Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60501
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1, 1, 1
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

Abstract

אפיתל המעי משמש מחסום המונע תוכן הלומיאלי, כגון מיקרוביוטה פתוגניים ורעלים, מלהיכנס לשאר הגוף. תפקוד המכשול אפיתל דורש שלמות של תאים אפיתל המעי. בעוד התפשטות התא אפיתל שומרת על שכבה רציפה של תאים המהווה מחסום, נזק אפיתל מוביל לתפקוד המכשול. כתוצאה מכך, תוכן הלומיאל יכול לחצות את מחסום המעי דרך מסלול בלתי מוגבל. התפקוד של מחסום המעיים נקשר למחלות מעיים רבות, כגון מחלות מעי דלקתיות. מבודד עכבר מעיים קריפטים יכול להיות תרבותי ומתוחזק כמו קריפטה-villus מבנים כמו, אשר מכונים אורגנואידים מעיים או "enteroids". בידור הם אידיאליים ללמוד את התפשטות ומוות התאים של תאי אפיתל המעי בתוך מבחנה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לכמת את מספר התאים המתרבים והמתים בידור תרבותי. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ו propidium יודיד משמשים לתווית תאים מתרבים ומתים ב-enteroids, ושיעור של תאים מתרבים ומתים מנותח לאחר מכן על ידי מנתחים cy, לנסות. זהו כלי שימושי כדי לבדוק את ההשפעות של טיפול תרופתי על התפשטות תא אפיתל המעי הישרדות התא.

Introduction

פונקציה יסודית של תאים אפיתל המעי היא להגן על כניסת תוכן הלומיאל כגון חיידקים פתוגניים ורעלים1,2. כדי לבצע פונקציה כזו, תאי גזע המעיים ברציפות מתרבים ולהבדיל למגוון של תאים אפיתל, כולל בידור תאים הפרשה, אשר יוצרים מכשול על ידי יצירת קשרים הדוקים3. התחדשות מהירה של תאים אפיתל המעי דורש תיאום מחמיר של התפשטות התא, בידול התא, ואת המוות התאים4,5. הפצת תאים מופחתת או מוות מופרז של תאים מוביל נזק אפיתל ופגיעה בתפקוד המכשול1,6. תפקוד של מכשול המעיים שויך מחלות מעיים דלקתיות7,8.

שיטה לקריפטטים מעיים תרבותי פותחה בעבר. באמצעות טכניקה זו, עכבר מבודד קריפטים לגדול לתוך מעיים אורגנואידים (enteroids), אשר יש קריפטה-villus כמו מבנים ומכילים את כל השושלת האפיתל המעי תא9,10. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) הוא אנלוגי תימידין כי הוא מסוגל להחליף תימין (T) ב-DNA כי עובר שכפול במהלך הפצת תאים. התאים הניתנים להתרבות יכולים להיות מסומנים במהירות ובדייקנות על-ידי EdU מכתים. Propidium יודיד (PI) הוא אנלוגי של אתידיום ברומיד המשחרר את הזריחה האדומה בעת הכניסה לתוך ה-DNA התקוע כפול. PI מזהה באופן ספציפי תאים מתים, שכן הוא עובר רק דרך קרום התא ניזוק.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד לבודד קריפטטים מן המעי הקטן מורטין ואז לתרבות אותם כמו בידור בתוך מבחנה. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את התאים המתרבים והמתים ב-enteroids על ידי EdU ו-PI התאגדות וזרימה cy, לנסות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של קיימברידג '-Suda מרכז משאבים גנומית (CAM-SU) באוניברסיטת Soochow.

1. בידוד ותרבות אורגאיד מעיים

  1. בידוד של קריפטטים מעיים ותרבות בידור
    1. המתת חסד בעכבר בן 8 שבועות בסוג פראי עם שאיפת CO2 . השתמש מלקחיים רקמות ומספריים קשתית עדין כדי לנתח כ 8 ס מ של ileum.
    2. ריקון החוצה באמצעות מזרק עם gavage האכלה מחט עם כ 40 מ ל של מלוחים הקרח קר של Dulbecco של המלח (DPBS), ואז לחתוך לאורכו עם מספריים ולפתוח את ileum.
    3. חותכים את המעי העקום לחתיכות קטנות (0.5-1.0 ס מ). מניחים את החלקים ב 5 מ ל של DPBS קר קירור קרח ב 15 מ"ל שפופרת חרוט, ואז סלע עבור 5 דקות על הקרח.
    4. השתמש בבקר הצינורות כדי לבשל את DPBS ולהחליף אותו עם 10 מ ל של מאגר קר 1 (2mm EDTA ב DPBS). . רוק ל -30 דקות על הקרח
    5. השתמש בבקר הפיפטה כדי לבשל מאגר 1 ולהחליף עם 10 מ ל של מאגר קר 2 (54.9 מ"מ D-sorbitol, 43.4 mM סוכות ב DPBS). נענעי עבור 2-3 דקות ביד (~ 80 שייקים/דקות).
    6. קח את droplet 20 μL של מאגר 2 תוכן לאחר טלטול ולבדוק תחת מיקרוסקופ.
    7. מסנן מאגר 2 תוכן עם מסננת תא 70 יקרומטר מעוקר, ולאחר מכן לאסוף את המאגר המסונן עם צינור 50 mL חרוט.
    8. פיפטה 20 μl של פילטרט על השקופית כדי לספור את הקריפטטים. העבר נפח מספיק של מאגר 2 משלב 1.1.7 כדי להבטיח כי יש ~ 500 הקריפטטים/טוב.
    9. ספין למטה ב 150 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. , ברגע שמסתובב מסתובב. הוא מזהם את הסופרנטאנט בזהירות
    10. להשעות קריפטטים ב 50 μL של מטריצה מרתף ממברנה (g., מטריצות) לכל 500 קריפטטים, פיפטה למעלה ולמטה (להיות זהיר כדי למנוע בועות), ואז למקם 50 μL droplet של מטריצה קרום מרתף/קריפטה לערבב במרכז של אחד טוב בצלחת 24. מודדת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפולימלמטריקס מטריצות קרום מרתף.
    11. לאחר 30 דקות של פולימוניזציה, בקפידה להוסיף 600 μL של מדיה מיניגוט (מתקדם בינונית הנשר המתוקן של החברה [DMEM]/F12, 2 מ"מ L-alanine-L-גלוטמין, עט/דלקת [100 יחידות/mL], 10 מ"מ Hepes, תוספת N2 [1:100], B27 תוספת [1:50] עם פקטור גידול עוריות [EGF; 50 ng/mL], הראש [100 ng/mL], R-החתן [500 ng/mL], ו Y27632 [10 μM]) לכל באר, ואז להחזיר את הצלחת לחממה 37 ° c. שימו לב תחת מיקרוסקופ כל יום, והחליפו את התקשורת כל שניים-שלושה ימים.
  2. הבעת ההתיישנות
    הערה: בתרבויות ארוכות יש לפצל את המרכנואידים בקירוב בכל שבוע.
    1. , כדי לעבור את המרכנואידים. הניחו את צלחת תרבות הרקמה על הקרח ולהוסיף 1 מ ל של DPBS קר לכל טוב. השתמש בטיפ P1000 לפיפטה למעלה ולמטה עד שלא יישארו נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף.
    2. מעבר למעלה ולמטה פעם אחת באמצעות מזרק אינסולין 1 מ ל (27 גר') ולתוך צינורית חרוט של 15 מ ל. ספין למטה עבור 5 דקות ב 150 x g ב 4 ° c.
    3. השתמש בפיפטה כדי להסיר את DPBS. השהה מחדש ב-50 μL של מטריצת קרום המרתף/ובכן.
    4. מניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום מרתף פולימלזציה. כיסוי כל טוב עם 600 μL של מדיה ENR (מיניגוט מדיה, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL ראש, 500 ng/mL R-החתן), ואז להחזיר את הצלחת לחממה.

2. הזרימה Cy, ניתוח של תאים EdU-חיוביים ב-Enteroids

הערה: איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור ניתוח cy, המנסה של תאים של EdU-חיוביים ב-enteroids.

  1. דגירה של בידור עם EdU
    1. לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.
    2. הגדר את קבוצת הביקורת (בידור לא מטופל) ואת הקבוצה הניסיונית (בידור שטופלו עם 5 ng/mL באינטרלוקין 22 [IL-22]). הכינו לפחות שלוש משכפל עבור כל קבוצה.
    3. הוסף את EdU למדיום ENR כדי להכין את מדיום EdU עם ריכוז של 50 μM. הוסף 600 μL של EdU מדיום לכל טוב ומארג עבור 2 h בחממה 37 ° c. הגדר באר אחת של בידור ללא הטיפול ב-EdU כפקד שלילי לחיסור הרקע.
  2. קציר של בידור מתוך מטריצת קרום המרתף
    1. השתמש בבקר פיפטה לאספירין בינונית EdU ולשטוף 1x עם DPBS. הוסף 1 מ ל של DPBS.
    2. השתמש בP1000 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה עד שאין נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף יישארו. העבר לצינור 15 מ"ל ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    3. הוסף 500 μL של אנזימי תא-דיסוציאציה (טבלת חומרים) ו-דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° c. השתמש בP200 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את הenteroids תאים בודדים.
    4. הוסף 3 מ ל של מדיום DMEM בינונית המכילה 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו פיפטה שוב ושוב עם טיפ P1000.
    5. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את המדיום supernatant. השהה מחדש את התאים באמצעות 1 מ ל של DPBS.
  3. קיבעון וחדירות של תאים
    1. העבר את ההשעיה התא לצינור 1.5 mL, ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות, ולהיפטר supernatant.
    2. להשעות את התאים עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית), לתקן עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. מרוב הסופרנטאנט עם טיפ פיפטה, לשטוף 1X עם dpbs, ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.
    3. השהה מחדש תאים עם 1 מ ל של 0.5% nonionic. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
    4. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט. שטוף 1x עם DPBS ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.
  4. זיהוי של EdU
    1. הכנת פתרונות מניות עבור כל רכיב מראש: 1) פתרון עבודה של מאגר התגובות אלקסה Fluor, 2) פתרון עבודה של 1 x EdU התגובה במאגר, ו 3) מניות 10x פתרון של התוסף מאגר של EdU.
    2. הכינו את תוסף המאגר של 1x EdU על-ידי דילול הפתרון ה1:10 של 10x במים מאוהים. . הכינו את התמיסה הזו רעננה
    3. הכינו קוקטייל תגובה לפי שולחן 1.
      הערה: הוסף את המרכיבים בסדר המפורט בטבלה. השתמש בקוקטייל התגובה בתוך 15 דקות של הכנה.
    4. הוסף 100 μL של קוקטיילים התגובה לכל שפופרת 1.5 mL. להשעות מחדש את התאים, להגן מפני אור, הדגירה עבור 30 דקות ב RT.
    5. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה בעדינות.
    6. הוסף 0.5% nonionic חומרים פעילי שטח החדירה לצינור כל לשטוף 1 x ב RT. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות, מטפי את supernatant עם טיפ בעדינות, ולהשעות מחדש את התאים 1 מ ל של dpbs.
  5. ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה
    1. סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר, ולאחר מכן אסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ"ל. בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי.
      הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.
    2. בחר את הערוץ המתאים (בהתאם לסוג של אלקסה fluor אזיד ב-EdU kit; כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) עבור הניתוח cy, מנסה להזרים.
    3. אסטרטגיית מדון
      1. ציירו מזימה מדומה של FSC-A (ציר x) לעומת מדינת מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-התחתית (ציר y) והפיצו את רוב התאים לטווח הגלוי של מפת הנקודות על-ידי התאמת המתח. בחר את אוכלוסיית התא (R1) והוצא את הריסות התאים בפינה השמאלית התחתונה.
      2. מאוכלוסיית התאים R1, צור FSC-A (ציר x) vs. מגרש צבע מדומה FSC-H (ציר y) והגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים (R2) כדי לכלול את האפשרות של קיבוץ תאים.
      3. מאוכלוסיית התאים R2, צור את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (ציר x) לעומת מספר תא (ציר y), והשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלורסנט הוא אזור תא חיובי (R3). השוואת היחס של תאים EdU-חיוביים (R3) בין קבוצות הניסוי והבקרה.

3. הזרמת Cy, ניתוח של תאי PI-חיוביים במרכנואידים

הערה: איור 2 מציג את זרימת העבודה עבור הניתוח cy, מנסה הזרימה של תאים PI-חיוביים ב-enteroids.

  1. דגירה של תאים enteroid עם PI
    1. לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.
    2. הגדר את קבוצת הפקדים (לא מטופלת) והקבוצה הניסיונית (IL-22 שטופלו), תוך שימוש בשלוש משכפל עבור כל קבוצה לפחות.
    3. הוסף PI למדיום ENR כדי להכין מדיום PI עם ריכוז של 3 μM.
    4. הוסף 600 μL של מדיום PI לכל טוב ומארג עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. להגדיר היטב אחד של בידור ללא טיפול PI כפקד שלילי לחיסור הרקע.
  2. קציר בידור מתוך מטריקס קרום המרתף בעקבות צעדים 2.2.1-2.2.5.
  3. ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה
    1. סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר ואסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ ל.
    2. בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי.
      הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.
    3. בחר את הערוץ המתאים (כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) לצורך הזרמת הניתוח cy,.
    4. השתמש באותה אסטרטגית העליה כמתואר בסעיף 2.5.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קריפטטים מעיים קטנים היו מבודדים ומתורבתים כמו בידור בתוך מטריצת קרום המרתף. בידור החל ליצור ניצנים 2 ימים לאחר בידוד. ביום 6, enteroids היו ניצנים רבים עם המון פסולת (תאים מתים) ב לומן. המונונואידים היו מוכנים להיות בשלב זה (איור 3).

מחקרים רבים הראו כי ציטוקינים דלקתיים חיוניים לתחזוקת הומאוסטזיס אפיתל המעי. ביטוי חריג של ציטוקינים דלקתיים קשורה היטב עם התרחשות של מחלות המעי דלקתיות11. למשל, המחקר הקודם שלנו הראה כי IL-22 מקדם התפשטות של מעבר-הגברה תאים, אבל גם לרוקן Lgr5+ תאי גזע12.

בידור טופלו ב-IL-22 במשך 3 ימים, ולאחר מכן ה-DNA הסינתטי היה מתויג עם EdU כדי לציין הפצת תאים. Enteroids שטופלו על-ידי IL-22 הציג מספר גדל של EdU+ תאים (איור 4א). IL-22 גדל מתרבים תאים מ 40.1% כדי 83.5% כפי שנותחו על ידי הזרימה cy, (איור 4B). הטיפול IL-22 גם הגביר את מוות התאים ב-enteroids, המצוין על ידי הצביעת PI (איור 5א). IL-22 מוגברת תאים מתים מ 4.9% כדי 16.2% כפי שנותחו על ידי זרימה cy, למשל (איור 5B).

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה עבור הניתוח cy, מנסה זרימה של תאי EdU-חיוביים ב-enteroids. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה עבור הניתוח cy, מנסה זרימה של תאים PI-חיוביים ב-enteroids. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ברייטפילד תמונות של enteroids ב 2, 4, ו 6 ימים לאחר קריפטה בידוד. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: IL-22 מגביר את התפשטות בידור. (א) enteroids היו מתורבתים בינונית ללא או עם IL-22 (5 Ng/mL) במשך 3 ימים ו-מודב עם EdU (אדום) עבור 1 h. סרגל סרגל = 100 μm. (ב) זרימה cy, מנסה נתונים מ-enteroids תרבותית ללא (משמאל) או עם (מימין) IL-22. נתונים מייצגים שלושה ניסויים נפרדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: IL-22 מקדם את מוות התאים ב-enteroids. (א) enteroids היו מתורבתים בינונית ללא או עם IL-22 (5 Ng/mL) במשך 3 ימים ומוכתם עם propidium יודיד (אדום). סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) זרימה cy, מנסה נתונים מ-enteroids תרבותית ללא (משמאל) או עם (מימין) IL-22. נתונים מייצגים שלושה ניסויים נפרדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מרכיבי תגובה מספר בארות של 24 צלחות לוחות
1 2 מיכל 5 10 20 50
1x מאגר תגובה 86 מיקרומטר 172 מיקרומטר 430 מיקרומטר 860 מיקרומטר 1.72 מיקרומטר 4.3 מיקרומטר
כיתה4 4 מיקרומטר 8 μL 20 μL 40 מיקרומטר 80 מיקרומטר 200 מיקרומטר
אלקסה פלואור עזידה 0.25 מיקרומטר 0.5 מיקרומטר 1.25 מיקרומטר 2.5 מיקרומטר 5 מיקרומטר 12.5 מיקרומטר
תוסף מאגר תגובות 10 מיקרומטר 20 μL 50 מיקרומטר 100 מיקרומטר 200 מיקרומטר 500 מיקרומטר
נפח כולל 100 מיקרומטר 200 מיקרומטר 500 מיקרומטר 1 ליטר 2 מיקרומטר 5 מיקרומטר
הערה: הוסף את המרכיבים בסדר המפורט בטבלה.

. קוקטייל התגובה בטבלה 1-EdU

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הנחוצים לתרבות של בידור באמצעות מבחנה וכימות של תאים של EdU ו-PI-חיוביים ב-enteroids על ידי הזרמת cy, try. יש מספר יתרונות של אסטרטגיה זו. ראשית, התוויות של EdU משמשות לזיהוי תאים מתרבים ב-enteroids. בהשוואה לשיטת BrdU המסורתית, שיטת התיוג של EdU היא מהירה יותר, רגישה יותר ומדויקת יותר. EdU דומה מאוד תימין (T), אשר מחליף תימין ב סינתזה DNA במהלך חלוקת התא. לעומת הנוגדן brdu, EdU קל יותר לפזר לתא, וזיהוי של EdU אינו דורש דנטורציה DNA ו אנטיגן נוגדן תגובה. שנית, הניתוח cy, מנסה הזרימה יכול במהירות ובדייקנות לכמת את המתרבים (EdU+) ומת (PI+) תאים ב-enteroids.

כדי לבצע בהצלחה את ההליך כולו, יש לשקול היבטים קריטיים. ראשית, חשוב לתרבות בידור בתנאים מספיקים. ובכן, בידור מגודלים צריך להיות הרבה ניצנים, אשר מכילים תאים מתרבים. שנית, חשוב לפצל בידור בזמן מתוזמן. פסולת שהצטברו לומן מכיל תאים מתים, אשר ניתן לוכתם עם PI. הדבר מזיק לניתוח הזרימה הבאה של סייצינסה. שלישית, בגלל השלבים המרובים (כלומר, כתמים תא, קיבוע התא, קרע ממברנה, ו צנטריפוגה), תאים ניתן לאבד בקלות במהלך ההליך. לפיכך, חשוב לאסוף מספר מספיק של בידור. חשוב לשלב 2-3 בארות (בצלחת של 24 שעות) של בידור לפני הקיבעון. לבסוף, זה קריטי להוסיף מרכיבים למאגר כדי לזהות EdU, אחרת התגובה לא תמשיך באופן אופטימלי.

לסיכום, הפרוטוקול פרטים צעדים עבור culturing של בידור העכבר בתוך מבחנה וכימות של תאים מתרבים ומתים על ידי הזרמת cy, לנסות. Enteroids הם כלים שימושיים לדגמי מחלות וגילוי תרופות טיפוליות. פרוטוקול זה מסייע לחקר ההשפעות של ציטוקינים דלקתיים, פתוגן, ותרופות על התפשטות התא והישרדות התא במודלים התרבות enteroid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31971062, 31900326, ו 31601022), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (BK20190043, BK20180838), קרן מחקר של המעבדה מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה התרופות, אוניברסיטת נאנג'ינג (KF-GN-202004). הקרן המדע הטבעי של ג'יאנגסו מוסדות ההשכלה הגבוהה של סין (19KJB320003), תוכנית פרנסה וטכנולוגיה של סאזהאו City (SYS2019030), ואת תוכנית חדשנות מחקר עבור בוגרי המכללה של מחוז ג'יאנגסו (KYCX19-1981) . עבודה זו נתמכת גם על ידי טאנג המלומד של אוניברסיטת Soochow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Corning 430791
22 G gavage needle VWR 20068-608
24-well plate Nunc 142475
40 mm sterile cell strainer BD 352340
50 ml centrifuge tube Corning 430829
70 mm sterile cell strainer BD 352350
Advanced DMEM/F-12 GIBCO 12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer Invitrogen A24863
B-27 Supplement GIBCO 17504044
Buffer 1 2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE) Life technologies 12605-010
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life technologies C10639
CO2 incubator Panasonic MCO-18AC
DPBS GIBCO 14190144
D-sorbitol BBI SB0491
EDTA BBI EB0185
ENR media Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
Fine Iris Scissors Tansoole 2037454
Fluorescence microscope Olympus FV1000
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061
Goat Serum Life technologies 16210-064
HDMEM Hyclone SH30243.01B
HEPES Sigma H4034
Matrigel Corning 356231
Minigut media Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement R&D AR009
Nonionic surfactant (Triton X) BBI TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm) Tansoole 2025785
Paraformaldehyde (PFA) sigma 158127-500g
Penn/Strep Invitrogen 15140-148
Phase contrast microscope Nikon TS1000
Propidium iodide Sigma P4170-25MG
Recombinant EGF PeproTech 315-09
Recombinant Mouse Noggin PeproTech 250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1 R&D 3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22 PeproTech 210-22-10
Sucrose BBI SB0498
Tissue Forceps Tansoole 2026704
Y-27632 2HC1 Selleck S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

Tags

ביולוגיה סוגיה 155 enteroids המעי לזרום cy התפשטות EdU propidium יודיד
קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H. S., Xu, S. F., Sheng, J. Y.,… More

Li, H. S., Xu, S. F., Sheng, J. Y., Jiang, Z. H., Wang, J., Ding, N., Wang, T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., He, W. Q., Xu, H., Zha, J. M. Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids. J. Vis. Exp. (155), e60501, doi:10.3791/60501 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter