Summary
Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.
Abstract
Lipidler suda çözünmez yapısal olarak çeşitli amphipatik moleküllerdir. Lipidler biyolojik membranların organizasyonu ve işlevi, enerji depolama ve üretimi, hücresel sinyalizasyon, proteinlerin veziküler taşınması, organel biyogenezi ve düzenlenmiş hücre ölümü için temel katkıda bulunmaktadır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kapsamlı moleküler analizler için tek hücreli ökaryot münasip olduğundan, model bir organizma olarak kullanımı ökaryotik hücreler içinde karmaşık biyolojik süreçlere lipid metabolizması ve hücre içi taşıma bağlayan mekanizmaları ortaya çıkarmak yardımcı oldu. Bir maya hücresi içindeki büyük lipid sınıflarının sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirilmesi için çok yönlü bir analitik yöntemin bulunması, bu mekanizmalar hakkında derin bilgiler elde etmek için çok önemlidir. Burada S. cerevisiae'nin majör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisi kullanmak için bir protokol salıyoruz. Açıklanan LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. 10 lipid sınıfının her birinde çok sayıda türün (farklı izobarik veya izometrik formlar dahil) tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlar. Bu yöntem hassastır ve bazı lipid türlerinin 0,2 pmol/μL gibi düşük konsantrasyonlarda tanımlanmasına ve sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Yöntem başarıyla tüm maya hücreleri ve saflaştırılmış organellerin lipidomların değerlendirilmesi için uygulanmıştır. Bu yöntemde elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi için alternatif mobil faz katkı larının kullanılması bazı lipid türleri için iyonlaşma verimliliğini artırabilir ve bu nedenle bunların tanımlanması ve nicelliği artırmak için kullanılabilir.
Introduction
Bir kanıt gövdesi, biyomoleküllerin ana sınıflarından biri olan lipidlerin ökaryotik hücre içindeki birçok hayati süreçte önemli roller oynadığını göstermektedir. Bu süreçler arasında hücre organlarını çevreleyen plazma membran ve membranlar oluşturan lipid iki tabakalarının biraraya edilmesi, küçük moleküllerin hücre zarları arasında taşınması, hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt ve hücre içi sinyal iletimi, enerjinin üretimi ve depolanması, farklı organellere hapsedilmiş proteinlerin ithalat ve ihracatı, endmembran sistemi ve protein salgılanması içinde proteinlerin vesiküler ticareti ve düzenlenmiş hücre ölümü çeşitli modları1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Tomurcuklanan maya S. cerevisiae, tek hücreli ökaryotik organizma, başarıyla bu hayati hücreselsüreçlerdelipidlerin temel rolleri altında yatan mekanizmaların bazılarını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Kapsamlı biyokimyasal, genetik, hücre biyolojik, kimyasal biyolojik, sistem biyolojik ve mikroakışkan diseksiyon analizleri21,22,23,24,25münasip olduğu için S. cerevisiae bu mekanizmaları ortaya çıkarmak için değerli bir model organizmadır. Lipid metabolizması ve hücre içi taşımanın bu hayati hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaları anlamada daha fazla ilerleme, hücresel lipidomun kantitatif karakterizasyonu, lipidom moleküler karmaşıklığınınanlaşılması ve kantitatif lipidomiklerin sistemlerin çok disiplinli platformuna entegre edilmesi için hassas kütle spektrometresi teknolojileri gerektirir. 27,28,29,30.
Maya hücrelerinin ve diğer ökaryotik organizmaların hücrelerinin kütle spektrometresi destekli nicel lipidomikler için mevcut yöntemler yeterince çok yönlü, sağlam veya hassas değildir. Ayrıca, bu şu anda kullanılan yöntemler birbirinden çeşitli izobarik veya izzosik lipid türleri ayırt etmek mümkün değildir. Burada, S. cerevisiae'ninmajör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisinin kullanımına olanak tanıyan çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntemi tanımlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya kültüriçin steril ortam hazırlanması
- % 1 (w / v) maya ekstresi ve% 2 (w / v) bactopeptone içeren tam bir YP orta 90 mL hazırlayın.
- 90 mL sentetik minimal YNB ortamı içeren 0.67% (w/v) amino asitler olmadan maya azot baz, 20 mg /L -histidin, 30 mg/L L-l -l -lösin, 30 mg/L -l -lizin ve 20 mg/L urasil hazırlayın.
- Tam YP ortamının 90 mL'sini eşit olarak 250 mL Erlenmeyer şişesine (yani her biri 45 mL) bölün.
- Sentetik minimal YNB ortamının 90 mL'sini 250 mL Erlenmeyer şişesine (yani her biri 45 mL) bölün.
- Kullanımdan önce 45 dk için 15 psi/121 °C'de YP ve YNB ortamlı şişeleri otomatik olarak tökezle.
2. Maya zorlanma
- Yabani tür suşu kullanın BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Glikoz ile tam YP ortamda maya culturing
- Otoklav kullanmadan önce 45 dakika için 15 psi/121 °C glikoz% 20 (w / v) stok çözeltisi.
- Steril YP ortamını içeren iki Erlenmeyer şişesinin her birine %20 glukoz (w/v) stok çözeltisinin 5 mL'sini ilave edin ve %2'lik glikoz (w/v) konsantrasyonu için ekleyin.
- Glukozlu YP ortamını içeren iki Erlenmeyer şişesinin her birine yabani tip BY4742'deki hücreleri aşılamak için mikrobiyolojik bir döngü kullanın.
- Kültür 200 rpm de dönme sallayarak 30 °C'de bir gecede hücreleri.
- Maya kültüründen bir aliquot alın. Kültürün mL başına maya hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın.
4. Mayanın glikoz ile sentetik minimal YNB ortamına aktarılması ve kültüre geçirilmesi
- Steril YNB ortasını içeren iki Erlenmeyer şişesinin her birine %20'lik steril %20 (w/v) glukoz çözeltisinin 5 mL'sini ilave edin ve %2'lik glikoz (w/v) konsantrasyonuna ekleyin.
- Glukozlu YNB ortamını içeren iki Erlenmeyer şişesinin her birine toplam 5,0 x 107 hücre içeren gecelik maya kültürünün bir hacmini aktarmak için steril bir pipet kullanın.
- Kültür hücreleri en az 24 saat (veya daha fazla, deney gerektiriyorsa) 30 °C'de dönme sallayarak 200 rpm.
5. Lipid ekstraksiyonu için reaktifler, labware ve ekipman hazırlanması
- Aşağıdakileri hazırlayın: 1) yüksek dereceli (>99.9%) kloroform; 2) yüksek dereceli (>99.9%) metanol; 3) Nano saf suda %28 (v/v) amonyum hidroksit çözeltisi; 4) cam boncuk (asit yıkanmış, 425-600 μM); 5) uygun adaptör ile bir girdap; 6) Politetrafloroetilen kaplı kapaklı 15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpler; 7) 17:1 ve 2:1 kloroform ve metanol karışımları; 8) bir kloroform / metanol (2:1) karışımı ile 0.1% amonyum hidroksit (v / v); 9) ABC çözeltisi (155 mM amonyum bikarbonat, pH = 8.0); 10) Tablo 1'debelirtildiği gibi kloroform ve metanol karışımında hazırlanan iç lipid standartlarının karışımı; ve 11) hücresel lipidlerin çıkarılması için politetrafloroetilen kaplı kapaklı 2 mL cam numune şişeleri.
6. LC için reaktifler, laboratuvar eşyaları ve ekipmanların hazırlanması
- Aşağıdakileri hazırlayın: 1) asetonitril/2-propanol/nano-saf su (65:35:5) karışımı; 2) uygun adaptör ile bir girdap; 3) bir ultrasonik sonicator; 4) bir kuyu plakası için ekler ile cam şişeleri; 5) bir LC sistemi bir ikili pompa, gaz giderici ve bir autosampler ile donatılmıştır; 6) bir C18 ters faz sütun (2.1 mm; 75 mm; gözenek boyutu 130 Å; pH aralığı 1-11) bir ön kolon sistemi ile birleştiğinde; 7) karışım A: asetonitril/su (60:40); ve 8) karışım B: isopropanol/asetonitil (90:10).
7. Maya hücrelerinden lipid çıkarma
- Maya kültüründen bir aliquot alın. Kültürün mL başına toplam maya hücresi sayısını belirlemek için hemositometre kullanın veya OD600 ölçün.
- Toplam 5,0 x 107 hücre (3,3 birim OD600)içeren maya kültürü hacmi alın. Kültür bu hacmini önceden 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin.
- 4 °C'de 1 dk için 16.000 x g'de hücreleri santrifüj ile hasat edin. Supernatant atın.
- 1,5 mL buz gibi nano saf su ekleyin ve 4 °C'de 1 dk için 16.000 x g'de hücreleri santrifüj ile yıkayın. Supernatant atın.
- 1,5 mL buz gibi ABC çözeltisi ekleyin ve hücreleri 16.000 x g'de 4 °C'de 1 dk santrifüj ile yıkayın. Supernatant atın. Hücre peleti lipid ekstraksiyonundan önce -80 °C'de saklanabilir.
- Lipid ekstraksiyonuna başlamak için, hücre peletini buz üzerinde eritin.
- Hücre peletini 200 μL buz gibi nano saf suda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 15 mL yüksek mukavemetli cam vida üst santrifüj tüpe aktifatın ve politetrafloroetilen kaplı kapaklı. Bu tüpe aşağıdakileri ekleyin: 1) Kloroform/metanol (2:1) karışımında hazırlanan iç lipid standartlarının karışımının 25 μL'si; 2) 100 μL 425-600 μM asit lekaplı cam boncuklar; ve 3) 600 μL kloroform/metanol (17:1) karışımı.
- Vortex yüksek hızda tüp için 5 dakika oda sıcaklığında (RT) hücreleri bozmak için.
- Lipidlerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için RT'de 1 saat düşük hızda tüp girdap.
- Protein çökeltme ve sulu ve organik fazların birbirinden ayrılmasını teşvik etmek için 15 dakika boyunca buz üzerinde numune kuluçkaya yatırın.
- 3.000 x g'de bir klinik santrifüjde tüpü 5 dk RT'de santrifüj edin. Bu santrifüj adımı alt organik faz üst sulu faz ayırmak için izin verir, hangi tüm lipid sınıfları içeren.
- Alt organik fazı (~400 μL) politetetrafloroetilen kaplı kapaklı başka bir 15 mL yüksek mukavemetli cam vida üst santrifüj tüpe aktarmak için borosilikat cam pipet kullanın. Bu transfer sırasında cam boncukları veya üst sulu fazı bozmayın. Azot gazı akışı altında alt organik faz tutun.
- Sfingolipidler ve PA, PS, PI ve CL. Vortex tüp kuvvetle 5 dakika RT için ekstraksiyon sağlamak için kalan üst sulu faza kloroform-metanol (2:1) karışımı 300 μL ekleyin.
- 3.000 x g'de bir klinik santrifüjde tüpü 5 dk RT'de santrifüj edin.
- Santrifüjden sonra oluşan alt organik fazı (~ 200 μL) 7.13 adımda toplanan organik faza aktarmak için borosilikat cam pipet kullanın.
- Kombine organik fazlarda çözücü buharlaştırmak için azot gazı akışını kullanın. Azot gazı akışı altında lipid film içeren tüpleri kapatın. Bu tüpleri -80 °C'de saklayın.
8. Çıkarılan lipidlerin LC ile ayrılması
- Adım 7.16'da elde edilen lipid filmini içeren bir tüpe 500 μL asetonitril/2-propanol/nano-saf su (65:35:5) karışımı ekleyin. Girdap rt 10 s için tüp 3x.
- 15 dk. Vortex RT 10 s için tüp 3x için ultrasonik sonication için tüp içeriği tabi.
- Tüpten 100 μL numune alın ve bir kuyu plakası için kullanılan bir kesici uçla birlikte cam bir şişeye ekleyin. Kuyu plakası içine pacing önce eklemek hava kabarcıkları ortadan kaldırın.
- Ters fazlı C18 sütuncsh CSH üzerinde farklı lipid türlerini ayırmak için bir LC sistemi kullanın ve bir ön sütun sistemine birleştiğinde (bkz. Malzeme Tablosu). Ayırma sırasında, kolon55 °C'de ve 0,3 mL/dk akış hızında tutun. Numuneyi RT'deki kuyu plakasında tutun.
- A (asetonitril/su [60:40 (v/v)]) ve B karışımından (izopropanol/asetonitril [90:10 (v/v)]) karışımından oluşan mobil fazları kullanın. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyon kaynağı kullanılarak oluşturulan ana iyonların algılanmasının olumlu bir modu için ESI (+) modu, mobil fazlar A ve B 10 mM'lik son konsantrasyonda amonyum formatı içerir. Ana iyonların algılanmasının negatif modu olan ESI (-) modu için, mobil fazlar A ve B 10 mM'lik son konsantrasyonda amonyum asetat içerir.
- Hem ESI (+) hem de ESI (-) moduna enjeksiyon için 10 μL'lik bir numune hacmi kullanın.
- Aşağıdaki LC gradyanı kullanarak LC ile ayrı farklı lipid türleri: 0-1 dk% 10 (faz B); 1-4 dk %60 (B fazı); 4-10 dk %68 (B fazı); 10-21 97% (faz B); 21-24 dk %97 (B fazı); 24-33 dk %10 (faz B).
- Çıkarma boşluklarını ilk örnek olarak, her dört örnek arasında ve son örnek olarak çalıştırın. Verileri normalleştirmek için arka planı çıkarın.
- Yabani tip BY4742 hücrelerinden elde edilen lipidlerin LC/MS verilerinden temsili toplam iyon kromatogramı Şekil 1'degösterilmiştir.
9. LC ile ayrılan lipidlerin kütle spektrometrik analizi
- LC ile ayrılmış lipidleri analiz etmek için HESI (ısıtmalı elektrosprey iyonizasyonu) iyon kaynağı ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanın. Tablo 2'desağlanan ayarları kullanın.
- Ana iyonları (MS1) 60.000 çözünürlükte ve 150-2.000 Da kütle aralığında algılamak için Fourier transformatör analizörünü kullanın.
- İkincil iyonları (MS2) algılamak için Tablo 3'te sağlanan ayarları kullanın.
10. LC-MS/MS ham verilerin işlenmesi ile farklı lipid sınıflarının ve türlerinin tanımlanması ve ölçülmesi
- Ham LC-MS/MS dosyalarından farklı lipitlerin tanımlanması ve ölçülmesi için yazılım için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu yazılım, 1,5 milyondan fazla lipid iyon öncüleri (MS1) ve öngörülen parça iyonlarını (MS2) içeren en büyük lipid veritabanını kullanır. Yazılım ayrıca lipid kantitasyonu için MS1 zirveleri ve lipid tanımlama için MS2 kullanır. Aynı m/z değerine sahip ancak farklı bekletme sürelerine sahip iki izobik fosfatidilserin formunun (34:0) temsili kromatogramı ve MS1 ve MS2 spektrumları Sırasıyla Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4'tegösterilmiştir.
- Arama LC-MS ham dosyaları tam tarayabilir MS1 veri ve veri bağımlı MS2 veri içeren ücretsiz (estersiz) yağ asitleri (FFA), kardiyolipin (CL), fitoseramid (PHC), fitosfingosinin (PHS), fosfatidilkolin (PC), fosfatidylethan olamofi (PE), fosfatidilgliserin (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserin (PS) ve triasilgliserol (TAG) lipid sınıfları kullanarak 5 ppm öncül iyonları için ppm ve ürün iyonları için 10 ppm. Diğer arama parametreleri Tablo 4'tegösterilmiştir. Yazılım kullanım kılavuzunda verilen yönergeleri izleyin. Olağandışı yağ asidi bileşimi ile iç lipid standartları ve lipid türlerinin kimlikleri elle doğrulanması gerekir.
- Lipid Arama yazılımı için serbestçe kullanılabilen açık kaynak alternatifleri yardımıyla farklı lipid sınıflarını ve türlerini belirlemek ve onları belirlemek için, LC-MS/MS'den gelen ham verileri işlemek için Lipid Veri Analizörü(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine 2(http://mzmine.github.io/)veya XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)yazılımını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LC-MS/MS yardımı ile bir maya hücresi içindeki majör hücresel lipidlerin nicel değerlendirilmesi için yöntemimiz çok yönlü ve sağlamdı. Başlangıçta %2 glikoz içeren sentetik minimal YNB ortamda yetiştirilen S. cerevisiae hücrelerinde 10 farklı lipid sınıfını tanımlamamızı ve ölçmemizi sağladı. Bu lipid sınıfları serbest (estersiz) yağ asitleri (FFA), CL, fitoseramid (PHC), fitosfingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS ve TAG(Ek Tablo 1)içerir. Bu sınıfların her birinin çok sayıda moleküler türü bu LC-MS/MS yöntemi kullanılarak tanımlanmış ve ölçüldü(Ek Tablo 1).
LC-MS/MS yöntemimiz de hassastı. Gerçekten de, 0,165 pmol/μL gibi düşük konsantrasyonlarda lipidlerin moleküler türlerinin tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlamıştır (Tablo 5'tekifitoseramid verilerine bakınız). Bu nicel sınır, çok çeşitli konsantrasyonlarda farklı lipid sınıfları için farklılık gösterir(Tablo 5).
Daha da önemlisi, yöntemimiz farklı izobarik veya izzorik lipid formlarının tanımlanmasına ve ölçülmesine olanak sağladı. Lipidlerin izobarik formları aynı nominal kütleye sahip lipid türleridir (yani. en bol izotopların kütlelerinin toplamı) ancak farklı tam kütleleri31. Lipidlerin isomerik formları aynı moleküler formüle sahip lipid türleridir ancak farklı kimyasal yapıya sahiptir31. Örneğin, PHC (16:0_26:0) ve izobarik lipid türleri PC (16:0_10:0) arasında ayrım yapılan LC-MS/MS yöntemimizin kullanımı: 650 nominal kütle değeri aynı olmasına rağmen, tam kütleleri sırasıyla 650.6457 ve 650.4755'tir. Ayrıca, bu LC-MS/MS yöntemi aynı moleküler formüle sahip iki çift isomeric lipid türü ancak farklı kimyasal yapı: 1) PC (18:0_18:1) ve PC (20:0_16:1), moleküler formülü (C44H87N1O8P1) ve tam kütle (788.6163); ve 2) PE (16:0_16:0) ve PE (14:0_18:0), moleküler formülü (C37H75N1O8P1) ve tam kütle (692.5224) ile.
LC-MS/MS metodumuz tüm sınıfların lipidleri için iyonlaşma nın verimliliğini artırmak için kullanılabilir, böylece majör hücresel lipidlerin tanımlanması ve sayısallaştırılması nı artırır. Bu gelişme, ESI MS için alternatif mobil faz katkı maddeleri kullanılarak sağlanabilir (Tablo 6). Bu alternatif aşamaları amonyum formatı, formik asit ile amonyum formatı, amonyum asetat, asetik asit ile amonyum asetat, ve formik asit ile amonyum asetat içerir. Bu alternatif mobil faz katkılarının her biri hem normal faz lı hem de ters fazlı LC sütunları için kullanılabilir(Tablo 6).
LC-MS/MS yöntemimizin bir diğer avantajı da, lipidlerin prekürsör iyonlarının (MS1) MS2 ürünlerine parçalanması için iki farklı yöntem kullanabilmektir. Bu iki yöntem yüksek enerjili çarpışma dissociation (HCD) ve çarpışma kaynaklı dissociation (CID)32. MS'in ESI (-) modu için amonyum asetat mobil faz katkısı ile birlikte kullanıldığında CID yönteminin faydalı olduğunu bulduk, bu koşullar altında PHC, CL, FFA, PE, PG, PI ve PS için MS2 ürünlerine MS1 lipid iyon parçalanmasının etkinliğinin artmasına olanak sağladığı için(Tablo 7). Buna karşılık, MS'in ESI (+) modu için amonyum formatmobil faz katkısı ile birlikte kullanıldığında HCD yöntemi uygundur, çünkü bu koşullar altında MS1 lipid iyon parçalanmasının PC, PHS ve TAG için MS2 ürünlerine veriminin artırılmasını sağlar(Tablo 8).
Şekil 1: Yabani tip by4742'deki hücrelerden çıkarılan lipidlerin sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC/MS) verilerinden elde edilen toplam iyon kromatogramı (TIC). LC tarafından ters fazlı csh C18 sütununda ayrılan ve negatif elektrosprey iyonizasyon modu kullanılarak oluşturulan ana iyonların MS tarafından saptanan lipitlerin TIC'i. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 762.5294 m/z değerine (M-H) sahip, ancak 7,65 dk ve 8,49 dk'lık farklı tutma sürelerine sahip iki izzosi fosfatidilserin formunun (34:0) kromatogramı. Lipidler yabani tip suşu BY4742 hücrelerinden çıkarıldı ve bir ters faz sütun CSH C18 sıvı kromatografi ile ayrıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 762.5294 m/z değerine (M-H) sahip, ancak 7,65 dk ve 8.49 dk farklı tutma sürelerine sahip iki izobik fosfatidilserin türünün (34:0) MS1 spektrumları. Lipidler, ters fazlı csh C18 sütununda sıvı kromatografi ile ayrılan (Şekil 2'degösterildiği gibi) yabani tip BY4742'deki hücrelerden çıkarıldı ve negatif elektrosprey iyonizasyon modu kullanılarak oluşturulan ebeveyn (MS1) iyonlarının kütle spektrometresi ile saptandı. (A) 762.5294 m/z değeri (M-H) ve 7,65 dk tutma süresi ile fosfatidilserin formun MS1 spektrumu (34:0). (B) 762.5294 m/z değeri (M-H) ve 8,49 dk. tutma süresi ile fosfatidilserin formun MS1 spektrumu (34:0) bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: 762.5294 m/z değerine (M-H) sahip, ancak 7,65 dk ve 8.49 dk farklı tutma sürelerine sahip iki izobik fosfatidilserin türünün (34:0) MS2 spektrumları. Lipidler, ters fazlı csh C18 sütununda sıvı kromatografi ile ayrılan (Şekil 2'degösterildiği gibi) yabani tip BY4742'deki hücrelerden çıkarıldı ve MS1 iyonlarının kütle spektrometresi ile saptandı (Şekil 3'tegösterildiği gibi). İkincil iyonlar (MS2) daha sonra kütle spektrometresi ile saptanır. (A) 762.5294 m/z değeri (M-H) ve 7,65 dk tutma süresi ile fosfatidilserin formun MS2 spektrumu (34:0). Serin moiety kaybı 675.6149 m / z değeri (M-H) ile bir iyon üretti. (B) 762.5294 m/z değeri (M-H) ve 8,49 dk tutma süresi ile fosfatidilserin formun MS2 spektrumu (34:0). Serin moiety kaybı 675.8843 m / z değeri (M-H) ile bir iyon üretti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Algılama modu | Lipid sınıfı | Hidrofobik kuyruk bileşimi | Hesaplanan m/z değeri | Konsantrasyon (pmoles/μl) |
| Negatif | Ceramide | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negatif | Kardiyolipin | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negatif | Serbest yağ asidi | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negatif | Fosfatiddentanolamin | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negatif | Fosfatidilgliserin | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negatif | Fosfatidilinernositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negatif | Fosfatidilserin | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Pozitif | Fosfatidilkolin | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Pozitif | Fitosfingosin | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Pozitif | Triasilgliserin | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tablo 1: İç lipid standartlarının bir karışımının bileşimi. İç lipid standartları kloroform/metanol (2:1) karışımında hazırlandı. Algılama modu, elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyon kaynağı ile donatılmış bir Orbitrap Velos Kütle Spektrometresi kullanılarak ebeveyn iyonlarının pozitif veya negatif olarak algılanması anlamına gelir. Hesaplanan m/z değerleri lipidlerin adducts içindir.
| FTMS + p çözünürlük | 60000 |
| Kütle aralığı (dalton) | 150-2000 |
| Iyon kaynak türü | HESI |
| Kılcal damar sıcaklığı (°C) | 300 |
| Kaynak ısıtıcı sıcaklığı (°C) | 300 |
| Kılıf gaz akışı | 10 |
| Aux gaz akışı | 5 |
| Pozitif polarite gerilimi (kV) | 3 |
| Negatif polarite gerilimi (kV) | 3 |
| Kaynak akımı (μA) | 100 |
Tablo 2: Orbitrap Velos Kütle Spektrometresi'nin LC ile ayrılan lipitleri analiz etmek için kullandığı ayarlar. Kısaltmalar: FTMS + p = ESI (+) modunda Fourier transformes bazlı kütle spektrometresi; HESI = ısıtmalı elektrosprey iyonizasyonu.
| Enstrüman polaritesi | Pozitif | Negatif |
| Etkinleştirme türü | Yüksek enerjikaynaklı-çarpışma-dissociasyon | Çarpışmaya bağlı-dissociation |
| Minimum sinyal gerekli | 5000 | 5000 |
| İzolasyon genişliği | 2 | 2 |
| Normalleştirilmiş çarpışma enerjisi | 55 | 35 |
| Varsayılan ücret durumu | 2 | 2 |
| Etkinleştirme süresi | 0.1 | 10 |
| FTMS + C çözünürlüğü | 7500 | |
| ms/ms için en yoğun 5 zirve seçildi |
Tablo 3: Orbitrap Velos Kütle Spektrometresi'nin ikincil iyonları (MS2) tespit etmek için kullandığı ayarlar. Kısaltma: FTMS + C = ESI (+) modunda Fourier transformes bazlı kütle spektrometresi.
| Kimlik | |
| Veritabanı | Orbitrap |
| Tepe algılama | Geri çekme izotopu (ON) |
| Arama seçeneği | Ürün arama Orbitrap |
| Arama türü | Ürün |
| Deney türü | LC-MS |
| Öncül tolerans | 10 sayfa |
| Ürün toleransı | Yüksek enerji kaynaklı-çarpışma-dissociation [ESI (+) modu]: 20 ppm |
| Çarpışmaya bağlı-dissosilasyon [ESI (-) modu]: 0,5 Dalton | |
| Sayısallaştırma | |
| Nicelliği yürütme | -ını |
| m/z toleransı | -5.0; +5.0 |
| Tolerans türü | Ppm |
| Filtre | |
| Üst sıra filtresi | -ını |
| Ana düğüm filtresi | Ana izomer tepe |
| m-puan eşiği | 5 |
| c-puan eşiği | 2 |
| FFA önceliği | -ını |
| Kimlik kalitesi filtresi | C: Lipid sınıfı ve tüm yağ asitleri tamamen tanımlanır |
| B: Lipid sınıfı ve bazı yağ asitleri tanımlanır | |
| C: Lipid sınıfı veya FA tanımlanır | |
| D: Lipid diğer parça iyonları ile tanımlanan (H2O, vb) | |
| Lipid Sınıfı | |
| Yüksek enerji kaynaklı-çarpışma-dissociation [ESI (+) modu] | PC, ETIKET |
| Çarpışmaya bağlı-dissociation [ESI (-) modu] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Iyon | |
| Yüksek enerji kaynaklı-çarpışma-dissociation [ESI (+) modu] | + H; + NH4; + Na |
| Çarpışmaya bağlı-dissociation [ESI (-) modu] | - H; - 2H; - HCOO |
Tablo 4: Lipid Tanımlama yazılımı "Lipid Search" (V 4.1) yardımıyla farklı lipid sınıflarını ve türlerini tanımlamak için kullanılan arama parametreleri. Kısaltmalar: CER = ceramide; CL = kardiyolipin; FFA = serbest (estersiz) yağ asidi; PC = fosfatidilkolin; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidilgliserin; PI = fosfatidillinositol; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserin.
Tablo 5: LC-MS/MS yöntemimiz yardımıyla farklı lipid sınıflarının moleküler türlerinin en düşük konsantrasyonları saptanabilir ve ölçülebilen en düşük konsantrasyonlarıdır. Her lipid sınıfı için en düşük ölçülebilir konsantrasyon tahmini, iç standardı için MS tepe alanlarına (bu MS pik alanları ve lipid standart konsantrasyonları kalın olarak görüntülenir) ve temsili moleküler formu en düşük saptanabilir konsantrasyonda bulunur. Veriler, her biri üç teknik çoğaltma gerçekleştirilen iki bağımsız denemenin ortalama değerleri olarak sunulur. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
| Lipid standardı | ESI modu | Amf | AmF/FA | Amac | Amac/AA | Amac/FA |
| PHC | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Sayfa | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Etiket | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tablo 6: ESI MS için alternatif mobil faz katkı maddelerinin farklı sınıflardaki lipidler için iyonlaşmanın etkinliği üzerindeki etkileri. Ters fazlı sıvı kromatografi silik kromatografi ile farklı lipidler birbirinden ayrıldı. Farklı lipid sınıflarına ait ticari lipid standartları Tablo 1'deverilmiştir. MS için farklı mobil faz katkı maddeleri varlığında ESI (-) veya ESI (+) iyonizasyon modu kullanılmıştır. Her lipid standardı için iyonizasyon yüzdesi üç teknik çoğaltmadan ortalama değer olarak gösterilir. Her lipid için iyonizasyon yüzdesi MS pik bölgesine göre hesaplandı. Her lipid için en yüksek iyonlaşma verimliliği bir değer kalın görüntülenir. Kısaltmalar: AmF = amonyum formatı; AmF/FA = formik asitli amonyum formatı; AmAc = amonyum asetat; AmAc/AA = asetik asit ile amonyum asetat; AmAc/FA = formik asitli amonyum asetat; CL = kardiyolipin; FFA = serbest (estersiz) yağ asidi; PC = fosfatidilkolin; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidilgliserin; PHC = fitoseramid; PHS = fitosfingosin; PI = fosfatidillinositol; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserin.
| Lipid standardı | ESI modu | Amf | Amac |
| PHC | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Sayfa | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Etiket | + | 65.7 | 69.7 |
Tablo 7: Çarpışmaya bağlı dissosilasyon (CID) yönteminin öncül iyonların (MS1) parçalanmasının etkinliği üzerindeki etkisi. Farklı lipid sınıflarına ait ticari lipid standartları Tablo 1'deverilmiştir. MS için amonyum formatı (AmF) veya amonyum asetat (AmAc) mobil faz katkısı varlığında ESI (-) veya ESI (+) iyonizasyon modu kullanıldı. MS2 ürünlerine parçalanan MS1 lipid iyonlarının yüzdesi, üç teknik kopyadan ortalama bir değer olarak gösterilmiştir. Her lipid için iyonizasyon yüzdesi MS2 pik bölgesine göre hesaplandı. Parçalanan MS1 lipid iyonlarının en yüksek yüzdesinin değeri her lipid için kalın olarak görüntülenir (Tablo 8'desunulan verilerle karşılaştırın). MS2 ürün iyon oluşumunun verimliliği en yüksek ise bu değer en yüksektir. Kısaltmalar: CL = kardiyolipin; FFA = serbest (estersiz) yağ asidi; PC = fosfatidilkolin; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidilgliserin; PHC = fitoseramid; PHS = fitosfingosin; PI = fosfatidillinositol; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserin.
| Lipid standardı | ESI modu | Amf | Amac |
| PHC | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Sayfa | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Etiket | + | 91.4 | 84.9 |
Tablo 8: Yüksek enerjili çarpışma dissosiyasyonu (HCD) yönteminin öncül iyonların (MS1) parçalanmasının etkinliği üzerindeki etkisi. Farklı lipid sınıflarına ait ticari lipid standartları Tablo 1'deverilmiştir. MS için amonyum formatı (AmF) veya amonyum asetat (AmAc) mobil faz katkısı varlığında ESI (-) veya ESI (+) iyonizasyon modu kullanıldı. MS2 ürünlerine parçalanan MS1 lipid iyonlarının yüzdesi, üç teknik kopyadan ortalama bir değer olarak gösterilmiştir. Her lipid için iyonizasyon yüzdesi MS2 pik bölgesine göre hesaplandı. Parçalanan MS1 lipid iyonlarının en yüksek yüzdesinin değeri her lipid için kalın olarak görüntülenir (Tablo 7'desunulan verilerle karşılaştırın). MS2 ürün iyon oluşumunun verimliliği en yüksek ise bu değer en yüksektir. Diğer kısaltmalar: CL = cardiolipin; FFA = serbest (estersiz) yağ asidi; PC = fosfatidilkolin; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidilgliserin; PHC = fitoseramid; PHS = fitosfingosin; PI = fosfatidillinositol; PS = fosfatidilserin; TAG = triasilgliserin.
Ek Tablo 1: LC-MS/MS yöntemimiz yardımıyla S. cerevisiae hücrelerinde tanımlanan ve ölçülen 10 farklı lipid sınıfının moleküler türlerinin listesi. Bu lipid sınıfları arasında serbest (estersiz) yağ asitleri (FFA), kardiyolipin (CL), fitoseramid (PHC), fitosfingosin (PHS), fosfatidilkolin (PC), fosfatidilkolin phatidyletanolamine (PE), fosfatidilgliserin (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserin (PS), ve triasilgliserin (TAG). S. cerevisiae hücreleri başlangıçta % 2 glikoz içeren sentetik minimal YNB ortamda kültürlendi. Çıkarılan lipidlerin lipid ekstraksiyonu ve LC-MS/MS analizi için maya hücrelerinin aliquots gün 1, 2, 3, 4, 6, 8 ve 10 kültür kurtarıldı. Farklı kültür günlerinde kurtarılan maya hücrelerinde tanımlanan her lipid sınıfının tüm lipid türleri gösterilmiştir. Bu lipit türlerinin bazıları sadece 1-4 gün içinde kurtarılan kronolojik olarak genç maya hücrelerinde, diğerleri ise sadece 6-10 gün içinde kurtarılan kronolojik olarak eski maya hücrelerinde, bazıları ise hem kronolojik olarak genç hem de yaşlı maya hücrelerinde mevcuttu. Belirli bir gün saptanan her lipid sınıfındaki her lipid türü için en yüksek MS pik alanı gösterilmiştir. Bu lipid sınıfındaki diğer türlerin sayısallaştırılmasında kullanılan farklı lipid sınıflarının lipid standartları kırmızı renkte gösterilmiştir. Hesaplanan m/z değerleri lipidlerin adducts içindir. Kısaltma: ESI (-) = MS ESI (-) modu; ESI (+) = MS. Data'nın ESI (+) modu, her biri için üç teknik çoğaltma gerçekleştirilen iki bağımsız denemenin ortalama değerleri olarak sunulur. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için aşağıdaki önlemler önemlidir:
1. Kloroform ve metanol toksiktir. Laboratuvar plastik leri ve cildiniz de dahil olmak üzere yüzeylerden çeşitli maddeleri verimli bir şekilde ayıklar. Bu nedenle, kloroform ve / veya metanol ile temas içeren adımlarda plastik kullanımını kaçınarak dikkatli bu organik çözücüler ele, bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanarak, ve kullanmadan önce kloroform ve metanol ile bu pipetler durulama.
2. Metanol/kloroform (17:1) karışımı ile lipid ekstraksiyonu sırasında, alt organik fazı (~400 μL) politetrafloroetilen kaplı kapaklı 15 mL yüksek mukavemetli cam vida üst santrifüj tüpüne aktarmak için borosilikat cam pipet kullanın. Bu transfer sırasında cam boncukları veya üst sulu fazı bozmayın. Azot gazı akışı altında alt organik faz tutun.
3. LC-MS/MS için numune hazırlama sırasında, şişeleri bir kuyu plakasına takmadan önce cam şişelerde bulunan tüm hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak önemlidir.
4. LC tarafından lipid ayırmadan önce a ve b mobil fazlarda amonyum formatı ve amonyum asetat tam bir solubilizasyon elde etmek için, mobil faz ile çözelti karıştırma ve 20 dakika sonicating önce nano saf su 500 μL her tuz eritin.
5. Solvent buharlaşmasından sonra oluşan lipid filmini çalışmadan önce uzun süre saklamayın. Bu filmi asetonitile/2-propanol/nano-saf su (65:35:5) karışımında eritmeden ve lipitleri LC-MS/MS'e maruz klaştırmadan önce -80 °C'de bir haftadan fazla saklamalıyız.
Burada açıklanan LC-MS/MS yöntemi, maya nın veya başka bir ökaryotik organizmanın hücresel lipidomunu oluşturan birçok lipid türünün nicel bir değerlendirmesi için çok yönlü, sağlam ve hassas bir tekniktir. Bu yöntem, farklı izobarik veya izzosik lipid türlerinin tanımlanmasını ve ölçülmesini sağlar, lipid iyonizasyonunu teşvik etmek ve lipid tanımlama ve nicelleştirmeyi daha verimli hale getirmek için ESI MS için alternatif mobil faz katkılarını kullanmanızı sağlar ve MS1 lipid iyonlarının parçalanması veya aktivasyonu için hem HCD hem de CID yöntemlerini kullanabilir.
Biz tomurcuklanan maya S. cerevisiaekronolojik yaşlanma sırasında hücresel ve organeller lipidomlarda yaşa bağlı değişiklikleri incelemek için bu LC-MS / MS yöntemini kullanın. Ayrıca, yaşlanmayı geciktiren genetik, diyet ve farmakolojik müdahalelerin tüm S. cerevisiae hücresinin ve çeşitli organellerinin lipid bileşimini ne kadar etkilediğini araştırmak için de bu yöntemi kullanırız. Çok yönlülüğü, sağlamlığı ve duyarlılığı nedeniyle bu LC-MS/MS yöntemi, ökaryotik organizmalarda hücresel ve organeller lipidomların kantitatif değerlendirilmesi için başarıyla kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine görüşmeler için müteşekkiriz. Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi ve Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi'ni (her ikisi de Concordia Üniversitesi'nde) olağanüstü hizmetler için kabul ediyoruz. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN 2014-04482) ve Concordia Üniversitesi Başkanlık Fonu (CC0113) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Liyakat Ödülü ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
