Summary
Her har vi givet en metode til at opnå stabil omladning af kylling Eimeria parasitter ved nucleofecting sporozoitter eller anden generation merozoitter. Genetisk modificerede eimeriske parasitter, der udtrykker heterologe antigengene, kan anvendes som vaccinefremføringskøretøjer.
Abstract
Omladning er en teknisk proces, hvorigennem genetisk materiale, såsom DNA og dobbeltstrenget RNA, leveres til celler for at ændre genet af interesse. I øjeblikket er transgene teknologi ved at blive et uundværligt redskab til studiet af Eimeria, de forårsagende midler af coccidiose hos fjerkræ og husdyr. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af stabil transfektion i eimeriske parasitter: rensning og nuklerofection af sporozoitter eller anden generations merozoitter, og in vivo formering af transfundere parasitter. Ved hjælp af denne protokol opnåede vi omladning i flere arter af Eimeria. Tilsammen er nukleofection et nyttigt redskab til at lette genetisk manipulation i eimeriske parasitter.
Introduction
Eimeria spp. forårsager coccidiose, hvilket fører til betydelige økonomiske tab i husdyr- og fjerkræindustrien. Selv om anticoccidiale lægemidler, og til en vis grad, svækket anticoccidial vacciner, er blevet anvendt bredt til kontrol af coccidiose, der er stadig mangler med hensyn til deres resistens over for lægemidler, lægemiddelrester, og den potentielle spredning af vaccine stammer, der genvindeviencerul1. Med udviklingen af molekylærbiologi, omformning er blevet et vigtigt redskab til at studere genfunktioner, udvikle nye vacciner, og screening nye lægemiddelmål for Eimeria.
I de seneste årtier er omladning blevet anvendt med succes for apicomplexanske parasitter som Plasmodium og Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En undersøgelse, der anvender β-gal som reporter for omladningen i E. tenella, afprøvede et sådant arbejde i Eimeria7. Omladningen af E. tenella8,9, E. mitis10, og E. acervulina (Zhang et al., ikke offentliggjorte data) var en succes i kyllinger. For nylig opnåede vi transfection ved hjælp af merozoites af E. necatrix gennem nucleofection11.
Undersøgelser viste, at Eimeria, der udtrykker et heterolog antigen, har potentiale til at blive udviklet som en rekombinantvaccine, såsom dem, der udtrykker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kylling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Derfor beskriver denne protokol en nucleofection undersøgelse af Eimeria spp. hos kyllinger. Proceduren beskriver rensning af sporozoitter eller merozoitter, kerner med plasmid DNA, cloacal podning / intravenøs injektion og in vivo formering for at hjælpe forskere starter undersøgelser af transgene Eimeria parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kyllinger til alle dyreforsøg blev opstaldet og vedligeholdt i henhold til China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee retningslinjer og fulgte de internationale vejledende principper for biomedicinsk forskning, der involverer dyr. Forsøgene blev godkendt af Beijing administration udvalg af laboratoriedyr.
1. Udvinding og rensning af sporozoitter af Eimeria spp. (f.eks.
- Frigivelse af sporocyster
- Centrifuge 1 x 107sporulerede oocyster i kaliumdichromatopløsning (2,5%, m/v) ved 2.300 x g i 5 min. Vask dem med PBS (fosfatbufferopløsning) tre gange.
- Ophæng pillerne igen med 1 ml PBS og overføres til et 15 ml rør. Tilsæt en lige stor mængde glasperler (1 mm x 1 mm diameterområde) og sving oocystsuspensionen med en vortexmixer til at frigive sporocysterne.
- Overvåg frigivelsen af sporocyster ved mikroskopi hvert minut. Stop vortexing når mere end 90% af oocyster er brudt.
BEMÆRK: De fleste af oocysterne (såsom E. tenella, E. necatrixog E. acervulina) blev brudt efter 1 min brug af vortex mixeren. - Sporocyst suspensionen overføres til nye 1,5 ml rør og centrifuge ved 1.600 x g i 5 min.
- Ophæng bundfaldet igen med 1 ml 50% densitetsgradientopløsning, der kombineres i et 1,5 ml rør og centrifugerer ved 10.000 x g i 1 min.
BEMÆRK: For forløbssammensætningen for tæthed henvises til tabel 1. Densitetsgradienten er et silicabaseret kolloidt medium bestående af kolloide silicapartikler med en diameter på 15-30 nm (23 % w/w i vand), som er blevet belagt med polyvinylpyrrolidon (PVP).
- Frigivelse af sporozoitter
- Udsætningsbufferen til udsætningsstødning (tabel 1) og inkuberes i et vandbad på 42 °C igen i 40-60 minutter for at frigøre sporozoitterne. Stop med at inkubere, når mere end 90% af sporozoitterne frigives. Centrifugeret derefter ved 600 x g i 10 min.
BEMÆRK: Ryst rørene en gang hvert 5. - Udfæd snedningen igen med 1 ml 55% densitetsgradientopløsning og centrifuger ved 10.000 x g i 1 min.
- Genophæng nedbør med 1 ml PBS og tælle sporozoitter ved hjælp af et hæmocytometer.
- Udsætningsbufferen til udsætningsstødning (tabel 1) og inkuberes i et vandbad på 42 °C igen i 40-60 minutter for at frigøre sporozoitterne. Stop med at inkubere, når mere end 90% af sporozoitterne frigives. Centrifugeret derefter ved 600 x g i 10 min.
2. Indsamling og rensning af merozoitter af E. necatrix
BEMÆRK: Brug Arbor Acre (AA) slagtekyllinger i alderen 7-14 d i forsøget. Coccidia-fri kyllinger (n =3) blev vaccineret med 2 x 105 oocyster af E. necatrix. Ved 109 h efter infektion, blev fuglene ofret af livmoderhalskræft dislokation. Tarmen blev fjernet til indsamling af 2nd generation merozoitter. For forskellige Eimeria arter, var der en anden tid til indsamling af 2nd generation merozoitter: E. necatrix på 109 h, og E. tenella på 112 h post-inokulering. For transfection af E. necatrix,merozoitter er det optimale valg som den anden merozoitter er nemme at rense.
- Samling af anden generations merozoitter af E. necatrix
- Skær kyllingtarmen langs, fra æggeblomme stilken (midten af tyndtarmen) til ilececal åbning, og vask det med PBS eller HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) forsigtigt tre gange i en petriskål.
- Skær tarmen i 0,5 cm x 0,5 cm stykker og læg den i en konisk kolbe med en fordøjelsesbuffer (tabel 1). Kolben anbringes på en magnetisk mixer ved 37 °C med en omrøringsstang i 30-60 minutter for at frigive merozoitter. Efter 30 min inkubation, overvåge frigivelsen af merozoites ved mikroskopisk undersøgelse hver 5 min.
- Rens merozoitterne ved filtrering og centrifugering.
- Suspensionen, der indeholder fordøjede merozoitter, filtreres med fire lag gaze14og centrifugeres ved 600 x g i 10 minutter.
- Efter centrifugering skal supernatanten, der indeholder tarmrester, kasseres. Overfør nedbør med rensede merozoitter til 1,5 ml rør.
- Gensuspendere nedbør med 1 ml PBS og tælle merozoitter ved hjælp af en hæmocytometer.
3. Nuklerofection af merozoitter eller sporozoitter
- Præparat før kernekant af parasitter
- Forbered omkring 107 merozoitter eller sporozoitter i ét rør. Hvis transfecting merozoites, forberede 3-4 rør.
- Der fremstilles en mængde plasmid DNA eller renset PCR-fragment, der er større end eller lig med 10 μg.
BEMÆRK: Plasmid, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder 2 gener: forbedret gulfluorescerende protein (EYFP) og dihydrofolate reductase thymidylate syntase stammer fra Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Forbered 25 U af begrænsning enzym. Hvis plasmider er lineariseret, kan begrænsningsenzymet forbedre transfektionseffektiviteten. Hvis plasmiderer er cirkulære, udelades begrænsningsenzymet.
- 85 μL nukleofection buffer: bland 20 μL kerner buffer I og 1 ml nucleofection buffer II, og brug en del af opløsningen. Den samlede buffervolumen er 100 μL.
- Nucleofection
- Centrifugesporozoit eller merozoit suspension ved 600 x g i 10 min. Derefter kasseres supernatanten.
- I følgende rækkefølge tilsættes 85 μL nuklear omladningsbuffer, 10 μg plasmid (PCR-fragment) og 25 U restriktionsenzym (normalt 5 μL) i 1,5 ml rør, der indeholder sporozoitter eller merozoitter.
- Overfør suspensionen til en nuklear omladningsbæger. Sæt koppen i en nuklear overførsel groove.
- Tænd nuklerofection enheden ved hjælp af tænd/sluk-knappen og vælg omfektionsproceduren U-033. Hvis nuklerofection-enheden starter i tilstanden Gratis programvalg, skal du afslutte denne tilstand ved at trykke på X-knappen.
- Når programmet er færdigt, skal du trykke på X-knappen på nucleofection-enheden, og skærmen skal vise OK, hvilket indikerer, at kernerne er vellykket.
- Tilføj 0,5-1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 til nuklection kop for at stoppe reaktionen og overføre suspensionen til 1,5 ml rør efter blanding forsigtigt.
4. Cloacal podning eller intravenøs injektion
- Vaccinere de nucleofected parasitter i 7-dages gamle kyllinger. Vaccinere merozoitterne i E. necatrix eller sporozoitterne i E. tenella via klonacalruten, men inokulere E. acervulina sporozoitter via intravenøs injektion. Vaccinere omkring 2 x 107 millioner sporozoitter i hver kylling, og incoluate merozoites 107 for hver fugl.
5. Sortering af formering og FACS
- Saml oocyster fra afføring 5-9 dage efter podning med transfected sporozoitter. Indsamle oocyster på den tredje dag efter inokulere med transfunderet merozoitter.
- Brug fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og 150 mg/kg pyrimetin8 til successivt øge det transgene populationsforhold.
BEMÆRK: Brug pyrimetin ved at tilføje det direkte i foderet. For mere bekvem brug, forberede vandopløselige pyrimethamin. 1 g pyrimetin opløses i 0,2 ml pf H2SO4 og 9,8 ml N-methylpyrrolidon (NMP), og tilsæt derefter 1,5 ml af denne bestandopløsning til 1 L drikkevand til fugle.
6. Valgfri kolonnerensning
BEMÆRK: Hvis der er behov for mere rene sporozoitter eller merozoitter, er der en valgfri metode, der renser dem gennem en diethylaminoethyl-52 cellulose (DE-52 cellulose) kolonne.
- Forbered KOLONNEN DE-52 cellulose mindst en dag i forvejen.
- Forbered glycine eluent buffer(tabel 1). PH-værdien af glycine-eluentbufferen justeres fra 7,6 til 8,0 og forvarmes til 41 °C.
- Tilføj 2,5 g DE-52 cellulose til kolonnen. Tilsæt vand og suge natten over. Kassér supernatanten.
- Tilsæt vand og lægges i blød i 1 time. Kassér supernatantet.
- Tilsæt 0,1 M NaOH og lægges i blød i mindst 2 timer. Gentag dette trin.
- Udskift supernatantet med vand. Når cellulosehelt afregner til bunden (ca. en halv time), skal du gentage dette trin.
- Kassér supernatanten, tilsæt 0,1 M HCl, og lægges i blød i mindst 2 timer. Gentag dette trin.
- Kassér supernatantet, og læg celluloseen i blød to gange med glycineluensbuffer.
- Mål og juster pH fra 7,6 til 8,0 ved at tilføje 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH.
BEMÆRK: I denne del har væsken mindst 5x mere volumen end DE-52 cellulose.
- Juster strømningshastigheden mellem 40-50 r/min.
- Når sedimenteringen af cellulose er afsluttet, tilsættes sporozoiteller merozoitsuspensionen til den kromatiske søjle. Juster strømningshastigheden til 30-40 r/min.
BEMÆRK: Genophæng sporozoiteller merozoit nedbør med glycin eluent buffer, før du tilføjer den kromatiske kolonne. - Opsaml med glycin eluent buffer i 50 ml rør. Stop indsamlingen i henhold til resultaterne af den mikroskopiske undersøgelse af sporozoitter eller merozoitter under elueringsprocessen.
- Centrifuger glycine-eluentbufferen, der er opsamlet ved 600 x g i 10 min. Overfør sporozoiteten eller merozoitnedbøren til nye 1,5 ml rør.
- Tæl sporozoitterne eller merozoitterne ved hjælp af et hæmocytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er blevet brugt til transfect eimerian parasitter. I denne undersøgelse blev 2nd generation meronts og merozoites af E. necatrix vist i figur 2A og figur 2B, mens figur 2C og figur 2D viste sporocyster og sporozoitter af E. tenella efter brug af tæthedgradientopløsningerne. Oocysterne af E. necatrix (figur 3A) og E. tenella (figur 3B) efter nukleofecing af merozoitter eller sporozoitter blev også vist. Transfection effektivitet første generation oocyster efter kerneratecting sporozoitterne er omkring 3-10%, i almindelighed. Men efter nuklerofecing af merozoitter, omfektion effektivitet anden generation oocyster er kun et par tusindedele (Transfection effektivitet af første generation oocyster kunne ikke beregnes).
Figur 1: Rensning af sporozoitter. (A) Rense sporozoitter gennem densitet-gradient centrifugering med tæthed gradient løsninger. (B) Rense sporozoitter gennem DE-52-cellulose søjle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 2nd generation meronts og merozoites af E. necatrix sammen med sporocyster og sporozoitter af E. tenella. (A) Modne 2nd generation meronts af E. necatrix. (B) De udgivne 2nd generation merozoitter af E. necatrix. C) Sporocyster af E. tenella efter rensning. (D) Sporozoites E. tenella efter rensning. Skalaen bar er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: De oocyster, der opnås efter at have inficeret med de nucleofected merozoitter eller sporozoitter. (A) Oocysts af E. necatrix efter at have inficeret med kernerne merozoitter. (B) Oocysts af E. tenella efter at have inficeret med kerner sporozoitter. Skalaen bar er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Sammensætning |
| Fordøjelsesbuffer | 0,25 g trypsin, 0,5 g natriumtaurodeoxycholate hydrat, 100 ml PBS eller HBSS |
| 0,1 M NaOH | 2 g NaOH, 500 ml vand |
| 0,1 M HCl | 4,3 ml koncentreret saltsyre, 500 ml vand |
| Glycin eluent buffer | 0,75 g glycin, 7,9 g NaCl, 500 ml vand |
| Buffer til excystation | 0,75% trypsin, 10% kylling galde, PBS |
| 1 × GD gradient stock solution(Percoll) | 90 % 1 × GD-opløsning til gradientlager(Percoll), 10 % PBS (10 X) |
| Nucleofection buffer I | ATP-dinatrium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml vand |
| Nucleofection buffer II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glukose 0,2 g, 500 ml vand |
| * vand: destilleret vand | |
Tabel 1: Sammensætningen af buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I 1990'erne blev der udviklet et transfektionssystem til apicomplexanske parasitter, og det blev brugt til undersøgelser af eimeriske parasitter. For nylig blev der gennemført stabil transfection i E. tenella8,9 og E. nieschulzi15. Vi opnåede den stabile transfection af E. necatrix ved at transfecting anden generation merozoitter11. Inokulering af transfected sporozoitter af E. acervulina gennem vingen vene løst den manglende evne til sporozoitter af E. acervulina, der skal vaccineres via cloacal rute (Zhang et al., ikke offentliggjorte data). Her beskrev vi en detaljeret transfektionsprocedure for at hjælpe forskere nucleofect eimerian parasitter.
Tidligere undersøgelser viste, at det var muligt at injicere transfunderet sporozoitter i tarmlumen af kaniner i en laparotomi for in vivo stabil transfection af E. magna16 og E. intestinalis17. Ifølge vores erfaring var der højere effektivitet ved sortering sporocyster af FACS i stedet for oocyster. Der var også rapporter om omladning af usporulerede oocyster af E. maxima ved hjælp af et genpistol system eller vellykket elektroporation af sporulated oocyster med eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Således, vores fremtidige undersøgelser udforske omfektion af oocyster eller sporocyster at forenkle transfektionprocedurer i Eimeria parasitter.
Transfection succes i eimeriske parasitter kunne gøre det muligt genetisk modificerede Eimeria, der skal anvendes som vaccine køretøjer til at bære heterologantigener, såsom CjaA fra C. jejuni13. Selv om transfektionseffektiviteten i Eimeria er blevet væsentligt forbedret, har genredigeringsteknologien fortsat begrænsninger i eimeriske parasitter. Med udviklingen af transfection i Eimeria, CRISPR/CAS9 teknologi i Eimeria (Hu et al., ikke offentliggjorte data) kan føre til genetisk manipulation af Eimeria.
Afslutningsvis giver denne protokol en detaljeret procedure for nukleofection hos kylling Eimeria. Omladning af sporozoitter eller merozoitter er værdifuld for studiet af genfunktion i Eimeria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale centrale forsknings- og udviklingsprogram (2017YFD0501200) og National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 og 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
