를 보여줍니다.
- PI를 가진 장신구세포의 배양
- 5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.
- 대조군(미처리) 및 실험군(IL-22 처리)을 설정하고, 각 그룹에 대해 적어도 3개의 복제를 사용한다.
- ENR 배지에 PI를 추가하여 3 μM의 농도로 PI 배지를 준비합니다.
- 각 웰에 600 μL의 PI 배지를 넣고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 PI 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.
- 2.2.1-2.2.5 단계 다음 지하 막 매트릭스에서 엔터로이드를 수확하십시오.
- 유세포분석에 의한 세포 분석
- 40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링하고 15 mL 원엽 튜브로 여과 된 세포를 수집합니다.
- 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다.
참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다. - 유세포분석해석을 위해 적절한 채널(여기, 적색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.
- 섹션 2.5.3에 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 사용합니다.
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Representative Results
소장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장내 세균으로 분리되고 배양되었다. 엔터로이드는 격리 후 2 일 싹을 형성하기 시작했다. 6 일째에 엔터로이드는 루멘에 많은 파편 (죽은 세포)이많은 싹을 가지고 있었습니다. 엔터로이드는 이 단계에서 통과될 준비가되었다(그림 3).
수많은 연구에 따르면 염증성 사이토카인은 장 상피 항상성의 유지에 필수적입니다. 염증성 사이토카인의 비정상적인 발현은 염증성 장 질환의 발생과 밀접한 관련이 있다11. 예를 들면, 우리의 이전 연구 결과는 IL-22가 수송 증폭 세포의 증식을 승진시키는 그러나 또한 Lgr5+ 줄기 세포12를고갈한다는 것을 보여주었습니다.
엔터로이드는 3일 동안 IL-22로 처리되었고, 그 후 합성 DNA를 세포 증식을 나타내기 위해 EdU로 표지하였다. IL-22-처리된 엔터노이드는EdU+ 세포의 증가수를 나타냈다(도4A). IL-22는 유세포측정에 의해 분석된 바와 같이 40.1%에서 83.5%로 증식세포를 증가하였다(도4B). IL-22 치료는 또한 PI 염색으로 표시된 장체에서 세포 사멸을 증가시하였다(도5A). IL-22는 유세포측정에 의해 분석된 바와 같이 죽은 세포를 4.9%에서 16.2%로 증가하였다(도5B).
그림 1: 장용골에서 EdU 양성 세포의 유세포 분석워크 도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 엔테로이드에서 의 PI 양성 세포의 유세포 분석워크 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 2, 4 및 6일 후 토굴 후 격리에서 엔터로이드의 브라이트필드 이미지. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: IL-22는 엔테로이드 증식을 증가시킨다. (a)엔테로이드는 3일 동안 IL-22(5 ng/mL)를 없이 배지로 배양하고 1시간 동안 EdU(적색)로 배양하였다. (B)(왼쪽) 또는 (오른쪽) IL-22없이 배양 된 엔터노이드의 유동 세포 분석 데이터. 데이터는 세 가지 개별 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: IL-22는 장체에서 세포 사멸을 촉진한다. (A)엔테로이드를 3일 동안 IL-22(5 ng/mL)로 배지로 배양하고 프로피듐 요오드화물(적색)으로 염색하였다. 배율 막대 = 100 μm. (B)(왼쪽) 또는 (오른쪽) IL-22없이 배양 된 엔터노이드의 유동 세포 분석 데이터. 데이터는 세 가지 개별 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 반응 성분 | 24 웰 플레이트의 우물 수 | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x 반응 버퍼 | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1.72 μL | 4.3 μL |
| 쿠소4 | 4 μL | 8 μL | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| 알렉사 플루오르 아지드 | 0.25 μL | 0.5 μL | 1.25 μL | 2.5 μL | 5 μL | 12.5 μL |
| 반응 버퍼 첨가제 | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| 총 볼륨 | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL | 5 μL |
| 참고: 표에 나열된 순서대로 재료를 추가합니다. | ||||||
표 1: EdU 반응 칵테일.
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Discussion
이 프로토콜은 유세포측정에 의한 장내 EdU-및 PI 양성 세포의 시험관 내 및 정량화 및 엔테로이드의 배양에 필요한 단계를 상세히 설명한다. 이 전략에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, EdU 라벨링은 장체에서 증식 세포를 검출하는 데 사용됩니다. 기존의 BrdU 분석법에 비해 EdU 라벨링 방법은 더 빠르고 민감하며 더 정확합니다. EdU는 세포 분열 도중 DNA 종합에 있는 티민을 대체하는 티민 (T)와 아주 유사합니다. BrdU 항체에 비해, EdU는 세포 내로 확산하기 쉽고, EdU의 검출은 DNA 변성 및 항원 항체 반응을 필요로 하지 않는다. 둘째, 유세포 분석 분석은 장용체내의 증식(EdU+)및 죽은(PI+) 세포를 신속하고 정확하게 정량화할 수 있다.
전체 절차를 성공적으로 수행하기 위해 고려해야 할 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 충분한 조건 하에서 장체를 배양하는 것이 중요하다. 잘 자란 엔터노이드는 증식 세포를 포함하는 싹을 많이 가져야합니다. 둘째, 적시에 엔터로이드를 분할하는 것이 중요합니다. 루멘에 축적 된 파편에는 PI로 염색 할 수있는 죽은 세포가 포함되어 있습니다. 이는 다음과 같은 유세포 분석분석에 해롭다. 셋째, 여러 단계 (즉, 세포 염색, 세포 고정, 막 파열 및 원심분리)로 인해 시술 중에 세포가 쉽게 손실 될 수 있습니다. 따라서 충분한 수의 엔테로이드를 수집하는 것이 중요합니다. 고정하기 전에 엔터로이드의 2−3 웰 (24 웰 플레이트)을 결합하는 것이 중요합니다. 마지막으로, EdU를 검출하기 위해 완충액에 성분을 추가하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 반응이 최적으로 진행되지 않을 것이다.
요약하면, 프로토콜은 시험관 내 마우스 장용체의 배양 단계및 유세포에 의한 증식 및 죽은 세포의 정량화를 상세히 한다. 엔터로이드는 질병 모델링 및 치료 약물 발견에 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 엔터노이드 배양 모델에서 염증성 사이토카인, 병원체 및 약물이 세포 증식 및 세포 생존에 미치는 영향을 탐구하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (31971062, 31900322, 31600322), 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20190043, BK20180838), 제약 생명 공학의 국가 핵심 연구소의 연구 기금, 난징 대학 (KF-GN-202004). 중국 장쑤 고등 교육 기관의 자연 과학 재단 (19KJB320003), 소주 시의 생계 및 기술 프로그램 (SYS2019030), 그리고 장쑤성 대학 졸업생을위한 연구 혁신 프로그램 (KYCX19-1981) . 이 작품은 또한 소차우 대학의 당학장에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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