Summary
Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.
Abstract
Burada, teknolo-gies dizilimi, terapötik hedef analizleri ve hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) kullanılarak ilaç yanıt takibini birleştiren hedefli tedavilerin etkinliğini test etmek için bütünleştirici bir yaklaşım salıyoruz. Bu strateji örnek olarak yumurtalık tümörleri kullanılarak doğrulandı. Yapısal değişiklikleri tanımlamak ve potansiyel olarak hedeflenebilir değişikliklerin analizini takip etmek için çift çifti yeni nesil sıralama (mPseq) protokolü kullanılmıştır. İmmün azılmış farelerde yetişen insan tümörleri genomik analizlere dayalı olarak seçilen ilaçlarla tedavi edildi. Sonuçlar, PDX modelinde öngörülen ve gözlenen yanıtlar arasında iyi bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Sunulan yaklaşım kombinasyon tedavilerinin etkinliğini test etmek ve tekrarlayan kanserli hastalar için kişiselleştirilmiş tedaviye yardımcı olmak için kullanılabilir, özellikle standart tedavinin başarısız olduğu ve etiket dışı ilaçların kullanılmasına ihtiyaç duyulduğu durumlarda.
Introduction
Hasta tümör parçalarının immünoeksik farelere implantasyonundan elde edilen hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs), kişiselleştirilmiş anti-kanser bakımına yardımcı olmak için güçlü bir preklinik model olarak ortaya çıkmıştır. PDX modelleri çeşitli insan maligniteleri için başarıyla geliştirilmiştir. Bu meme ve yumurtalık kanserleri dahil, malign melanom, kolorektal kanser, pankreas adenokarsinom, ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri1,2,3,4,5. Tümör dokusu ortonik veya heterotopik olarak implante edilebilir. Eski, daha doğru ama teknik olarak zor olarak kabul, tümör kökenli organa doğrudan nakli içerir. Modellerin Bu tür tam tümör için "doğal' mikroenvironment nedeniyle orijinal tümörün histoloji taklit inanılmaktadır6,7. Örneğin, fare over bursa içine ortotopik transplantasyon periton boşluğuna tümör yayılması ve asit üretimi ile sonuçlandı, yumurtalık kanseri tipik8. Benzer şekilde, karın meme bezi yerine torasik içine meme tümörlerinin enjeksiyonu PDX başarı oranı ve davranış ını etkiledi9. Ancak, ortotopik modeller tümör büyümesini izlemek için gelişmiş görüntüleme sistemleri gerektirir. Solid tümörün heterotopik implantasyonu genellikle tümör büyümesinin daha kolay izlenmesine olanak sağlayan ve daha az pahalı ve zaman alıcı bir farenin deri altı kanadına doku implante edilerek yapılır7. Ancak, subkutan olarak yetiştirilen tümörler ortotopik implantasyon durumunda gözlenenden farklı olarak nadiren metastaz10.
Engraftment başarı oranı ve büyük ölçüde tümör tipine bağlı olarak değişmektedir gösterilmiştir. Daha agresif tümörler ve tümör hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi içeren doku örnekleri daha iyi başarı oranlarıolduğu bildirilmiştir 12,13. Bununla tutarlı olarak metastatik bölgelerden elde edilen tümörlerin %50-80 frekanslarda engraft olduğu, primer bölgelerden engraft olanların ise %1412gibi düşük frekanslarda engraft olduğu gösterilmiştir. Buna karşılık, nekrotik hücreleri ve daha az canlı tümör hücreleri içeren doku kötü engraft. Tümör büyümesi de orijinal tümörün özelliklerinden ödün vermeden fareler içine enjeksiyon sırasında doku karışımı içine bazal membran matris proteinlerin eklenmesi ile teşvik edilebilir14. İmplantasyon için tasarlanmış doku parçalarının büyüklüğü ve sayısının da engraftment başarı oranını etkilediği bulunmuştur. Sub-renal kapsülün orijinal tümör stromasını koruyabilmesi ve konak stromal hücrelerinin yanı sıra15'inisağlayabileceği nden dolayı subkutan implantasyona göre alt renal kapsülde implantasyon için daha fazla tümör alma oranları bildirilmiştir.
Çoğu çalışmada NOD / SCID immüneksikedici fareler kullanın, hangi doğal öldürücü hücreleri eksikliği16 ve tümör engraftment artırmak için gösterilmiştir, büyüme ve metastaz diğer suşları ile karşılaştırıldığında14. Ancak, 13 yaş13'ün3-4 aylık kadar erken bir döneminde timik lenfomalar gelişebileceğinden ek izleme gereklidir. SCID farelerde yetiştirilen yumurtalık tümör naklinde, B hücrelerinin büyümesi ritukimab tarafından başarılı bir şekilde inhibe edildi, lenfomaların gelişimini engelledi ama yumurtalık tümörlerinin engraftment etkilemeden17.
Daha yakın zamanda, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) fareler, interlökin 2 reseptör gama zinciri18kodlayan gende null mutasyon taşıyan, PDX modellerinin üretimi için sık kullanılan bir suş haline geldi. Farelerin gelecek nesillere geçişkurulan PDX modellerinden tümörler 3 ila 6 nesil19,,20için histolojik ve moleküler özellikleri korumak için bildirilmiştir. Çok sayıda çalışma, PDX modellerinde tedavi sonuçlarının karşılık gelen hastaların2,3,4,,21,22,23olanları taklit ettiğini göstermiştir. Küçük olmayan akciğer kanseri ve kolorektal karsinomlar için PDX modellerinde kemoterapi yanıt oranı aynı ilaçlar için klinik çalışmalarda benzerdi24,25. Klinik çalışmalara kayıtlı hastalar için geliştirilen PDX modellerinde yapılan çalışmalarda, ilgili hastalarda klinik olarak gözlenen ilaçlara benzer test edilen ilaçlara verilen yanıtlar gösterilmiştir2,3,4.
PDX modelleri ile birlikte bir hasta tümörün yüksek-iş letme genomik analizleri, spesifik genomik değişiklikler ve terapötik yanıt arasındaki korelasyonları incelemek için güçlü bir araç sağlar. Bu birkaç yayınlar26,27açıklanmıştır. Örneğin, EGFR amplifikasyon taşıyan kolorektal PDX modelleri bir dizi EGFR inhibitörü cetuximab terapötik yanıtlar, hastalarda cetuximab paralel klinik yanıtlar28.
PDX modellerinin geliştirilmesi ve uygulanmasıile ilgili birkaç zorluk vardır. Bunlar arasında tümör heterojenite29,30 bir PDX içinde yüksek proliferatif kapasiteye sahip tek bir hücre klonu olarak tedavi yanıtı yorumlanmasının doğruluğunu tehlikeye atabilir diğer olanlar büyüyebilir31, böylece heterojenlik kaybına neden. Ayrıca, tek tümör biyopsileri PDX geliştirmek için kullanıldığında, hücre popülasyonlarının bazıları gözden kaçırılabilir ve son greftte temsil edilmez. Bu sorunu çözmek için implantasyon için aynı tümörden birden fazla örnek önerilir. PDX tümörleri orijinal donör tümörün tüm hücre tiplerini içerme eğiliminde olmasına rağmen, bu hücreler yavaş yavaş murine kökenli olanlar tarafından ikame edilir3. PDX modellerinde murine stroma ve insan tümör hücreleri arasındaki etkileşim iyi anlaşılamamıştır. Bununla birlikte, stromal hücrelerin tümör mikroçevresini recapitulate gösterilmiştir33.
Bu sınırlamalara rağmen, PDX modelleri çeviriaraştırma nın yanı sıra hasta tedavilerini seçmek için kişiselleştirilmiş tıp için en değerli araçlar arasında yer almıştır. PDX'lerin başlıca uygulamaları arasında biyomarker keşfi ve uyuşturucu testi sayılabilir. PDX modelleri de başarıyla ilaç direnci mekanizmaları çalışma ve ilaç direnci34,35üstesinden gelmek için stratejiler belirlemek için kullanılır. Bu el yazmasında açıklanan yaklaşım, araştırmacının insan tümörlerinde potansiyel terapötik hedefleri belirlemesine ve başlangıçta genomik olarak karakterize edilmiş engreftli tümörleri barındıran farelerde in vivoile ilgili ilaçların etkinliğini değerlendirmesine olanak sağlamaktadır. Protokol intraperitoneal engrafted yumurtalık tümörleri kullanır ama farelerde büyümek için yeterince agresif tümör her türlü uygulanabilir2,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mayo Clinic Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan bir protokole göre yumurtalık kanseri olan hastaların taze dokuları debulking cerrahisi sırasında toplandı. Bu protokolde kullanılan tüm hayvan prosedürleri ve tedavileri Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve hayvan bakım yönergelerine uyulmaktadır.
1. Mate çifti sıralama ve analizleri
NOT: Mate çifti (mPseq) dizilimi için taze veya flaş dondurulmuş doku kullanılmalıdır. Parafin gömülü malzeme parçalanmış DNA içerdiğinden uygun değildir.
- Donmuş tümör dokusundan DNA'yı ayırın. Cerrahi malzeme veya biyopsi elde edilen orijinal insan örneği kullanın36.
- 1000 ng DNA kullanarak milletvekillerinin kitaplıklarını ve dizilimi yeni nesil sıralayıcıda şerit başına 2 örnek olarak kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu)36.
- Daha önce açıklandığı gibi büyük kromozom sapmaları (silme, eklemeler, amplifikasyonlar, inversions ve translocations) algılamak için algoritmalar kümesi kullanarak veri analiz edin36,37.
2. Terapötik hedeflerin seçimi
- Hedeflenebilir değişiklikleri (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda) belirlemek için açık erişimpanda aracını (Pathway and Ek Açıklama) veya benzer bir aracı kullanın.
- Standart kabul edilen gen sembollerini kullanarak, MSeq tarafından değiştirilmiş olarak tanımlanan genlerin bir listesini yapın, basit bir sekme-sınırlandırılmış dosya olarak.
NOT: Dahil edilen örnek, amplifikasyonların ve kazanımların analizini içeriyor. - Tablo üstbilginin yazılımın yol düzeyi görünümüne aktarıldığından emin olmak için listenin üstbilgi satırına bir "#" işareti ekleyin.
- Yükleme Ek Açıklama Seti gezinti sekmesini tıklatarak dosyayı yükleyin.
- Menüden tek bir simge atayın ve tercih edilen simgeye tıklayıp Finalize sekmesini tıklatarak temel verileri temsil edin.
- Ek açıklama dosyaları yüklendikten sonra, yol başına açıklamalı gen sayısını görüntüleyen bir sütun tanımlayın. Bu sağdaki son sütun.
- İlgi genleri içeren yolları göstermek için ana pencerenin sol üst kısmındaki Pathway Filtresi'ni kullanın.
- Şans eseri beklenenden daha fazla açıklamalı gene sahip yolları belirleyin. Zenginleştirme sekmesi altında bulunan işlevi kullanın.
- Ana pencerenin solundaki uygun simgeyi (örneğin, DGIdb, PharmGKB) kontrol ederek Önceden Ayarlanmış Ek Açıklama'dan potansiyel olarak ilaçlandırılabilir genleri görüntülemek için bir veritabanı seçin.
- Pathway Viewer sayfasında görüntülenen adını tıklayarak görselleştirme yolunu seçin.
NOT: Her ek açıklama kümesini temsil eden simgeler ilişkili genin yanında gösterilir. İlgili GeneCards web sayfasını açmak için ilgi genine tıklayın. - İlgi lengenleri gösteren yolları (örneğin, belirli bir tümörde değiştirilmiş) ve daha fazla analiz için potansiyel ilaçlar için "vuruşlar" seçin.
- Standart kabul edilen gen sembollerini kullanarak, MSeq tarafından değiştirilmiş olarak tanımlanan genlerin bir listesini yapın, basit bir sekme-sınırlandırılmış dosya olarak.
- Tanımlanan hedefler arasında çapraz referans sağlamak için klinik uygulama (https://clinicaltrials.gov/) için onaylanmış ilaçlar içeren bir veritabanı kullanın.
- Belirli bir tümör türünün biyolojisi ile alaka düzeyini doğrulamak için bir literatür incelemesi (örneğin, PubMed) yaparak PDX modellerinde daha fazla test için hedeflenebilir değişikliklere öncelik verin.
3. PCR ve Sanger dizilimi ile genomik yeniden düzenlemelerin doğrulanması
- Sıralama okumalarını kullanarak tasarım astarları, mPseq verilerinden elde edilen.
- Milletvekilleri analizlerine dayalı doğrulama (yani potansiyel terapötik hedef) için bir ilgi kavşağı seçin.
- Tasarım astarları, amplicon'un kavşağı içerebilen yöne doğru. Kavşağın her iki tarafında toplam 4 astar tasarlar, kavşağı n için güçlendirme şansını artırın.
NOT: Olguya ve kromozom yerine göre astar adı. - Astar tasarımı ve tercih edilen bir yazılım için standart PCR parametrelerini kullanın. Erime sıcaklığını (60-62 °C) ve GC içeriğini (%40-60) seçin. Astar dizisinin astar dimer, palindrom veya saç tokası döngüleri oluşturmadığından emin olun.
- Astar dizisiblat (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) kullanarak kontrol ederek insan genomunun diğer alanlarına homoloji yoksun olduğunu onaylayın.
- İlgi kavşağını yükseltmek için bir PCR çalıştırın.
- Astarları 10 mM'ye kadar sulandırın ve her bir astarın 10 mL'sini birleştirin, böylece her ileri astar her bir ters astarla bir astar karışımına dönüşür.
NOT: Seçili örnek için astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir. - Etiket 0.2 mL şerit tüpleri gibi: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 ve T4 c= kontrol insan genomik DNA (ticari), T = Tümör DNA, hasta veya PDX tümör izole ve sayı astar karışımı gösterir.
- Etiketli tüplere her astar karışımından 1 mL ekleyin.
- Tablo 2'delistelenen reaktifleri birleştirerek Taq mastermixini hazırlayın, enzimi gerekene kadar dondurucuda bırakarak, en sonunda karışıma ekleyerek.
- 2 ana karışımları, her şablon DNA için bir, kontrol insan DNA ve tümör DNA olun. Her Taq ana karışımından 24 mL'lik kısmını kendi şerit tüpüne ekleyin. Toplam reaksiyon hacmi 25 mL'dir. Girdap çok kısa bir süre ve sonra aşağı şerit tüp spin.
- Bir termocycler bir PCR çalıştırın. Tablo 3'te gösterilen parametreleri kullanın. Tavlama sıcaklığını, astarların erime sıcaklığından en az 1 °C daha soğuk olacak şekilde ayarlayın.
- Tamamlanan PCR ürünlerini -20 °C (uzun süreli) veya 4 °C 'de (kısa vadede) gerektiğinde buzdolabında saklayın.
- PCR ürününü %1,5 agarose jel kullanarak görselleştirmek için 1-5 V/cm'de elektroforez yapın. Sanger sıralama için kullanılacak ürünün 2 mL aliquot bırakın.
- Astarları 10 mM'ye kadar sulandırın ve her bir astarın 10 mL'sini birleştirin, böylece her ileri astar her bir ters astarla bir astar karışımına dönüşür.
- Kavşağı onaylamak ve38'intam kırılma noktasını belirlemek için Sanger sıralamasını gerçekleştirin.
- PCR tek bir ürün (bant) oluşturduysa PCR ürünlerini kullanın. Alternatif olarak, jel dışında bant kesmek, arındırmak ve amplifikasyon için kullanılan astar ile birlikte Sanger sıralama için gönderin.
NOT: Genomik analizlerin yapıldığı tümörler farelere implantasyon için kullanılır.
- PCR tek bir ürün (bant) oluşturduysa PCR ürünlerini kullanın. Alternatif olarak, jel dışında bant kesmek, arındırmak ve amplifikasyon için kullanılan astar ile birlikte Sanger sıralama için gönderin.
4. Tümör engraftment ve bakım
- PDX fare modelleri içine tümörleri engraft için hazırlıklar ayarlayın. Genomik analizlerin yapılacağı veya yapılacağı engreftment tümörleri için seçin.
- Özel laboratuvar ve hayvan tesisleri, kalifiye teknik personel ve ayrıntılı standart işletim prosedürleri de dahil olmak üzere herhangi bir PDX modelinin geliştirilmesinin başlangıcında destekleyici bir altyapının mevcut olduğundan emin olun.
- Numunelerin hızlı bir şekilde taşınmasını ve işlenmesini, hücre canlılığı ve başarılı engraftment için çok önemlidir.
- Numunelerin işlenmesi ve engrafting için bakteriyel ve mantar kontaminasyonunu azaltmak için steril bir ortam kullanın.
- Kan yoluyla bulaşan patojenleri barındırabileceğiiçin, insan örneklerini potansiyel olarak biyolojik olarak tehlikeli maddelere ilişkin kurumsal politikalara uygun olarak dikkatli bir şekilde ele alın.
- Doku kültürünün 20 mL'lik ortamı ile önceden soğutulmuş 50 mL tüpiçine yerleştirerek engraftment için dokuyu (0.5-0.7 cm3) hazırlayın.
NOT: Tümör dokusu taze olabilir veya daha önce kriyosayrılmış malzemeden kurtarılabilir5. - Bir patoloğa danışarak numunedeki tümör içeriğini doğrulayın.
- Tümör dokusunu 10-15 mL soğuk PBS içeren bir tabağa veya RPMI 1640 veya DMEM gibi antibiyotik içeren doku kültürü ortamına yerleştirin (%1 penisilin ve streptomisin).
- Bir patolog yardımıyla komşu normal ve nekrotik dokudan canlı tümör materyalini belirleyin ve izole edin. Bir patolog tarafından işaret nekrotik malzeme kaldırmak için steril çerte ve neşter kullanın.
NOT: Tümör farelere intraperitoneal veya subkutan olarak yerleştirilmesi olabilir. İntraperitoneal implantasyon yapmak için 4.2 adımLarını takip edin veya subkutan engreftasyon yapmak için adım 4.3'e atlayın. Bu çalışmada, genomik analizlere dayalı olarak seçilen hedefli tedaviler, intraperitoneal implantasyon ile yüksek dereceli seröz over kanseri için bir dizi PDX modelinde test edilmiştir.
- Yaklaşık 1-1,5 mm3 boyutunda parçalar yapmak ve soğuk kültür ortamı ile karıştırmak için steril forseps ve buz üzerinde bir neşter ile doku kıyma intraperitoneal (IP) implantasyon için doku hazırlayın. 16-17 ölçü iğnesi kullanarak 0.3-0.5 mL tümör bulamacı enjekte edin.
NOT: Tüm cerrahi işlemler aseptik teknikler kullanılarak yapılmaktadır. Enfeksiyon olasılığını azaltmak için steril eldivenler, steril aletler, sarf malzemeleri ve implante edilmiş malzemeler kullanıldı.- 1:1'i buz gibi kültür ortamıyla karıştırın ve en az üç dişi SCID fareye 100 mL intraperitoneally enjekte edin.
- Steril forseps, neşter veya cerrahi makas kullanarak deri altı engraftment için tümör dokusunu küçük parçalar halinde, kabaca 2 x 2 x 2 mm boyutunda kesin ve parçalanmış dokuları buz üzerinde önceden soğutulmuş petri kabına aktarın.
- Parçalanmış doku (10 doku parçası başına yaklaşık 200 mL) ile çanağa soğuk baza membran matrisekleyin, iyi karıştırın ve doku parçaları 10 dakika boyunca soğuk bodrum membran matris emmek sağlar.
- Engraftment için hazırlamak için 5 kadın NOD / SCID fareler anestezik.
- Her fareye intraperitoneal ketamin (150 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) kombinasyonu enjekte edin.
- Farenin, kuyruk ucunu travmatik forceplerle sıkıştırarak düzgün bir şekilde anestezi yediğini doğrulayın.
- Odadan yavaşça tamamen anestezili fareyi çıkarın ve buharlaştırıcıdan giriş yapan ve atık gaz atma sisteminden çıkan bir burun konisi fareye koyun.
- Anestezi altında kuruluk önlemek için fare gözlerine veteriner merhemkoyun. Ameliyatın yapılacağı bölgeyi hazırlayın. Ameliyatı gerçekleştirmek için aseptik tekniği kullanın.
- Ameliyatın yapılacak yüzeyin gözeneksiz, kapalı ve ameliyattan önce dezenfekte edildiğinden emin olun.
- Steril (otoklav, gaz veya kimyasal sterilizasyon ile) aletlerle ameliyata başlayın.
- Aletleri işlemek ve ameliyat adımları arasında etanol batırarak işlem boyunca alet uçlarının sterilitesini korumak için eldivenkullanın.
- 3 alternatif iyot ve alkol önlüğü uygulayarak cerrahi bölgeyi sterilize edin. Bir farenin her iki yan tarafında 5-10 mm dikey deri kesiyapmak için steril cerrahi makas ve forseps kullanın.
- Bir tümör parçası yağ yastığı nın altına yerleştirilecek kadar büyük bir cep oluşturmak için deri altı boşluğa yavaşça düz forseps yerleştirin.
- 5 farenin her birinde daha önce hazırlanmış cebine tümör parçaları yerleştirmek için steril düz forceps kullanın.
NOT: Bir cebine 3-4 adet tümör dokusu yerleştirin. - Doku tutkal kullanarak deri kesilerini kapatın.
- İntraperitoneally lenfosit proliferasyonunu inhibe etmek için implantasyon sonrası rituximab 100 mL ile her fare enjekte.
- Anestezi kurtarılana kadar yaklaşık 20 dakika boyunca bir ısı lambası altında bir kafesiçine fare yerleştirin. Farenin hayati belirtilerini izleyin ve yeterli hidrasyon sağlamak.
- O anestezi kurtarıldı ve yiyecek ve su başladıktan sonra diğer farelerin şirket için fare dönün. Kurumsal yönergelere göre ameliyat sonrası bakım ve izleme sağlamak. Ameliyattan sonra 3 gün üst üste ağrı ve sıkıntı belirtileri olup yok.
NOT: Ağrı veya sıkıntı kriterleri arasında nekroz veya ülserasyon, kilo kaybı/vücut durumu puanlaması, aktivite düzeyi, motor fonksiyon ve duruş gibi davranışsal belirtiler sayılabilir. - Tümörler bir kaliper ile ölçülen çapı 0,5 cm boyutuna ulaşana kadar rutin olarak tümör oluşumu için iki haftada bir fareler kontrol edin.
- Her farenin sağlık puanını görünüm, davranış ve vücut durumundan türetilmiş olarak değerlendirin39. Karbondioksit teneffüs edilerek kurban edilecek moribund fareler için kriter olarak ≤6 puanlarını kullanın.
5. PDX modellerinde genomik olarak tanımlanmış hedeflere verilen yanıtların test edilmesi
- Tümörler hissedilir olduğunda seçilen hedefli tedavilere başlayın ve ultrason taraması ile ölçülen 0.5 cm3'e ulaşın.
- Karın ultrason tarama gerçekleştirmeden önce fare karın kürk çıkarın ve steril jöle yağı uygulayın.
- Kesitte konumlandırılmış tümör ile görüntü elde etmek için bir transdüser ile bir ultrason makinesi kullanın. Her hayvan için seans başına 3 ölçüm yapın ve tümör boyutunun daha doğru bir şekilde değerlendirilmesi için ortalama değeri yapın.
- Mevcut yazılım40kullanarak görüntüleri analiz edin.
- Toplam tedavi süresi 4-6 hafta boyunca haftada bir kez 51 mg/kg'da karboplatin ve 15 mg/kg intraperitoneal (IP) oranında paklitaksel karışımından oluşan kemoterapi uygulayın. Enjeksiyon için toplam hacmin 0,2 mL'yi geçmediğinden emin olun.
- %30 siklodekstrin (örneğin, Captisol) bir MK-220641 stok çözeltisi yapın ve 4 hafta boyunca günde 120 mg/kg oral gavaj ile teslim edin.
- Farenin başını ve uzuvlarını hareketsiz hale getirerek fareyi arkadaki deriyi çimdikleyerek ve geriye sabitleyerek oral gavaj için hazırlayın.
- Gavaj sondasını farenin boğazının arkasına, sonda yemek borusuna ulaşana kadar yerleştirin. Sondanın çok uzağa yerleştirilemediğinden emin olun, farenin akciğerleri delik açarak ölüme neden olabilir.
- 25 mg/mL'de etanolde MK-866942 stok çözeltisi yapın. %5.2 Ara 80, %5.2 PEG400 içeren bir araçta ip enjeksiyonları için steril suda 10 mg/kg'da haftada 5 gün seyreltin ve toplam 4 haftalık tedavi süresi ile seyreltin.
NOT: Farelere enjekte edilen hacim, hayvanın ağırlığına bağlı olarak 50-120 mL olmalıdır. - 43,44farklılıkları tespit etmek için yeterli43istatistiksel güce sahip olmak için tedavi grubu başına 7-8 fare kullanın.
- Günlük tedavide farelerin vücut ağırlığını ve genel durumunu değerlendirin. Bir hayvanın kilosu ilk kilosundan %20 veya daha fazla düşerse ilaçları saklar.
- Ultrason taraması kullanarak haftalık tümör boyutunu değerlendirin. Tümör büyümesini izleyen bireyin, yanıtların tarafsız skorlanması ndan emin olmak için tedaviye kör olduğundan emin olun.
NOT: Küçük laboratuvarlarda tedavi ve ultrason takibi için 2 farklı kişi istihdam edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Debulking ameliyatları sırasında rezeke edilen yumurtalık tümörlerinden elde edilen doku IRB rehberliğine uygun olarak toplanmış ve 1) genomik karakterizasyon ve 2) immünazatlı farelerde engreftasyon için kullanılmıştır(Şekil 1). Mate-pair sıralama protokolü36,37 kayıplar, kazançlar ve amplifikasyonlar da dahil olmak üzere DNA yapısal değişiklikleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bir tümördeki (OC101 olarak belirlenmiş) genomik değişikliklerin bir manzarasını gösteren temsili bir genom çizimi Şekil 2'degösterilmiştir. Yüksek dereceli seröz alt tip tümörlerde, genomik instabilitenin yüksek düzeyde olduğunu gösteren çoklu kazanımlar (mavi çizgiler) ve delamalar (kırmızı çizgiler) bulundu, ayrıca kromozomkayıpları ve kazanımlar gözlendi. Yüksek dereceli seröz alt tip tümörlerde ortalama 300-700 değişiklik saptanmaktadır45. Daha sonraki analizlerde, klinik olarak ilgili ilaçlarla potansiyel olarak hedeflenebilir birkaç DNA değişikliği saptır. OC101 tümöründe terapötik girişim için üst sıralarda yer alan değişiklik, ERBB2 'yi içeren kromozom 17'de bir amplifikasyondu(Şekil 2 ve Şekil 3A). ERBB2, RAS/ERK ve PI3K/AKT sinyal yollarını aktive etmek ve hücre büyümesini, hücre göçünü ve invazyonunu teşvik etmek için EGFR, HER3 veya HER4 ile karartma ile bilinen HER2 reseptörünü kodlayan bir gendir. HER2 inhibitörleri (örneğin, monoklonal antikorlar pertuzumab ve trastuzumab) tümörler HER2 proteinaşırı meme kanseri hastalarının tedavisinde etkilidir. Yumurtalık kanseri için anti-HER2 tedavisi, ancak, FDA onaylı değildir.
Donör hastaların tümörünün genomik profilinin(Şekil 1)ilgili PDX modeliyle (gösterilmemiş) karşılaştırılması, orijinal tümörlerin pdx türevlerine moleküler yakınlığını bildiren önceki tüm çalışmalarla tutarlı çarpıcı bir benzerlik ortaya koymuştur.
DNA düzeyinde mPseq sonuçlarını doğrulamak için, ERBB2 geni içeren güçlendirilmiş bölgenin kenarları için çeşitli spesifik astarlar tasarlanmış ve PCR orijinal tümörden izole DNA yanı sıra farelerde birkaç nesiller boyunca yayılan bir tümör kullanılarak yapılmıştır. İki farklı astar seti kullanılarak amplifiye edilmiş ürünlerin temsili jel görüntüsü Şekil 3B'degösterilmiştir. ERBB lokusu amplifikasyonu içermeyen normal havuzlu genomik DNA (C olarak belirlenmiştir) amplifikatörlü olduğunda bant saptanmadı. Jel ve Sanger sıralama (gösterilmez) ürünlerin saflaştırılması daha fazla değişiklik milletvekilleri tarafından öngörülen doğruladı. Daha ileri doğrulama immünoblotting kullanılarak ilgili PDX tümöründe HER2 proteinekspresyonu incelenerek yapılmıştır. Analiz, ERBB2 geninin gözlenen amplifikasyonu ile tutarlı olarak yüksek düzeyde HER2 proteini (sonuç gösterilmez) saptandı.
Farklı bir yumurtalık tümörü (T14 olarak belirlenmiş) DNA'sında çok sayıda bölgesel kazanım gözlendi. Bunlar arasında AKT2 ve RICTOR genleri(Şekil 3C)yer aldı. Her ikisi de, RICTOR'un birlikte olduğu AKT2 ve mTOR inhibitörleri olarak terapötik açıdan büyük ilgi görüyorlardı. Her iki genin de yakınlığını kapsayan bir eş çifti okuması olmadığından, milletvekili tarafından tespit edilen kazancın basit PCR doğrulanması mümkün değildi. Bu nedenle, immünoblotting ile karşılık gelen proteinlerin ifade düzeyini test ettik. Yüksek düzeyde AKT ve RICTOR gözlendi(Şekil 3D)hedeflenen ilaçlarla tedavinin garanti olduğunu düşündürmektedir.
Bu tümörün AKT ve mTOR inhibitörlerine karşı duyarlılığını test etmek için intraperitoneal implante T14 tümörü olan PDX fareler genişletilerek randomize edilerek sadece kemoterapi (karboplatin/paklitaksel) veya pan-AKT inhibitörü MK-220641 veya mTOR inhibitörü MK-866942kemoterapi kombinasyonu alındı. Hedeflenen tedavinin eklenmesinden önce 2 hafta boyunca kombinasyon kolundaki farelere kemoterapi verildi(Şekil 4). Tümör regresyon/büyümesini izlemek için haftalık ultrason ölçümleri yapıldı.
Her tedavi kolu en az 7 fare içeriyordu. Bu sayı, çalışmanın maliyetlerini önemli ölçüde daha düşük bir seviyede tutarken, gruplar arasındaki yanıt farklılıklarını gözlemlemek için yeterliydi. Tümör büyüme hızındaki bireysel değişimler ihmal edilebilir ve büyüme diğer kollarda tedavinin başladığı tümör boyutuna normalleştiğinden, tedavi edilmeyen kontrol grubunda daha az fare (üç ila dört) kullanılabilir.
Gözlemin ilk 3 haftasında kemoterapi gören ve tedavi edilmeyen gruplar arasında fark gözlenmedi (gösterilmedi). 6. hafta sonuna kadar kemoterapi tedavisi yapılan grupta tümör yükünün önemli ölçüde azaldığı (%58 median) gözlendi. Tek başına kemoterapiye göre ekstra bir fayda, kemoterapinin hedeflenen tedaviler ile bir arada yer aldığı gruplarda gözlendi. Aradaki fark, sırasıyla MK-8669(Şekil 4A)ve MK-2206(Şekil 4B)için 4.
7. haftada tedavi nin sonunda tedavi yanıtının moleküler analizleri için hayvanlar ötenazi yapıldı ve tümör dokusu toplandı. Bu amaçla toplam ve fosforlu S6 kilaz(Şekil 5A,B),AKT ve mTOR (Şekil 5C,D) miktarları immünolotlama kullanılarak belirlendi. Ribozomal protein S6 kiazaz AKT-mTOR yolunun bir downstream haberci, yukarı düzenlenmiş olduğu bilinen ve hücre sağkalım ve büyüme teşvik etmek için büyüme faktörleri tarafından AKT-mTOR ekseninin uyarılması üzerine fosforile. Tedavi edilmeyen veya kemoterapi PDX tümörleri ile tedavi edilen bu proteinlerin düzeylerinin AKT veya mTOR inhibitörleri alan farelerle karşılaştırılması, hedeflenen tedavinin moleküler düzeyde etkinliğini gösteren son iki proteinde belirgin bir azalma(Şekil 5)göstermiştir. Tedavi alayı ayarlamaları, bildiğim kadarıyla kombine ilaçlar ve tedavi süresi için uygulama zamanlaması olarak, yapılmalıve daha iyi tepkiler elde etmek için test edilsin.
| Astar Adı | Sıra | Astar Karışımı | Astarlar birleştirildi | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 ve R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 ve R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 ve R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 ve R2 | ||
Tablo 1: OC101kromozom 17 değişikliğinin doğrulanmasında kullanılan astarlar.
| Reaktif | 1 reaksiyon için eklenecek miktar (3L) | 4 reaksiyon (μL) için eklenecek miktar. [Her astar karışımı için yeterli yapmak için 4,3 ile çarpın (4)] |
| Nükleaziçermeyen su | 20.45 | 89.94 |
| 10x arabellek (Kolay A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Şablon DNA (konsantrasyon >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Takpolimeraz | 0.25 | 1.08 |
Tablo 2: Bir kavşağı doğrulamak için PCR kurulumu.
| Geçici Sıcaklık (C) | Saat | |
| 94 | 5 dk | |
| 94 | 40 s | 35 döngü |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 dk | |
| 72 | 5 dk | |
| 4 | Tutun |
Tablo 3: PCR'nin bir kavşağı doğrulayabilmek için bisiklet koşulları.
Şekil 1: Seröz yumurtalık karsinomu için PDX modelleri kullanılarak genomik güdümlü tedavi testi stratejisinin şematik gösterimi. Yumurtalık tümöründe H&E boyama (üst) gösterilmiştir. Ölçek çubuğu=100 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: MPseq kullanılarak yumurtalık tümörlerinin genomik karakterizasyonu. Yapısal değişikliklerin manzarasını gösteren genom çizimi ve milletvekili tarafından tespit edilen kopya numarası değişiklikleri. X ekseni kromozom konum numarası gösterilen kromozomuzuna yayılır. Her kromozom sağ ve sol Y ekseninde gösterilir. Her kromozom için yatay izlerin yüksekliği, 30k baz çifti pencereleriçin algılanan okuma sayısını gösterir. DNA kopya numaraları renkle gösterilir, gri normal 2N kopya durumunu temsil eden, kırmızı silme ve mavi-kazançlar karşılık gelen. Siyah çizgilerin bağlanması kromozom altonal yeniden düzenlemelere karşılık gelir. ERBB2 locus'taki değişiklikler gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hedeflenebilir değişikliklerin seçimi ve bunların doğrulanması. (A) Şekil 1'de gösterilen genom çiziminin yakın çekim bir bölümü, kromozom 17 (mavi) üzerinde ERBB2 geninin yükseltilmesinin gösterildiği nigösterir. Kromozom sayıları belirtildiği gibidir. (B) ERBB2 locus'taki kırılma noktalarının pcr amplifikasyonu kullanılarak milletvekilleri tarafından tanımlanan doğrulama analizi. C bir havuzgenomik DNA kontrolü, OC101 hasta tümöründen DNA, M bir DNA merdiveni. (C) AKT çekirgede (üstte) ve RICTOR geninde (altta) kazanımlar gösteren başka bir yumurtalık tümörü için genom çiziminin segmentlerinin yakın çekimi (mavi çizgi ile gösterilir). Kromozomlar belirtildiği gibi. (D) PDX'ten (T14) tümör dokusu kullanılarak immünoblot ile AKT/mTOR yolu proteinlerinin ekspresyonunun doğrulama analizi, C. 30 mg toplam protein ve AKT, RICTOR, p-mTOR spesifik antikorlarda genomik değişiklikler kullanıldı. MAPK yükleme kontrolü yaptı. Pos con pozitif kontrol olarak kullanılan bağımsız bir tümördür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek başına kemoterapiye verilen yanıtların karşılaştırılması ve akt2 ve RICTOR genlerinde elde edilen kazanımları barındıran tümörde hedeflenen tedavi ile ilgili ilaçlarla birleştirilmesi. Kemoterapi ve anti-mTOR ilaç MK-8669 bir arada tedavi yanıtları(A) veya pan-AKT MK2206 inhibitörü (B) karşı kemoterapi tek başına. Her tedavi için uygulama süresi ve süresi oklar ile gösterilir. Hacimler tedavinin başlangıcında ilk hacmin yüzdesi olarak ifade edilir ortalama +/- SD. Kemoterapi kemoterapidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İmmünpıhtılaşma analizi ile belirlenen her tedavide ortaya edilen moleküler değişikliklerin karşılaştırılması. (A) AKT-mTOR yolunun alt akım efektörü olan S6 ve fosfo-S6 düzeyleri gösterilmiştir. S6 ve p-S6'ya 30 mg toplam protein ve spesifik antikor kullanıldı. GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. GAPDH düzeyine normalleştirilen protein düzeylerinin nicelleştirilmesi immünoblotlama ile tespit edilen mTOR, p-mTOR, AKT ve p-AKT düzeylerinde(B) (C) olarak gösterilmiştir. GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. (D) Protein düzeylerinin quantifikasyon GAPDH düzeyine normalleştirilmesi. NT tedavi edilmez, kemoterapi kemoterapidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDX modellerinde genomik profilleme ile elde edilen ve test için en iyi ilaç seçimini belirleyen bir "klinik deney" yapmak için kullandığımız yaklaşım ve protokolleri tanımlıyoruz. Birden fazla sıralama platformları şu anda tüm genom dizileme, RNAseq ve özelleştirilmiş gen panelleri de dahil olmak üzere primer tümörlerin genomik karakterizasyonu için kullanılır. Yüksek dereceli seröz over karsinomu için, yapısal değişiklikleri tanımlamak için mPseq, DNA rearrangements ve kopya numarası değişiklikleri, tümör bu tip gözlenen genomik istikrarsızlık yüksek derecede nedeniyle özellikle yararlıdır. MPseq platformunun ikinci avantajı, tüm genomu kapsaması, ancak diğer kapsamlı sıralama teknolojilerinden önemli ölçüde daha düşük olmasıdır. Ancak mpseq, baz kapsamı yeterli olmadığı için nokta mutasyonu tespiti için uygun değildir ve sadece 8-10x'e ulaşır. Bir tümörün genomik karakterizasyonu için tek başına mPseq kullanmanın kısıtlamalarından biri, etkilenen genlerin ekspresyonunu öngörmeyecek karmaşık kümelenmiş kromozom altonisi, analizidir. Milletvekilleri tarafından tespit edilen bir kavşak PCR tarafından DNA doğrulayan bir putatif füzyon geni oluşturmak için öngörülen bir çerçeve kayması veya küçük silme ve eklemeler organizatörü bölgede nedeniyle ifade olmayabilir. Benzer şekilde, potansiyel terapötik hedefler için kromozomal kazanımlar ve amplifikasyonlar ilgi geninin ifade edilmesini sağlamak için RNA veya protein düzeyinde dikkatle değerlendirilmeli ve doğrulanmalıdır.
Tümörün moleküler makyajı farelerde birkaç nesil boyunca yayılımdan sonra büyük ölçüde korunmuş olsa da, zaman içinde tümör evrimini, klonal seçimi veya mindik çevresine adaptif yanıtı yansıtan anahtar genlerin ekspresyon düzeylerinde değişiklikler meydana gelebilir. Bu nedenle hem orijinal donör tümör hem de PDX tümöründe terapötik müdahale amaçlı bir değişikliğin doğrulanması çok önemlidir. PDX modellerinden izole edilen tümör için hem RNA hem de protein, malzeme bol olduğu için ifade düzeyini sorgulamak için kullanılabilir. Her ikisi de orijinal tümörde ifade çapraz kontrol etmek için seçilebilir, kullanılabilirliği ve depolanan dokunun türüne bağlı olarak, ve ilgili protein tespiti için antikor durumu. IN vivo ayarı yan etkilerin izlenmesine olanak sağlar gibi PDX modeli özellikle kombinasyon tedavileri test paha biçilmez, tedavi rejiminde dozaj veya süre ayarlamaları gibi.
Çalışmada ele alınmakta olan özel sorulara bağlı olarak ortotopik ve deri altı engreftleme arasında seçim yapılabilir. Ancak, ksenogreftli tümörlerin terapötiklere duyarlılığının implantasyon bölgesi tarafından modüle edilebilen46. Öte yandan, ortotopik modellerde terapötik yanıt gösteren ancak subkutan implante PDX9'dabulunmayan ilaçların keşfi hakkında henüz bir kanıt bildirilmemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang ve Faye R. Harris, MS üyelerine deneylerin yürütülmesinde yardımcı olan üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Bay ve Bayan Neil E. Eckles'ın Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Için Hediyesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
