Summary
Her presenterer vi en protokoll for in vivo styrking av gut-homing regulatoriske T celle induksjon. I denne protokollen, dendrittiske celler er konstruert for å lokalt produsere høye konsentrasjoner av den aktive vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og den aktive vitamin A (retinoic syre eller ra) de Novo.
Abstract
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sykdom i mage-tarmkanalen (GUT). I USA er det ca 1 400 000 IBD pasienter. Det er allment akseptert at en dysregulated immunrespons på tarmbakterier initierer sykdommen og forstyrrer slimhinnene epitel barriere. Vi har nylig viser at gut-homing regulatoriske T (treg) celler er en lovende terapi for IBD. Følgelig presenterer denne artikkelen en protokoll for in vivo styrking av gut-homing treg celle induksjon. I denne protokollen er dendrittiske celler konstruert for å produsere lokalt høye konsentrasjoner av to molekyler de Novo, aktiv vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og aktiv vitamin A (retinoic syre eller ra). Vi valgte 1, 25 (OH)2D og ra basert på tidligere funn som viser at 1, 25 (Oh)2D kan indusere uttrykk for regulatoriske molekyler (f. eks stallgreip boksen P3 og interleukin-10) og at ra kan stimulere uttrykket av gut-homing reseptorer i T-celler. For å generere slike konstruerte dendrittiske celler, bruker vi en lentiviral vektor for å overfører dendrittiske celler til overekspresjon to gener. Ett gen er cytokrom P450 familien 27 gruppe B-medlem 1 som koder 25-hydroksyvitamin D 1 α-hydroksylase, som fysiologisk katalyserer syntesen av 1, 25 (OH)2D. Det andre genet er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2 som koder retinaldehyde dehydrogenase 2, som fysiologisk katalyserer syntesen av RA. Denne protokollen kan brukes for fremtidig undersøkelse av gut-homing treg celler in vivo.
Introduction
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en inflammatorisk kronisk sykdom i mage-tarmkanalen (GUT). I USA er det ca 1 400 000 IBD pasienter. Det er allment akseptert at en dysregulated immunrespons til gut bakterier initierer sykdommen og forstyrrer slimhinnene epitel barriere1,2. Av denne grunn, for tiden tilgjengelig US Food and Drug Administration (FDA)-godkjente legemidler hemme funksjonene til inflammatoriske meglere eller blokkere homing av immunceller i tarmen. Men, den inflammatoriske meglere og immunceller som er målrettet er også nødvendig for immunforsvar. Som et resultat, inflammatorisk megler hemmere kompromiss systemisk immunforsvaret og immun cellen homing blokkere svekke gut immune forsvar, som begge kan føre til alvorlige konsekvenser3,4. I tillegg kan immun cellen homing blokkere også blokkere homing av regulatoriske T (treg) celler i tarmen og dermed kan forverre allerede kompromittert gut uimottakelig toleranse i IBD pasienter. Videre blokkering av treg celle Homing inn i tarmen kan også føre til systemisk immun bekjempelse på grunn av akkumulering av treg celler i blodet5. Til slutt, hemmere og blokkere funksjon midlertidig og dermed krever hyppige administrasjoner. Hyppig administrering av disse hemmere og blokkere kan ytterligere forverre uheldige bivirkninger.
Nylig foreslo vi en ny strategi som kan potensielt dempe eller eliminere bivirkningene forbundet med dagens medikamenter for IBD behandling6. Denne strategien forsterker induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev6. Begrunnelsen for denne strategien er at gut-homing treg celler spesielt hjem til tarmen og dermed ikke vil kompromittere systemisk immunforsvar. I tillegg, siden treg celler kan potensielt danne minne7,8, gut-homing treg celler kan potensielt gi en stabil kontroll av kronisk gut betennelse hos IBD pasienter, og dermed bør behandlingen ikke må administreres som ofte. Videre, siden denne strategien forsterker induksjon av gut-homing treg celler in vivo, det har ikke bekymring for in vivo ustabilitet i et svært proinflammatoriske miljø som er forbundet med adoptiv overføring av in vitro generert treg celler9,10. I denne forbindelse, in vitro generert treg celler er en av de foreslåtte strategiene for behandling av autoimmune sykdommer11,12,13 og transplantasjon avvisning14,15. Til slutt, i denne strategien, dendrittiske celler (DCs) er konstruert for å produsere lokalt høye konsentrasjoner av to molekyler de Novo: aktiv vitamin D (1, 25-dihydroxyvitamin D eller 1, 25 [OH]2D) og aktiv vitamin A (retinoic syre eller ra). Vi valgte 1, 25 (Oh)2d og ra fordi 1, 25 (Oh)2d kan indusere uttrykk for regulatoriske molekyler (f. eks stallgreip boksen P3 [foxp3] og interleukin-10 [Il-10])16,17 og at ra kan stimulere uttrykket av gut-homing reseptorer i T celler18. Fordi både 1, 25 (Oh)2D og ra også kan tolerize DCS28,29, har vi grunn til at de konstruerte DCS vil bli stabilt vedlikeholdt i en tolerogenic status in vivo og dermed omgå in vivo ustabilitet som er knyttet til in vitro-genererte tolerogenic-DCS (TolDCs)19,20,21. I så henseende er TolDCs også en av de foreslåtte strategiene for in vivo styrking av treg celle funksjoner19,20,21. For å støtte vårt resonnement, har vi vist at konstruert DCs, på in vivo levering, kan øke induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev6.
En ekstra fordel med våre foreslåtte strategien er at 1, 25 (OH)2D har også andre funksjoner som kan potensielt nytte IBD pasienter. Disse andre funksjoner inkluderer evnen til 1, 25 (OH)2D for å stimulere utskillelsen av antimikrobielle stoffer22 og å undertrykker kreft23. Infeksjoner og kreft er ofte assosiert med IBD24,25.
For å generere DCs som kan produsere lokalt høye konsentrasjoner av både 1, 25 (OH)2D og ra de Novo, bruker vi en lentiviral vektor for å konstruere DCS til å overekspresjon to gener. Ett gen er cytokrom P450 familien 27 gruppe B-medlem 1 (CYP27B1) som koder 25-hydroksyvitamin D 1 α-hydroksylase (1 α-hydroksylase), som fysiologisk katalyserer syntesen av 1, 25 (OH)2D. Det andre genet er aldehyd dehydrogenase 1 familiemedlem a2 (ALDH1a2) som koder retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2), som fysiologisk katalyserer syntesen av RA6.
Fordi in vivo styrking av gut-homing treg celle induksjon er potensielt viktig i behandlingen av IBD, i følgende protokoll vil vi detalj prosedyrene for generering av 1 α-hydroksylase-RALDH2-overexpressing DCs (DC-CYP-ALDH celler) som kan brukes for fremtidig undersøkelse av gut-homing treg celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle inne vivo dyr studere protokoller var anmelder og godkjent av Loma Linda universitet institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) likeledes idet det dyr bekymre og bruk anmelde kontor (ACURO) av det oss hæren legeundersøkelse forskning og materiell kommandere (USAMRMC) av det Forsvarsdepartementet.
1. utarbeidelse av lentivirus som uttrykker både 1 α-hydroksylase og RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH virus)
- Dag 0: i tidlig morgen, forberede 5 x 105 celler/ml 293T celler i cm-10-D cellekultur medium.
- Seed 20 mL/tallerken i 150 mm x 25 mm kultur retter. Kultur cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 h. Confluency vil nå ~ 80-90% etter 24 h.
- Dag 1: Lag 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl og 1,5 mM na2HPO4, pH 7,1). Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
- Lag 2 M CaCl2 og oppbevar ved romtemperatur.
- For hver 150 mm x 25 mm kultur rett tilbereder du en blanding av DNA-nedbør i et sterilt 50 mL kultur rør. Først Tilsett 1 620 μL av 2x HBS, 9,5 μg av PMD2G (VSVG), 17,5 μg av pCMVR 8.74 (kapsid), 27 μg av Lenti-CYP-ALDH plasmider (en lentiviral vektor som bærer både CYP27B1 og ALDH1a2). For det andre, tilsett H2O til et endelig volum på 3 037,5 μL.
- I det siste, tilsett 202,5 μL av 2 M CaCl2 dråpevis mens oppløsningen blandes til endelige konsentrasjoner av 1x HBS og 125 mm CaCl2. CaCl2 må være den siste som skal legges til. La transfeksjoner blandinger ved romtemperatur i 20 minutter med sporadiske miksing. For flere 150 mm x 25 mm kultur retter, Skaler opp tilsvarende.
- Tilsett 3 240 μL av DNA nedbør blanding dråpevis til 1 150 mm x 25 mm kultur parabolen inneholder 293T cellene. Forsiktig virvel kulturen parabolen side til side mens du legger til DNA nedbør blandingen. Ruge fatet ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 timer.
- Dag 2: Fjern kalsium fosfat transfeksjoner oppløsning, vask forsiktig med 1x PBS, og refeed celle kulturen med CM-4-D cellekultur medium. Ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 timer.
- Dag 3: høste supernatanter i sterile lager flasker og oppbevares ved 4 – 8 ° c. Etterfylle celle kulturen med friske CM-4-D cellekultur medium. Kultur cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for en annen 24 h.
- Dag 4: høste supernatanter i sterile lager flasker. Filtrer supernatanter fra dag 3 og dag 4 gjennom et 0,45 μm-filter. Å konsentrere VSVG pseudotype virus, overføre supernatanter til sentrifuger rør og spinne på 4 780 x g for 24 h ved 4 ° c.
- Dag 5: hell supernatanter av pellets (pellet er ofte synlig) og la rørene renne på et papir håndkle i et sterilt biosafety kabinett i flere minutter.
- Resuspend pellets ved pipettering med steril PBS inneholder 5% glyserol. Volumet for blanding vil være 33,3 μL per 150 mm x 25 mm kultur rett.
- Alikvot 200 μL/tube og oppbevares ved-80 ° c. Lag en separat alikvot på 50 μL/hetteglass for titrering. Titers bør være innenfor rekkevidden av 108– 109 transducing enheter (TUs)/ml.
- Legg blekemiddel i kulturen retter og forkaste dem.
Merk: disse transfekterte cellene er den største sikkerheten bekymring i protokollen siden alle lentiviral elementer er uttrykt i cellene.
2. generering av benmarg avledet DCs (BMDCs)
- Harvest tibias og femurs fra 4 – 5 Balb/c mus til et 50 mL sterilt polypropylen rør som inneholder kultur mediet6.
- Overfør tibias og femurs til en 100 mm x 20 mm kultur rett som inneholder kultur mediet. Fjern vev som muskler fra tibias og femurs ved hjelp av dissekere saks og tang.
- Skjær begge endene av tibias og femurs å avdekke benmargen hulrom.
- Tegn 10 mL kultur medium i en 10 mL sprøyte festet til en 30 G nål.
- Sett nålen forsiktig inn i benmarg hulen og skyll benmargen inn i en ren 50 mL steril polypropylen tube. Gjenta denne fremgangsmåten hvis det er nødvendig, for å sikre at benmargen er helt spyles ut.
- Pellet benmarg cellene ved sentrifugering (400 x g) ved 2 – 8 ° c i 5 min. aspirer supernatanten.
- Resuspend pellet med 5 mL 1x røde blod cellelyse Rings buffer.
- Ruge cellene i romtemperatur i 4 – 5 minutter med sporadisk risting.
- Stopp reaksjonen ved å legge til 30 mL kultur medium.
- Pellets cellene ved sentrifugering (400 x g) ved 2 – 8 ° c i 5 min. Resuspend cellene i 10 ml cm-10-R cellekultur medium. Hvis det er nødvendig, kan cellene bli passert gjennom en 40 μm celle sil for å fjerne rusk.
- Utfør en celle telling og Juster cellene til 1 x 106 -celler/ml ved hjelp av cm-10-R cellekultur medium.
- Legg til rekombinant murine granulocytt/macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF, endelig konsentrasjon = 100 U/mL) og murine interleukin-4 (IL-4, siste konsentrasjon = 10 U/mL).
Merk: de lager løsninger av GM-CSF og IL-4 er lagret ved-80 ° c ved 100 000 U/mL (1, 000x) og 10 000 U/mL (1, 000x), henholdsvis. - Fordel cellene i 6 brønn kultur plater ved 4 mL/brønn og kultur cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 48 h.
- Fjern nonadherent celler med skånsom pipettering.
- Legg til frisk CM-10-R cellekultur medium som inneholder GM-CSF (100 U/mL) og IL-4 (10 U/mL). Kultur cellene for en annen 48 h.
- Harvest nonadherent celler (BMDCs) for Transduction av Lenti-CYP-ALDH virus.
3. Transduction av DCs med Lenti-CYP-ALDH virus å generere DC-CYP-ALDH celler
- Forbered 1 x 106 DCS/brønn i et samlet volum på 0,5 ml av cm-10-R cellekultur medium som inneholder 50 μL av virus og 8 μg/ml protamine i en 6 brønn kultur plate.
- Kultur cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 h.
- Bytt medium med frisk CM-10-R cellekultur medium og kultur cellene ved 37 ° c og 5% CO2 for en annen 24 h. På dette tidspunktet kan enzymatisk aktiviteter av 1 α-hydroksylase og RALDH2 evalueres (se trinn 4). Gjenta om nødvendig trinn 3.1 – 3.3 for å få en ny Transduction.
- Legg lipopolysakkarid (100 ng/mL) og kultur cellene for 24 h.
- Høste cellene (DC-CYP-ALDH celler) for eksperimenter.
4. evaluering av overexpressed 1 α-hydroksylase og RALDH2 i DC-CYP-ALDH Cells
- Evaluering av overexpressed 1 α-hydroksylase i DC-CYP-ALDH celler
- Seed 1,0 x 106 DC-CYP-ALDH celler/brønn i 2 ml cm-10-R cellekultur medium i 12 brønn kultur plater.
- Tilsett 25 (OH) D til den endelige konsentrasjonen av 2,5 μM. Ruge DC-CYP-ALDH celler for 24 h.
- Høste supernatanter og lagre ved-20 ° c.
- Analysen for 1, 25 (OH)2D konsentrasjoner i supernatanter ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig RADIOIMMUNOASSAY (RIA) (se tabell over materialer).
- Bestem uttrykket for 1 α-hydroksylase i DC-CYP-ALDH celler ved fluorescens aktivert celle sortering (FACS) ved hjelp av et anti-CYP27B1 antistoff.
- Evaluering av overexpressed RALDH2 i DC-CYP-ALDH celler
Merk: uttrykket og aktiviteten til overexpressed RALDH2 bestemmes ved hjelp av et kommersielt aldehyd-dehydrogenase (ALDH) (se tabell over materialer).- Seed 1 mL av DC-CYP-ALDH eller kontroll celler (1 x 105 celler/ml i analysen buffer) i hver av to 5 ml rør (en merket som "kontroll" og den andre merket som "test").
- Tilsett 10 μL av diethylaminobenzaldehyde (DEAB) oppløsning (1,5 mM i 95% etanol) til hver av kontrollrørene og bland umiddelbart. DEAB er en RALDH2-hemmer.
- Tilsett 5 μL av aktivert RALDH fluorescens substrat (300 μM) til kontroll-og test rørene og bland dem umiddelbart.
- Ruge rørene i 45 min.
- Pellets cellene ved sentrifugering ved 400 x g ved 2 – 8 ° c i 5 min. aspirer supernatanter.
- Rekonstituer cellene i 200 μL av analysen buffer.
- Hold cellene på isen og Fortsett for analyse av FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC-CYP-ALDH celler uttrykt betydelig økt mengde 1 α-hydroksylase. For å fastslå om DC-CYP-ALDH celler generert fra BMDCs uttrykt en betydelig økt mengde 1 α-hydroksylase, BMDCs ble transduced med Lenti-CYP-ALDH-viruset til å produsere Ben-marg-avledet DC-CYP-ALDH-celler (BMDC-CYP-ALDH celler). Deretter ble BMDC-CYP-ALDH-cellene undersøkt for uttrykket av 1 α-hydroksylase av FACS. Våre data viste at BMDC-CYP-ALDH celler, sammenlignet med foreldrenes BMDCs, vist forbedret uttrykk for 1 α-hydroksylase (figur 1A). Vi har også fastslått enzymatisk aktivitet av 1 α-hydroksylase i BMDC-CYP-ALDH celler. For å gjøre dette, 1,0 x 106 BMDC-CYP-ALDH celler i 2 ml cm-10-R cellekultur medium ble lagt inn i 12 brønn kultur plater. 25 (OH) D ble deretter lagt til celle kulturen ved den endelige konsentrasjonen av 2,5 μM. Cellene var kultivert ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 h og supernatanter ble høstet for måling av 1, 25 (Oh)2D ved hjelp av en radioimmunoassay (RIA). Våre data viste at 1, 25 (OH)2D konsentrasjoner i kulturen SUPERNATANTER av BMDC-CYP celler (BMDCs transduced med LENTI-CYP-GFP virus) og BMDC-CYP-ALDH celler var hver ca 20x høyere enn foreldrenes BMDCS og BMDC-ALDH celler (BMDCs transduced med LENTI-ALDH virus) (figur 1B).
DC-CYP-ALDH celler uttrykt betydelig økt mengde RALDH2. For å avgjøre om BMDC-CYP-ALDH celler uttrykt en betydelig økt mengde RALDH2, en RALDH2 substrat ble lagt inn i cellen kulturer i nærvær eller fravær av RALDH2 inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) (15 μM). Det fluorescerende produktet som oppbevares inne i cellene, ble analysert av FACS. Våre data viste at gjennomsnittlig fluorescens intensitet (mikrofinansinstitusjoner) av BMDC-CYP-ALDH cellene var omtrent 6 ganger høyere enn foreldrenes BMDCs, noe som tyder på at BMDC-CYP-ALDH celler, sammenlignet med foreldrenes BMDCs, uttrykt betydelig forbedret RALDH2 enzymatisk aktivitet (figur 2A,B).
DC-CYP-ALDH celler forsterket induksjon av foxp3+CCR9+ gut-homing treg Cells in vitro. For å undersøke om DC-CYP-ALDH celler var i stand til å utfylle induksjon av gut-homing treg celler in vitro, transduced vi DC 2.4 celler (en benmarg-avledet DC linje26,27,28,29), med Lenti-CYP-ALDH virus og genererte DC 2.4-CYP-ALDH celler. Deretter bestemte vi om DC 2.4-CYP-ALDH celler var i stand til å utfylle induksjon av gut-homing treg celler in vitro. Følgelig var naiv CD4+ T celler RENSET fra C57BL/6 mus. Renset naiv CD4+ T celler ved 5 x 105 celler/brønn ble deretter COCULTURED med enten foreldrenes DC 2.4 celler (1 x 105 celler/BRØNN) eller DC 2.4-CYP-ALDH celler (1 x 105 celler/brønn) i 24 brønn kultur plater i et serum fritt medium i nærvær av et anti-CD3 monoklonale antistoff (5 μg/ml) og rekombinant Human Il-2 (50 U/ml). I tillegg, 25 (OH) D og retinol i ulike konsentrasjoner ble også lagt inn i kulturer. Cellene ble inkubert ved 37 ° c og 5% CO2. Fem dager senere, ble cellene analysert av FACS for uttrykk for foxp3 og c-c chemokine reseptor type 9 (CCR9). Våre data viste at i nærvær av underlag, DC 2.4 celler ikke signifikant endre overflod av foxp3+CCR9+ celler i CD4+ T celle populasjoner (Figur 3A, B). I kontrast, DC 2.4-CYP-ALDH celler betydelig forbedret overflod av foxp3+CCR9+ celler blant CD4+ T celler. I tillegg er mer 25 (OH) D lagt til, jo større evne til DC 2.4-CYP-ALDH celler for å øke overflod av foxp3+CCR9+ celler blant CD4+ T celler. Derfor, vår data støtte at DC-CYP-ALDH cellene kan utfylle induksjon av gut-homing treg celler in vitro.
DC-CYP-ALDH celler forsterket induksjon av foxp3+CCR9+ gut-homing treg Cells in vivo. For å fastslå om DC-CYP-ALDH celler kan øke induksjon av gut-homing treg celler in vivo, vi intraperitonealt administrert en av følgende celler til Balb/c mus: foreldre DC 2.4 celler, DC 2.4-CYP celler (DC 2.4 celler transduced med Lenti-CYP-GFP virus), og DC-2,4-CYP-ALDH celler. Fire dager etter celle administrasjon ble chrezbryzheechno lymfeknuter undersøkt av FACS (Figur 4A). Våre data viste at DC 2.4-CYP-ALDH celler, sammenlignet med kontrollene, betydelig økt overflod av foxp3+CCR9+ celler mellom CD3+ T celler (Figur 4B, C). Basert på disse resultatene, konkluderer vi at DC-CYP-ALDH celle administrasjon betydelig forsterker induksjon av foxp3+CCR9+ T celler i perifere lymfoide vev.
Figur 1: DC-CYP-ALDH celler uttrykt betydelig økt mengde 1 α-hydroksylase. (A) BMDC-CYP-ALDH-celler ble generert og ANALYSERT av FACS. En representant FACS plottet viser uttrykk for 1 α-hydroksylase i foreldrenes BMDCs og BMDC-CYP-ALDH celler (gated på levende celler). (B) 1 α-hydroksylase substrat (dvs. 25 (Oh) D) ble lagt inn i DC kulturer. 24 h senere ble supernatanter samlet og 1, 25 (OH)2D konsentrasjoner ble målt. Dataene viser konsentrasjoner på 1, 25 (OH)2D i kulturer av foreldrenes BMDCs, den BMDC-CYP celler, BMDC-ALDH celler, og BMDC-CYP-ALDH celler. * * p < 0,01. ANOVA-test. n = 4. Dette tallet er tilpasset fra Xu et al.6. Opphavsrett 2019. The American Association of immunologist, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DC-CYP-ALDH celler uttrykt betydelig økt mengde RALDH2. (A) BMDC-CYP-ALDH-celler ble generert og analysert som beskrevet i protokollen. Representative kledde FACS tomter viser BODIPY aminoacetate fluorescens i BMDCs og BMDC-CYP-ALDH celler i nærvær (+ DEAB) eller fravær (-DEAB) av RALHD2 inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB). (B) betyr fluorescens intensitet (mikrofinansinstitusjoner) av BODIPY Aminoacetate i BMDCS og BMDC-CYP-ALDH celler i fravær av DEAB. * p < 0,05; t-test; n = 4. Dette tallet er tilpasset fra Xu et al.6. Opphavsrett 2019. The American Association of immunologist, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: DC-CYP-ALDH celler forsterket induksjon av foxp3+CCR9+ gut-homing treg Cells in vitro. (A) CD4+ naive T celler ble isolert fra C57BL/6 mus spleens. Den CD4+ T celler ble deretter aktivert i kulturer av en anti-CD3 mAb (5 μg/ml) i nærvær av enten foreldrenes DC 2.4 celler eller DC 2.4-CYP-ALDH celler. I tillegg ble kulturer lagt med indikerte konsentrasjoner av 25 (OH) D og retinol. Fem dager senere, ble cellene samlet og analysert av FACS for uttrykk for foxp3 og CCR9 i CD3+CD4+ T celle befolkning. Representative FACS tomter viser uttrykk for foxp3 og CCR9 i CD3+CD4+ T celle populasjoner. (B) akkumulerte data fra (A). * p < 0,05; ANOVA test; n = 4. Dette tallet er tilpasset fra Xu et al.6. Opphavsrett 2019. The American Association of immunologist, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: DC-CYP-ALDH celler forsterket induksjon av foxp3+CCR9+ gut-homing treg Cells in vivo. (A) Balb/c mus intraperitonealt (IP) mottok en av følgende DC-overføringer (overføring): ingen DC-overføring (ingen overføring), foreldre DC 2.4-celler, DC 2.4-CYP-celler og DC 2.4-CYP-ALDH-celler. Fire dager senere ble chrezbryzheechno lymfeknuter (MLNs) analysert av FACS. (B) representative FACS tomter viser uttrykk for FOXP3 og CCR9 i CD3+ T celle befolkning. (C) kumulative data fra (B) viser prosenten av foxp3+CCR9+ celler i CD3+ T celle populasjonen. Celler var gated på CD3+ T celler for alle analysene. Der det er aktuelt, dataene som presenteres er betyr ± SEM. * p < 0,05; ANOVA test; n = 4 – 6. Dette tallet er tilpasset fra Xu et al.6. Opphavsrett 2019. The American Association of immunologist, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi bruken av DC-CYP-ALDH celler, for augmenting induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev. Våre data har vist at DC-CYP-ALDH celler kan syntetisere lokalt høye konsentrasjoner de Novo av både 1, 25 (OH)2D og ra in vitro i nærvær av tilsvarende underlag (dvs. 25 [oh] D og retinol, henholdsvis). Fordi tilstrekkelig blodkonsentrasjoner av 25 (Oh) D og retinol kan enkelt oppnås gjennom vitamin D og A fyllinger henholdsvis hos pasienter som har mangler30,31, vi grunn til at DC-CYP-ALDH celler kan øke induksjon av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev når normale blodkonsentrasjoner av 25 (Oh) D og retinol er til stede. For å støtte dette resonnement, viser våre data at i normale friske dyr som ikke har vitamin D og vitamin A mangler, DC-CYP-ALDH cellene utfylle induksjon av treg celler som uttrykker både regulatoriske molekyler (dvs. foxp3 og IL-10) og en gut-homing reseptor (dvs. CCR9). Derfor kan denne teknologien brukes for videre etterforskning av gut-homing treg celler for behandling av IBD.
Et kritisk trinn i denne protokollen er produksjonen av Lenti-CYP-ALDH-viruset med høy titers. Den foretrukne virus titers bør være 108– 109 TUs/ml. En høy titer av Lenti-CYP-ALDH-viruset er nødvendig for en høy Transduction effektivitet i DCs.
Et annet kritisk trinn i denne protokollen er Transduction effektivitet i DCs. Fordi DC-CYP-ALDH celler er ikke tolerized in vitro i denne teknologien, er det viktig at Transduction rate være mer enn 90% for å sikre at DC-CYP-ALDH celler effektivt kan utfylle induksjon av gut-homing treg celler in vivo. I tillegg kan DC-CYP-ALDH-cellene bli ytterligere renset av FACS før in vivo-administrasjon32.
En unik fordel med denne protokollen er at DC-CYP-ALDH-cellene ikke trenger å bli tolerized in vitro før in vivo-administrasjon. Det er forventet at DC-CYP-ALDH celler, som et resultat av de kombinerte handlingene til 1, 25 (Oh)2D og ra, vil bli opprettholdt i en tolerogenic status in vivo fordi både 1, 25 (Oh)2D og ra har vist seg å tolerize DCS33,34. Derfor forventer vi at DC-CYP-ALDH cellene ikke vil ha ustabilitet bekymringer i en in vivo proinflammatoriske miljø.
Foreløpig har vi bare vist at DC-CYP-ALDH celler kan øke frekvensen (antall) av gut-homing treg celler i perifere lymfoide vev og tarmen6. Følgelig, regulatoriske funksjon i tarmen som helhet er forbedret fordi prosent av treg celler i tarmen økes. Figur 4 viser at sammenlignet med de med kontroll behandlinger, intraperitoneal behandling med DC-CYP-ALDH celler betydelig økt prosentandelen av CCR9+foxp3+ treg celler i chrezbryzheechno lymfeknuter, noe som betyr at flere treg celler i chrezbryzheechno lymfeknuter er i stand til å spesielt hjem i tarm vevet. Figur 4 viser videre at de fleste foxp3+ T celler i chrezbryzheechno LYMFEKNUTER er negative for CCR9 og derfor ikke har gut-homing kapasitet. Men om DC-CYP-ALDH celler kan også forsterke regulatoriske funksjon av hver treg celle per se (for eksempel forbedret uttrykk nivåer av foxp3 og/eller IL-10) krever videre etterforskning.
Reagensene og materialene som er beskrevet her er kun for dyrestudier. Imidlertid er protokollen som gjelder for menneskelige studier ved hjelp av tilsvarende menneskelige reagenser og materialer, bortsett fra at DCs vil bli generert fra perifert blod monocytter hos mennesker. Det endelige målet med denne protokollen er generering av klinisk karakter DC-CYP-ALDH celler for behandling av IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DRS. Xiaolei tang og David J. Baylink er oppfinnere av en ventende patent knyttet til denne studien.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Office of Assistant Secretary of Defense for Health Affairs gjennom peer anmeldt Medical Research program under Award no. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er de av forfatteren og er ikke nødvendigvis godkjent av Department of Defense. Dette arbeidet ble også delvis støttet av forsknings innovasjon Grants fra Institutt for medisin ved Loma Linda University (681207-2967 [XT og GG], 681205-2967 [XT], og 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K.
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
