Summary
A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.
Abstract
O desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado requer uma coordenação precisa de comportamentos e interações celulares complexos. O uso de técnicas de imagem in vivo de alta resolução pode fornecer uma janela clara para esses processos no organismo vivo. Por exemplo, a divisão de células e sua descendência pode ser seguida em tempo real à medida que o sistema nervoso se forma. Nos últimos anos, os avanços técnicos em técnicas multicoloridas têm ampliado os tipos de questões que podem ser investigadas. A abordagem multicolor Brainbow pode ser usada não apenas para distinguir entre células semelhantes, mas também para codificar vários clones diferentes de células relacionadas que cada um deriva de uma célula progenitora. Isso permite uma análise de linhagem multiplex de muitos clones diferentes e seus comportamentos simultaneamente durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo sarco-íris ao longo do tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento. Isso é particularmente útil para acompanhar interações celulares entre células como células, que são difíceis de rotular diferencialmente usando cores tradicionais orientadas por promotores. Nossa abordagem pode ser usada para rastrear relações de linhagem entre vários clones diferentes simultaneamente. Os grandes conjuntos de dados gerados com essa técnica fornecem informações ricas que podem ser comparadas quantitativamente entre manipulações genéticas ou farmacológicas. Em última análise, os resultados gerados podem ajudar a responder perguntas sistemáticas sobre como o sistema nervoso se desenvolve.
Introduction
Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro11,2,,3,4,5,6. A coordenação entre divisão de progenitores e diferenciação e migração de neurônios determinará o tamanho, a forma e, portanto, a função do cérebro, impactando diretamente o comportamento7,,8,,9,,10. Embora o controle rigoroso sobre esses processos seja claramente crucial para o desenvolvimento normal do cérebro, os mecanismos globais que regulam essas dinâmicas não são bem compreendidos. Aqui descrevemos uma ferramenta para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso em uma resolução celular, permitindo que os pesquisadores visualizem células progenitoras e neurônios in vivo no cérebro de zebrafish em desenvolvimento com Brainbow e acompanhem seu comportamento ao longo do tempo através da microscopia confocal de lapso de tempo11. A abordagem também pode ser adaptada para visualizar outras partes do embrião em desenvolvimento.
Para observar e distinguir entre as células no cérebro de zebrafish em desenvolvimento, adaptamos a técnica de rotulagem celular Brainbow11. Brainbow utiliza a expressão combinada e determinada aleatoriamente de três proteínas fluorescentes distintas (FPs) para rotular uma população de células. Enquanto a expressão padrão para expressão Brainbow é o fp dTomato vermelho, a recombinação pela enzima Cre recombinase resulta na expressão de mCerulean (proteína fluorescente de ciano, CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP)12,13. A quantidade combinada de cada FP expressa em uma célula lhe dá uma tonalidade única, permitindo uma clara distinção visual das células vizinhas. Além disso, quando uma célula progenitora se divide, cada célula filha herdará a cor de sua célula mãe, produzindo clones codificados por cores e permitindo que os pesquisadores rastreiem a linhagem celular11,14. Embora originalmente usado para analisar circuitos neuronais em camundongos12, Brainbow tem sido expresso em uma grande variedade de organismos modelo, incluindo zebrafish15.
Nossa técnica se baseia em métodos anteriores de rotulagem e imagem multicoloridas para visualizar diretamente vários clones codificados por cores ao longo do tempo em zebrafish vivos. Devido à sua transparência óptica como embriões, os zebrafish são adequados para experimentos de imagem16, e estudos anteriores têm utilizado brainbow em zebrafish para estudar uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. A capacidade de imaginar diretamente o organismo vivo, juntamente com seu rápido desenvolvimento ex-utero, fazem do zebrafish um modelo valioso de desenvolvimento de vertebrados. Em contraste com o cérebro mamífero, toda a zona proliferativa do cérebro-zebrafish está prontamente disponível para imagens sem interrupção em seu ambiente endógeno6. Isso permite que experimentos sejam realizados no organismo vivo, em vez de preparações de tecidos in vitro ou fixos. Em contraste com os experimentos de imagem fixa, estudos in vivo permitem um desenho longitudinal, produzindo horas de dados que podem ser analisados para padrões, aumentando assim a probabilidade de observação de eventos relativamente raros. Dependendo da velocidade e duração dos eventos de interesse, os pesquisadores podem optar por realizar experimentos de imagem curtos (1-2 h) ou longos (até ~16 h). Usando o promotor de choque térmico de zebrafish 70 (hsp70, hsp), a expressão brainbow pode ser controlada temporalmente28,29. Além disso, a expressão de mosaico induzida por este promotor é adequada para rotular e rastrear muitos clones11.
A capacidade de identificar visualmente múltiplos clones dentro do cérebro vivo é uma vantagem deste método. Importantes estudos anteriores que investigaram o papel dos clones no desenvolvimento do sistema nervoso utilizaram vetores retrovirais para rotular uma única célula progenitora e sua descendência usando um único FP ou outra proteína prontamente visualizada. Essa rotulagem permite que os pesquisadores observem um único clone ao longo do tempo, seja in vitro ou in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38. Em contraste com os métodos para rastrear o comportamento das células dentro de um clone, as cores distintas do Brainbow permitem que os pesquisadores observem a dinâmica entre os clones. Além disso, usando o Brainbow para rotular muitos clones dentro do cérebro, dados adicionais sobre o comportamento clonal são coletados em relação às técnicas que rotulam um único clone11. É importante ressaltar que as abordagens aqui descritas podem ser ampliadas para gerar comparações de desenvolvimento entre peixes submetidos a diferentes manipulações genéticas ou farmacológicas18. No geral, essas vantagens tornam o lapso de tempo em imagens confocais de zebrafish expressos em Brainbow ideais para pesquisadores que exploram o desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado, particularmente aqueles interessados no papel dos clones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade Lewis & Clark.
1. Microinjeção de Embriões de Zebrafish
- Configurar tipo selvagem, zebrafish adulto em tanques de acasalamento segregados por sexo na tarde anterior à realização de microinjeções39,40.
- Prepare a solução de DNA na manhã das microinjeções. Diluir hsp:Zebrabow11 DNA plasmático para uma concentração de ~10 ng/μL em 0,1 mM KCl, juntamente com 2,5% de vermelho fenol e 3,75U Cre recombinação enzima.
- Realizar microinjeções da solução de DNA em embriões de zebrafish de uma célula dentro de 45 min de fertilização39,41. Injete aproximadamente 4,2 nL desta solução em cada embrião, equivalente a ~42 pg de DNA plasmídeo.
NOTA: A etapa de microinjeção pode ser omitida se uma linha de zebrafish transgênica, expressa por Brainbow, for acasalada em vez disso, como Tg (ubi:Zebrabow)15 e Tg (neurod:Zebrabow)18. A realização de microinjeções pode ser vantajosa porque permite aos pesquisadores titar o número da cópia e a densidade de rotulagem. Além disso, uma segunda construção de DNA que marca ou manipula um produto genético específico pode ser injetada ao lado de Brainbow, se desejar (por exemplo, uma proteína fluorescente muito vermelha que complementa brainbow18). - Mantenha embriões injetados em placas de Petri de E3 médio39 em uma incubadora de 28 °C por 24 horas.
2. Choque térmico para induzir a expressão brainbow
NOTA: Se o DNA plasmídeo injetado ou o transgene expresso não utilizar o promotor hsp70 para conduzir a expressão, o passo de choque térmico pode ser ignorado, e embriões saudáveis devem ser imediatamente transferidos para feniltioriea (PTU) às 24 h pós fertilização (hpf).
- A 24 hpf, cull morto e deformado embriões do grupo de embriões injetados. Em seguida, transfira os embriões saudáveis para um tubo de 50 mL, com até 20 embriões/tubo.
- Encha os tubos com 10 mL de E3. Coloque uma tampa em cima de cada tubo, mas não feche firmemente.
- Coloque o rack do tubo contendo os tubos de 50 mL eretos em um banho de água de 37 °C. Certifique-se de que o nível de água no banho é maior do que o nível do E3 nos tubos e deixe-os por 80 a 90 min.
- Remova o rack do tubo com os embriões do banho de água e retorne à incubadora de 28 °C na vertical. Deixe até 1h para o E3 esfriar e os embriões se reaclimatem gradualmente à temperatura. Em seguida, transfira os embriões para placas de Petri de 0,2 mM PTU em E3 aquecido na incubadora para evitar pigmentação de embriões.
ATENÇÃO: PtU é um produto químico tóxico que deve ser manuseado com cuidado e descartado adequadamente. Usar luvas é sugerido.
3. Triagem de Embriões para Expressão Brainbow
- De 2 a 4 h após o choque térmico, examine os embriões um microscópio de dissecção de fluorescência padrão para expressão de CFP ou YFP, que indica recombinação brainbow bem sucedida (da expressão padrão de dTomato).
NOTA: Se várias opções de filtro de fluorescência estiverem disponíveis, a triagem para PCP é a maneira mais eficiente de identificar peixes bem recombinados. Se os filtros CFP e YFP não estiverem disponíveis, o YFP também pode ser visualizado vagamente filtros de proteína fluorescente verde (GFP) devido à sobreposição em seus perfis espectrais. - Selecione embriões com expressão FP robusta por toda parte e transfira para um prato separado com PTU. Embriões de imagem a 1 dia após fertilização (dpf; 28 hpf ou posterior) ou manter embriões em PTU e imagem a 2 ou 3 dpf.
4. Montagem de embriões para imagens in vivo
-
Antes do dia do experimento, prepare a câmara de imagem e a ferramenta de manipulação de embriões.
- Prepare a câmara de imagem colando cuidadosamente um anel de plástico ao centro de uma placa de Petri de 60 mm.
- Opcionalmente, prepare um manipulador de embriões feito medida para mover embriões dentro do prato e oriente os embriões durante a montagem. Construa o manipulador sobrecarregando um pequeno comprimento de linha de pesca de nylon (~1/2 em, ~6 lb) até o final de um palito de algodão de madeira que foi cortado para ~4 de comprimento.
- Se necessário (ou seja, imagem a 2 dpf ou anterior), antes de montar os embriões dechorionados usando seringas um microscópio de dissecção.
-
Anestesie embriões de zebrafish.
- Encha uma placa de Petri de 60 mm no meio do caminho com E3 e adicione 5-6 gotas de 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S a uma concentração final de ~0,2 mM. Redemoinho para misturar.
ATENÇÃO: Tricaine deve ser manuseado com cuidado e descartado adequadamente. - Transfira os embriões do PTU para a solução tricaine, garantindo que o mínimo de PTU seja transferido o mais possível. Enquanto os reflexos dos peixes devem cessar após 1-2 min, deixe os embriões em tricaine por até 10 min para garantir a anestesia completa para experimentos de imagem de lapso de tempo.
- Confirme se os embriões estão devidamente anestesiados. Avalie o reflexo do reflexo do início tocando suavemente as caudas do embrião com o manipulador de embriões. Se um movimento reflexo for observado, adicione uma gota adicional de tricaine ao prato o mais longe possível dos embriões e gire para misturar. Observe a freqüência cardíaca do embrião sob um escopo de dissecção. Se for anormalmente lento, adicione gotas adicionais de E3 ao prato para reduzir a concentração de tricaine.
- Encha uma placa de Petri de 60 mm no meio do caminho com E3 e adicione 5-6 gotas de 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S a uma concentração final de ~0,2 mM. Redemoinho para misturar.
-
Monte embriões anestesiados em agarose.
- Transfira o peixe para o centro do anel plástico dentro da câmara de imagem e remova o máximo de E3 possível usando uma pipeta de transferência de ponta fina.
- Usando uma pipeta de transferência limpa, cubra o peixe com 1,0% de agarose de derretimento baixo (LMA) em E3 armazenado a 42 °C e encha todo o anel de plástico com uma fina camada de agarose. Use uma pipeta de transferência para puxar suavemente os embriões para cima na ponta da pipeta e voltar para a agarose sem introduzir bolhas de ar.
- Antes que a agarose endureça, use rapidamente um manipulador de embriões para orientar o peixe adequadamente. Se a imagem estiver com um microscópio vertical, posicione os embriões o mais próximo possível da superfície superior da agarose. Posicione os embriões paralelos à parte inferior da câmara de imagem com a cauda reta.
NOTA: Para imagens cerebrais posteriores, os embriões podem ser posicionados em uma visão dorsal ou sagital. Deve-se tomar cuidado para garantir que as cabeças dos embriões não afundem enquanto a agarose ainda estiver líquida. Outras orientações podem ser apropriadas para direcionar outros tecidos em desenvolvimento para imagens. Para microscópios invertidos, a montagem seria feita de forma diferente, normalmente posicionando o peixe perto do fundo de uma placa de Petri com fundo de vidro.
- Espere a agarose endurecer, depois encha a câmara de imagem com E3. Adicione o máximo de E3 possível para explicar a evaporação ao longo da imagem.
5. Imagem confocal de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish hindbrain
-
Coloque a câmara de imagem no microscópio confocal em preparação para a imagem.
- Coloque a câmara de imagem com o peixe e o E3 no microscópio confocal.
- Selecione um objetivo com alta abertura numérica e uma longa distância de trabalho, como um objetivo de imersão de água de 20x (1,0 NA).
- Encontre uma região com rotulagem adequadamente densa e brilhante do tipo de célula de interesse.
NOTA: Um estágio/aparelho controlado pela temperatura no microscópio também pode ser usado para regular a temperatura e a umidade durante longas sessões de imagem. Isso pode diminuir a evaporação.
-
Configure os parâmetros de aquisição para a imagem brainbow.
- Imagem de cada canal FP sequencialmente. Se usar um software comercial (por exemplo, software Zen), isso é feito preparando três "faixas". Use um laser Argon para excitar CFP a 458 nm e YFP a 514 nm. Use um laser DPSS 561 nm para excitar dTomato. Coletar emissões entre 463-509 nm para PCP, 519-555 nm para YFP e 566-691 nm para dTomato.
- Para exibição na tela, código CFP como azul, YFP como amarelo e dTomato como vermelho.
NOTA: Essas configurações variam dependendo de quais linhas de laser e outras características estão disponíveis no microscópio confocal. Para aumentar a velocidade da imagem, os canais CFP e dTomato podem ser imagemao mesmo sem sangramento apreciável. Se um FP separado também estiver sendo imagem, como um FP muito vermelho, isso pode ser recapturado sequencialmente ou simultaneamente com o YFP. - Configure os parâmetros gerais de imagem para tirar imagens de 16 bits com uma resolução de pelo menos 1024 x 1024 e uma média de duas vezes. Ajuste o zoom dependendo da região e do tipo de interesse celular (ou seja, para imagens de cérebro traseiro com um objetivo de 20x, o zoom irá variar de 1,0 a 2,5). Maximize o campo de visão para permitir o crescimento dos peixes ao longo do tempo.
- Visualizando uma faixa de cada vez (e desligando outros lasers para evitar o fotobranqueamento), otimize as configurações de aquisição para cada FP individualmente (por exemplo, potência do laser, tamanho do pinhole, ganho de tubo fotomultiplicador, etc.).
- Selecione o intervalo de pilha Z para a imagem.
NOTA: Para longas sessões de imagem (>2 h), leve em consideração que o peixe continuará a crescer ao longo do curso de imagem, assim, tanto o campo XY quanto a gama de pilha Z devem explicar isso com espaço extra. Se a imagem do cérebro traseiro, inclua espaço no campo para que o tecido se mova rostralmente durante o período de imagem. O espaço também precisa ser incluído para o crescimento na dimensão Z. Inclua na imagem aproximadamente 10-20 μm acima da região de interesse, se o peixe está posicionado para a visão sagital ou dorsal.
-
Configure parâmetros para imagens de lapso de tempo.
- Selecione um intervalo de tempo. O comprimento do intervalo varia entre 10-30 min para rastrear eventos mitóticos e apoptóticos no cérebro em desenvolvimento. O comprimento do intervalo variará dependendo da velocidade dos eventos de interesse e do tempo total necessário para capturar uma única pilha Z.
- Selecione a duração da sessão de imagem. As sessões de imagem de lapso de tempo geralmente ocorrem durante a noite e podem durar pelo menos 16 horas.
-
Executar o experimento.
NOTA: O peixe pode ser eutanizado imediatamente após a imagem ou cuidadosamente dissecado da agarose usando seringas e devolvido ao E3 para se recuperar. Os peixes recuperados podem então ser recapturados em um ponto de tempo posterior, embora a posição e a profundidade da célula mudem durante este período devido ao crescimento geral.
6. Gerenciamento de arquivos com lapso de tempo
-
Importe o arquivo de imagem para o software de análise.
- Se estiver usando o software Zen, salve o arquivo no formato .czi assim que a aquisição de imagem for concluída. Certifique-se de salvar dados brutos em um formato compatível com Fiji42 e/ou outro software.
- Importe para o software Fiji usando o BioFormats Importer.
NOTA: Os arquivos de lapso de tempo serão grandes e podem exigir quantidades significativas de tempo e memória para abrir para análise. Assim, é útil ser estratégico na forma como eles são salvos e abertos. Pode ser útil salvar uma versão de baixa qualidade que pode ser aberta mais facilmente para procurar eventos de interesse por olho.
- Se usar Fiji, crie subconjuntos menores e mais gerenciáveis de arquivos de lapso de tempo. Gerar subconjuntos por tempo (por exemplo, visualizando pilha Z completa no primeiro ponto de tempo) ou por profundidade (por exemplo, visualizando as primeiras 50 seções Z em cada ponto de tempo) clicando em Imagem| Pilhas| Ferramentas| Faça subpilha.
7. Análise quantitativa de cores clonais de imagens brainbow
- Meça os valores médios de intensidade vermelho, verde e azul (RGB) para as células de interesse em Fiji.
NOTA: Estas instruções são específicas para a análise de imagens em Fiji. No entanto, os pesquisadores podem preferir obter valores médios de intensidade de RGB em um programa de software alternativo.- Certifique-se de que o arquivo está corretamente cortado para que não haja espaço preto ao redor das bordas da imagem. O espaço negro reduzirá artificialmente as medidas de intensidade mínima necessárias para a análise. Se o arquivo precisar ser cortado, selecione o botão de seleção de retângulo e desenhe uma região de interesse (ROI) em torno do campo de exibição, excluindo todo o espaço preto. Clique em Imagem| Crop.
- Defina a ferramenta de medição para medir as medidas médias, mínimas e máximas de valor cinza. Clique em Analisar| Definir medidas. Certifique-se de que as caixas de seleção para o valor cinza Min & Max e o valor médio de cinza estão selecionados.
- Visualizando os arquivos de dados brutos ou pilhas Z subdefinidas em Fiji, encontre células de interesse para análise de cores clonais. No cérebro traseiro, clones putativos podem ser identificados visualmente por sua tonalidade compartilhada, bem como sua orientação radial. Não selecione células que estejam em contato próximo e, portanto, difíceis de resolver, células vizinhas de outra cor. Pode ser difícil quantificar sua tonalidade.
- Encontre o plano Z central da célula de interesse usando a barra de rolagem Z. Clique com o botão de seleção oval e selecione o botão de seleção elíptica. Outras ferramentas de seleção serão apropriadas para diferentes tipos de células. Desenhe um ROI elíptico ao redor do centro ~2/3 do corpo celular.
- Usando a barra de c-scrollbar,selecione o canal vermelho (dTomato). Faça a medição média de intensidade para este canal selecionando Analyze| Medida. Repita com o mesmo ROI e plano focal para os canais verde (YFP) e azul (CFP) e salve todos os valores médios de intensidade.
- Clique em qualquer lugar da imagem para remover o ROI elíptico na célula de interesse.
- Para medir os níveis de fundo para normalização, use a barra de c-scrollbar e selecione o canal vermelho (dTomato). Faça a medição de intensidade mínima para todo o campo neste canal selecionando Analyze| Medida. Repita com o mesmo plano focal para os canais verde (YFP) e azul (CFP) e salve todos os valores de intensidade mínima.
- Calcule pesos relativos do canal RGB para as células de interesse.
NOTA: O cálculo dos pesos relativos dos canais RGB a partir desses valores de intensidade pode ser realizado em uma variedade de programas de software, como o Microsoft Excel ou o R43.- Normalize a medição média da intensidade do ROI celular para cada canal subtraindo a intensidade mínima de todo o campo naquele canal e plano focal.
- Soma os valores de intensidade média rgb normalizados de cada canal para encontrar a intensidade Total normalizada de RGB para a célula.
- Calcule o peso relativo do canal para cada canal dividindo o valor de intensidade média normalizado para esse canal pela intensidade Total normalizada de RGB.
- Exibir pesos relativos do canal RGB como parcelas ternárias usando o pacote Ternary por R43,44. As parcelas ternary são úteis para visualizar o agrupamento de cores semelhantes no espaço 3D RGB.
- Calcule o coeficiente de difusão de cor para quantificar a diferença entre as cores das células.
- Calcule a distância euclidiana entre as duas cores no espaço 3D RGB usando a seguinte equação:
onde R, G e B são os pesos relativos do canal RGB calculados em 7.2. - Para facilitar a compreensão, normalize a distância de cor dividindo por ¥2, a distância máxima possível entre as cores, para obter um coeficiente de difusão de cor entre 0 e 1, onde 0 indica exatamente a mesma cor e 1 indica cores completamente diferentes (por exemplo, vermelho puro e azul puro).
- Calcule a distância euclidiana entre as duas cores no espaço 3D RGB usando a seguinte equação:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a abordagem de imagem de lapso de tempo multicolor in vivo descrita aqui. Mostramos que os clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro-zebrafish em desenvolvimento14 (Figura 1).
Tipicamente, quando as células rotuladas por Brainbow eram dispostas ao longo de uma fibra radial particular, elas compartilhavam a mesma cor(Figura 1D),que poderia ser quantificada como os pesos relativos do canal RGB(Figura 1E). Isso sugere que esses grupos radiais eram clones de células divisórias e que sua cor semelhante poderia ser usada para identificá-las como sendo clonalmente relacionadas, como observado em estudos anteriores em zebrafish, mouse e pintinho14,15. Quando a densidade de rotulagem brainbow é relativamente escassa, esta codificação de cores pode ser usada para visualizar claramente e rastrear muitos clones radiais distintos dentro de regiões proliferativas do cérebro vertebrado vivo.
Uma análise quantitativa de cores mostrou que as células filhas expressavam a mesma cor que a célula de sua mãe (progenitor)(Figura 1F),mas que os aglomerados radiais vizinhos das células podem ser distinguidos um do outro11 (Figura 1E). Isso significa que numerosos clones de células relacionadas podem ser seguidos simultaneamente ao longo de horas in vivo (Figura 2),permitindo uma análise e comparação de linhagem multiplex. A quantificação da expressão de cores em clones a 2 dpf e, em seguida, novamente em 3 dpf (Figura 2A-B) mostrou que a expressão brainbow também permaneceu relativamente constante de 2-3 dias in vivo11. As células individuais podem, assim, ser identificadas e rastreadas em tempo real por períodos relativamente longos de tempo durante o desenvolvimento.
A imagem de lapso de tempo revelou numerosas células submetidas à migração nuclear intercinética e divisão celular durante o período de 1-2 dpf (Figura 2C–F)11, permitindo o estudo do ciclo celular. Usando um intervalo de lapso de tempo de 30 min, nem sempre capturamos a figura mitótica durante a divisão celular. Isso introduziu um erro potencial de até 30 min no tempo atribuído da divisão celular. Além disso, observamos alguns clones que parecem conter duas células progenitoras (por exemplo, Figura 2F). Dentro dessas restrições, o comprimento do ciclo celular pode ser medido. Ao rastrear progenitores individuais rotulados pelo Brainbow ao longo do tempo, calculamos um ciclo celular médio de 8,4 ± 1,5 h, comparável às medidas anteriores em zebrafish1,45,46. Além disso, utilizando-se a técnica de imagem de lapso de tempo de Brainbow, também foi possível observar células individuais submetidas às alterações morfológicas estereotipadas associadas à apoptose (Figura 3)11, como o blebbing de membrana e fragmentação celular47,48.
Figura 1: Brainbow rotulou aglomerados clonalmente relacionados de células divisórias no cérebro-hindde zebrafish em desenvolvimento. (A) Esquemático de DNA hsp:Zebrabow (Brainbow) expresso transitoriamente aos clones de código de cor. (B) In vivo transmitiu imagens de luz do desenvolvimento de zebrafish a 1 e 2 dpf; setas indicam a região do cérebro auxiliar geral destinada à imagem. A translucência dos embriões é demonstrada por um micrômetro colocado abaixo de cada peixe. Linha do tempo experimental mostrando injeções em estágio de uma célula, choque térmico (HS) a 24 hpf e imagens de 1-3 dpf. (C) Vista dorsal do cérebro hindbrain de 29 hpf de zebrafish rotulado com Brainbow. O canal de luz transmitido mostrou a morfologia do cérebro e ventrículo sobrepostos com projeção de intensidade máxima de clones rotulados por Brainbow representando 165 μm. Rostral está acordado. (D) Expressão in vivo Brainbow no cérebro hind, mostrada em projeções de intensidade máxima representando 41 μm em peixes-zebra sparsamente rotulados de 51 hpf(D1), e 81 μm em 63,5 hpf zebrafish(D2). Em ambos os painéis, dorsal é para cima e rostral é para a esquerda. (E) A cor das células em D1 e D2 foi quantificada como pesos relativos de canais em parcelas ternárias correspondentes (n = 54 células E1; 461 células E2). (F) A cor celular permaneceu relativamente constante nas células filhas após a divisão celular. Série de pontos de tempo mostrando eventos mitóticos in vivo no cérebro traseiro de 29 hpf Brainbow-labeled zebrafish over 1h (F1, projeções de intensidade máxima, 30 μm de profundidade). A cor das células mãe e filha, indicada pelas caixas pretas em F1,é representada como pesos relativos do canal na trama ternária em F2. A inset mostra um zoom do mesmo enredo para mostrar cores de células bem agrupadas (M é mãe; D1 e D2 são filhas a 30 min/quadrados e 60 min/triângulos). Barras de escala = 30 μm (C), 20 μm (D1), 16 μm (D2), e 5 μm (F1). Em C, D e F, dTomato é codificado como vermelho, YFP é codificado como verde, e CFP é codificado como azul. Imagens reimpressas com permissão de Brockway et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de lapso de tempo in vivo combinada com codificação de cores Brainbow distinguiu múltiplos clones vizinhos de células submetidas à migração e divisão nuclear intercinética. (A) Aglomerados radiais codificados por cores rotulados no cérebro traseiro de um peixe expressando Brainbow a 2 dpf (55 hpf; A1) e 3 dpf (71 hpf; A2); projeções de intensidade máxima representando 62 μm e 47 μm, respectivamente. Três aglomerados radiais codificados por cores são identificados com pontas de seta em cada ponto de tempo. (B) A cor de todas as células rotuladas por Brainbow em A1 e A2 foi quantificada como pesos relativos de canais nas parcelas ternárias correspondentes em B1 e B2 (n = 106 células, 119 células). (C) Cérebro-traseiro de zebrafish a 35 hpf rotulado com Brainbow (projeção de intensidade máxima mostrando 24 μm); entrada indicada com caixa branca tracejada é o primeiro ponto exibido em D. (D) Série de pontos de tempo tomadas em intervalos de 30 minutos no cérebro traseiro de C. Um período de >9,5 h é mostrado. As células rotuladas sofreram migração nuclear intercinética; pontas de flecha brancas indicam uma célula na superfície apical. Arredondando a soma celular na superfície apical e um aumento correspondente no número de clones (por exemplo, célula vermelha a 5,5 h e depois 8 h) foi considerado um evento mitótico. (E) Visão dorsolateral do cérebro-zebrafish a 30,5 hpf rotulado com Brainbow, onde a linha branca tracejada e pontilhada mostra o limite aproximado da cabeça, e a caixa de traços brancos indica o inset mostrado no primeiro ponto de tempo de F. (F) Série de pontos de tempo tomadas em intervalos de 30 minutos no cérebro traseiro de E. Durante um período de 1,5 h, duas células azuis indicadas pelas pontas de flecha brancas puderam ser observadas movendo-se para a superfície apical e submetidas à mitose, sugerindo um clone contendo duas células progenitoras. Barra de escala = 20 μm (A), 25 μm (C) e 20 μm (F). Em A-D, dorsal é para cima e rostral é para a esquerda. Em E e F, rostral é para a esquerda. Em todas as imagens, dTomato é codificado como vermelho, YFP é codificado como verde, e CFP é codificado como azul. Imagens reimpressas com permissão de Brockway et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem de Brainbow com lapso de tempo mostra que as células da zona ventricular sofrem morte celular in vivo. (A) Cérebro traseiro de zebrafish a 31 hpf rotulado com Brainbow (projeção de intensidade máxima representando 36 μm). A caixa de traços brancos indica entrada mostrada no primeiro ponto de tempo em B.(B) Série de pontos de tempo mostrando hindbrain em A em intervalos de 30 minutos. A ponta de seta branca no primeiro painel mostra uma célula de lavanda que sofreu apoptose como mostrado em painéis subseqüentes, indicada pela fragmentação celular seguida pelo despejo gradual de corpos apoptóticos. As células rotuladas vizinhas pareciam saudáveis por toda parte. Dorsal está para cima e rostral é para a esquerda. Barra de escala = 20 μm (B). Em todas as imagens, dTomato é codificado como vermelho, YFP é codificado como verde, e CFP é codificado como azul. Imagens reimpressas com permissão de Brockway et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo descreve um método para visualizar clones de células progenitoras e neurônios no cérebro-zebrafish em desenvolvimento e segui-los in vivo usando Brainbow e microscopia confocal de lapso de tempo11. A principal vantagem deste protocolo em comparação com estudos in vitro ou ex vivo é a capacidade de observar diretamente a zona proliferativa do cérebro vertebrado em seu meio natural ao longo do tempo. Esta técnica baseia-se em estudos anteriores que rotularam um único clone usando vetores retrovirais. Em contraste, o uso do hsp:Zebrabow construir códigos de cores muitos clones simultaneamente, permitindo rastreamento de linhagem multiplex e um foco na dinâmica entre os clones11. Este protocolo pode ser modificado para focar no desenvolvimento em outros sistemas ou tipos de células. Por exemplo, diferentes construções brainbow podem ser expressas em embriões de zebrafish. O uso do promotor de zebrafish hsp70 em hsp:Zebrabow resultará na rotulagem de mosaico de uma variedade de tipos de células após o choque térmico, incluindo progenitores neurais e neurônios11, e dá aos pesquisadores controle temporal sobre a expressão genética29. Deve-se notar que o uso do promotor de choque térmico rotula consistentemente clones codificados por cores, enquanto outros promotores podem não delinear claramente a linhagem celular desta maneira. Quando a identidade clonal não é um fator de interesse, construções utilizando outros promotores podem ser usadas para rotular tipos de células específicas. Por exemplo, o promotor neuroD pode ser usado para rotular neurônios imaturos18,49. Além disso, em vez de realizar microinjeções, os pesquisadores podem optar por utilizar zebrafish brainbow transgênicos, incluindo linhas como Tg (ubi:Zebrabow)15 e Tg (neurod:Zebrabow)18. Neste caso, cruza para linhas que expressam Cre recombinase, como Tg(hsp:Crea134)15, produzem embriões não injetados que são coletados e mantidos de forma semelhante. Embora este protocolo seja projetado para imagem de peixes entre 1-3 dpf, a fim de coincidir com o período principal de neurogênese do desenvolvimento50, zebrafish pode ser mantido por mais tempo dependendo do estágio de desenvolvimento de interesse. No entanto, o choque térmico para induzir a expressão de Brainbow antes de 24 hpf pode ser mais prejudicial para os embriões51. Dependendo da idade e do tecido de interesse, diferentes estratégias de montagem serão apropriadas para ter o tecido direcionado orientado corretamente.
Há uma série de etapas que podem exigir solução de problemas, em particular se forem feitas modificações no protocolo. A concentração de DNA, tamanho de bolus injetado e quantidade total de DNA entregue por embrião pode ser ajustada se a expressão de Brainbow for fraca ou esparsa ou se os embriões não parecerem saudáveis. Além disso, o comprimento e o tempo da etapa de choque térmico podem ser modificados se a expressão desejada não for alcançada. Os parâmetros de aquisição utilizados na imagem variam dependendo das linhas de laser e filtros disponíveis, bem como do brilho da expressão, montagem e tipo de análise desejada. Além disso, os parâmetros de lapso de tempo devem ser ajustados dependendo da velocidade dos eventos de interesse e da necessidade de adquirir uma única pilha Z. Um dos passos mais críticos do protocolo é a montagem adequada do peixe em agarose: se o ângulo do peixe é inadequado ou se o peixe está coberto por muita agarose, a imagem ideal não será possível. Otimizar essa técnica pode levar alguma prática. Além disso, muitas vezes é útil montar vários peixes antes da imagem, pois pode ser difícil determinar se a montagem é apropriada antes de ver a expressão fp no próprio microscópio confocal. Um passo crítico adicional é a triagem e seleção dos peixes específicos a serem capturados. Se realizar microinjeções, brilho, densidade de rotulagem e número de cópia do Brainbow podem variar significativamente entre os peixes. Imagens tiradas em peixes com rotulagem fraca, rotulagem excessivamente densa ou um número de cópia baixo, resultando em poucas cores, podem ser mais difíceis de analisar.
Com este protocolo, conseguimos visualizar continuamente zebrafish vivos até 16 h11. Este tempo pode ser limitado pela evaporação E3 da câmara de imagem, crescimento do peixe para fora do plano de imagem, morte ou movimento do peixe, ou restrições do usuário no tempo de microscópio confocal. A evaporação pode ser diminuída pelo uso de um acessório controlado pela temperatura no estágio do microscópio. Deve-se notar que os conjuntos de dados 5D gerados usando essa abordagem tendem a ser arquivos grandes que requerem espaço significativo no disco rígido (por exemplo, até ~100 GB para um lapso de tempo durante a noite) e poder de computação adequado para analisar.
Este protocolo orienta os pesquisadores a visualizar clones codificados por cores dentro de uma população de progenitores neurais e neurônios filhas no cérebro de zebrafish em desenvolvimento e rastrear sua dinâmica ao longo do tempo. Uma possível expansão é a combinação de imagem de lapso de tempo brainbow com marcação FP muito vermelha para avaliar os papéis de genes específicos no desenvolvimento18. Desta forma, clones que expressam genes manipulados podem ser visualizados em uma cor distinta, rastreados ao longo do tempo, e comparados com clones vizinhos não manipulados por Brainbow. A imagem multicolorida in vivo pode ser usada para abordar questões mecanicistas importantes sobre como o sistema nervoso se forma e funciona.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet e Z. Tobias por contribuições técnicas e intelectuais. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (Prêmio 1553764) e pelo M.J. Murdock Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL transfer pipette (fine tip) | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5 mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 42 °C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28 °C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al.
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S.
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B.
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
